狗牙根‘C299’脱水素蛋白Dehydrin-S及其编码基因和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明狗牙根'C299'干旱胁迫响应过程中的一种重要保护蛋白脱水素蛋白 Dehydrin-S及其编码基因和探针，具体涉及一种狗牙根'C299'脱水素蛋白Dehydrin-S及 其编码基因和探针。
【背景技术】
[0002] 狗牙根（Cynodondactylon)是非常重要的暖季型草坪草，为禾本科多年生草本植 物，具有发达的根茎和匍匐茎，生长速度快、再生能力强、成坪快、耐热、耐践踏、质地纤细、 色泽好等优点，在国内外广泛用于运动场、游憩场、公园及固土护坡草坪等。因此是暖季型 草坪草中应用价值最高、应用最广的草种之一，享有暖季型草坪草"当家草种"之称，极具社 会、经济和生态价值。狗牙根的抗旱能力十分强，年蒸散量低于400mm，仅是玉米、小麦等农 作物年需水量的四分之一左右，因此是建植节水草坪的优良材料。在狗牙根中，'C299'属 于观赏性最佳的品种之一，但是其抗旱性较其他品种稍弱，因此提高狗牙根'C299'的耐旱 性，对暖季型草坪草的应用性及观赏性具有非常重要的意义。
[0003] 脱水素（dehydrin)属于LEA-II家族，是植物体内的一种具有高度热稳定性、亲水 性的LEA蛋白（lateembryogensisabundantproteins)，能够在植物胚胎发育后期以及逆 境下大量表达，广泛存在于植物界。它能在植物处于干旱等逆境条件下表达，其在逆境下表 达的强弱与植物抗逆能力有密切联系，在抗性植株中的表达量要高于对逆境敏感的植株。 由此显示，它与植物的抗旱有着密切的关系。我们根据异源克隆的方法从狗牙根'C299'中 用克隆获得相似的脱水素基因，Q-PCR结果证明，该基因在'C299'中随着干旱程度的增大 而表达量升高，证实该基因在'C299'抗旱过程中起重要作用。
[0004] 脱水素的编码基因已从多种植物中克隆出来，包括：拟南芥、水稻、大麦、橡树、红 海榄等。但对于草坪草植物脱水素的克隆、表达模式及蛋白序列尚不清楚。目前，未有任何 与狗牙根'C299'脱水素蛋白结构及其编码基因序列相关的文献报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于填补狗牙根'C299'Dehydrin-S基因的克隆、表达模式分析 以及狗牙根'C299'Dehydrin-S蛋白的空白，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核 酸序列以及检测所述核酸序列的探针；本发明公开了狗牙根'C299'Dehydrin-S蛋白及 其核酸序列在狗牙根'C299'干旱胁迫过程中的表达模式，为今后利用基因工程技术对 Dehydrin-S基因表达的时空特性进行调控，从而为提高狗牙根抗干旱胁迫能力与育种工作 提供了理论依据，具有很大的应用价值。
[0006] -方面，本发明提供了具有干旱胁迫响应功能及保护功能的狗牙根'C299'脱水素 Dehydrin-S蛋白，所述蛋白质是由如SEQIDN0.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由 SEQIDNO. 4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有狗牙根 'C299'脱水素Dehydrin-S蛋白特征的蛋白质。该蛋白质在不同干旱胁迫阶段过程中在细 胞中的表达量存在较大差异。
[0007] 优选的，所述蛋白质为SEQIDNO. 4所示氨基酸序列经过1~50个氨基酸的缺失、 插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20个以内氨基酸而得到的序列。
[0008] 进一步优选的，所述蛋白质为SEQIDNO. 4所示氨基酸序列中1~10个氨基酸被 性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
[0009] 另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。
[0010] 优选的，所述核酸序列具体为：（a)碱基序列如SEQIDNO. 3第1~495位所示； 或（b)与SEQIDNO. 3第1~495位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或（c)能与 SEQIDNO. 3第1~495位所示的核酸进行杂交的序列。
[0011] 优选的，所述核酸序列具体为SEQIDNO. 3第1~495位所示的核酸序列中1~ 90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60个以内核苷酸形成的 序列。
[0012] 此外，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核酸 序列8~100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码狗牙根 'C299'Dehydrin-S基因相关的核酸分子。
[0013] 在本发明中，"分离的DNA"、"纯化的DNA"是指，该DNA或片段已从天然状态下位 于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开， 而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0014] 在本发明中，术语"狗牙根'C299'Dehydrin-S蛋白编码序列"指编码具有狗牙根 'C299'脱水素Dehydrin-S蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO. 3所示的第1~ 495位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO. 3所示的第1~495位 核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。 由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO. 3所示的第1~495位核苷酸序列同源性低至约 70%的简并序列也能编码出SEQIDNO. 4所示的序列。该术语还包括与SEQIDNO. 3所示 的核苷酸序列的同源性至少70 %的核苷酸序列。
[0015] 该术语还包括能编码天然狗牙根'C299'Dehydrin-S蛋白的相同功能、SEQID NO. 3所示序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1~90个核苷酸的 缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加为60个以内核苷酸。
[0016] 在本发明中，术语"狗牙根'C299'Dehydrin-S蛋白"指具有狗牙根 'C299'Dehydrin-S蛋白活性的SEQIDNO. 4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然 狗牙根'C299'Dehydrin-S蛋白相同功能的、SEQIDNO. 4序列的变异形式。这些变异形式 包括（但并不限于）：通常为1~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/ 或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸 进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个 氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括狗牙根'C299'Dehydrin-S蛋白的活 性片段和活性衍生物。
[0017] 本发明的狗牙根'C299'Dehydrin-S蛋白的变异形式包括：同源序列、保守 性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与狗牙根 'C299'Dehydrin-S相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用狗牙根'C299'Dehydrin-S蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0018] 在本发明中，"狗牙根'C299'Dehydrin-S保守性变异多肽"指与SEQIDNO. 4所 示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。 这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0019] 表 1
[0022] 发明还包括狗牙根'C299'Dehydrin-S蛋白或多肽的类似物。这些类似物与狗牙 根'C299'Dehydrin-S相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列 的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异 体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱 变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如 D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如3、y-氨基酸）的类 似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。
[0023] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中