dagrass)、龙爪稷的Dehydrin基因的同源性很高，初步认为它是一个Dehydrin基 因；
[0057] (2)3 ' RACE
[0058] 二轮巢式PCR完成3'末端序列的扩增。
[0059] 第一轮：UPM+3'-GSPl(5, -GCGAACAGTCCGTGATAACTGTCTGTCA-3，）
[0060] 第二轮：NUP+3'-GSP2(5' -TCGTGTAACATGATAAGATGGTCAGCCA-3，）
[0061] UPM和NUP为试剂盒提供。：VRACE得到狗牙根'C299'Dehydrin-S的:V末端 序列（217bp)，回收，连接到pMD18_TSimplevector载体上，用RV-M和M13-47作为通 用引物，采用终止物荧光标记（Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪 (Perkin-Elmer，USA)上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST(http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库（GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的无 芒隐子草与鸭茅Dehydrin基因的同源性很高；
[0062] (3)5 ' RACE
[0063] 以YRACEreadycDNA为模板，通过二轮巢式PCR完成Y末端序列的扩增，
[0064] 第一轮：UPM+5'-GSPl(5' -ACCATCTTATCATGTTACACGAACGTCG-3')
[0065] 第二轮：NUP+5'-GSP2(5' -GAACGTCGTGACAGACAGTTATCACGGA-3，）
[0066] UPM和NUP为试剂盒提供。YRACE得到狗牙根'C299'Dehydrin-S基因的Y 末端序列（643bp)，回收连接后用同上面一样的方法进行测序，将通过上述3种方法获得 的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分析，结果证明从狗牙根'C299'中 新得到的Dehydrin基因的确为一个脱水素蛋白相关的基因，将测序结果结合NCBI的ORF Finding(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)预测，发现了 狗牙根 'C299'Dehydrin-S 基因的起始密码子与终止密码子，根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处 设计特异性引物ORF-F(5 ' -ATGGAGCACCAGGGACAGTACGGC-3 '），ORF-R(5 '-TTAGTGCTG GCCGGGGAGCTTCTCHr)，以狗牙根'C299'cDNA为模板进行PCR，扩增得到495bp狗牙根 'C299'Dehydrin-S蛋白的全长编码序列（SEQIDNO. 3)。
[0067] 实施例2狗牙根'C299'Dehydrin-S基因的序列信息与同源性分析
[0068] 本发明的狗牙根'C299'Dehydrin-S基因全长开放读码框序列为495bp，详细序列 见SEQIDNO. 3所示序列。根据开放读码框序列推导出狗牙根'C299'Dehydrin-S蛋白的 氨基酸序列，共164个氨基酸残基，分子量为16. 7kDa，等电点（pi)为8. 81，详细序列见SEQ IDNO. 4所不序列；
[0069] 将狗牙根'C299'Dehydrin-S的开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用 BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检 索，结果发现它与无芒隐子草Dehydrin基因（登录号：FJ972827. 1)在核苷酸水平上具有 82%的相同性，如图1所示（Query:狗牙根'C299'Dehydrin-S的编码基因序列；Sbjct: 无芒隐子草Dehydrin的mRNA序列）；在氨基酸水平上，它与长穗偃麦草Dehydrin基因 (登录号：AAC05922. 1)也有64%的一致性和64%的相似性，如图2所示（Query:狗牙根 'C299'Dehydrin-S蛋白的氨基酸序列；Sbjct:长穗偃麦草Dehydrin蛋白的氨基酸序列）。 由此可见，狗牙根'C299'Dehydrin-S基因与其它已知物种的Dehydrin基因无论从核酸还 是蛋白水平上都存在较高的同源性。
[0070] 实施例3狗牙根'C299'Dehydrin-S基因在干旱胁迫不同阶段的表达差异性
[0071] 1.材料的获得：对狗牙根'C299'干旱胁迫不同阶段（0天，5天，10天）材料的 叶片进行取样。将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80°C超低温冰箱中 贮存待用；
[0072] 2.RNA的提取：利用RNApreppure植物总RNA提取（Trizol:Invitrogen);提取 狗牙根'C299'不同样品组织中的总RNA;
[0073] 3.RNA的完整性、纯度、浓度的确定：用普通琼脂糖凝胶电泳（胶浓度1. 0. 5XTBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性，电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1. 5~2. 0倍，否则表示rRNA样品的降解；纯度较好的RNA，A2M/A2S。以及A26。/ A23。约为2. 0左右，用分光光度计测定OD值并计算RNA含量；
[0074] 4.cDNA的获得：以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScript?RTreagentKitPerfectRealTime试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA 备用；
[0075] 5.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在各器官与组织中 的表达量，根据已经获得的狗牙根'C299'Dehydrin-S基因序列，利用引物设计软 件设计用于Real-timePCR中Dehydrin-S基因定量分析的特异性引物，引物qDHN F(5' -CGGAGGAAGAAGGGAATC-3')，引物qDHNR(5 ' -TCTCCTTGATCTTGTCCAT-3 '），内参基 因为核糖体 18S基因，引物为 18S-F(5' -GTGACGGGTGACGGAGAAIT-3' )，18S-R(5'-GACAC TAATGCGCCCGGTAT-3');
[0076] 6.制作目的基因及内参基因的标准曲线：用EASYDilution(试剂盒提供）将标 准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基 因的特异性引物进行Real-timePCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线；分析溶 解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得 到单一的PCR扩增产物；通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数；
[0077] 7.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析：以合成的cDNA第一条链为模板，分 别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-timePCR反应在 BIO-RADChromo4实时定量仪上进行，反应体系为20yL，反应采用三步法，94°C变性20s， 接着40个循环：94°C15s;58°C15s;72°C25s;每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增 产物是否为特异产生；
[0078] 8.采用2AAet法作相对定量分析，结果表明狗牙根'C299'随着干旱胁迫程度的 加重，其Dehydrin-S表达水平显著上升（图3)。干旱胁迫的第5天，第10天时，该基因的 表达水平分别为对照植株的20. 7与24. 2倍，说明该基因与干旱胁迫响应显著相关，具有明 显的时空差异性。
[0079] 实施例4、狗牙枏'C299'Dehydrin-S基因转化模式植物拟南芥
[0080] (1)构建转化载体
[0081] 分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物Dehydrin_0FR-S(5'-AAGGAT CCATGGAGCACCAGGGACAGTA-3r ),Dehydrin_0RF-A(5r -AACTAGTGTGCTGGCCGGGGAGCTT