布鲁菌l7/l12蛋白的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种布鲁菌抗原蛋白L7/L12蛋白的新用途。
【背景技术】
[0002] 布鲁菌病（简称"布病"）是由布鲁菌引起的人兽共患慢性传染病。布鲁菌可感染 多种家畜和野生动物，同时也可感染人。感染布病会累及多个器官的功能衰退，严重者丧失 劳动和生活能力。牛布病直接影响牛的生产力，造成了巨大的经济损失，同时其作为一种重 要的人兽共患传染病，也是公共卫生安全的重大威胁。因此，如何有效检测和预防牛布病具 有重要的经济和社会意义。
[0003] 现阶段，布病的实验室检测手段主要包括以下几种：（1)细菌学方法，通过培养病 原体，根据其生物学特征进行判断。细菌学诊断方法是布病诊断的"金标准"，诊断的可靠性 和准确性最高。（2)分子生物学技术，1992年，Baily等建立了布鲁菌属特异性的PCR检测 方法；1994年，Bricker等针对布鲁菌的插入序列IS711建立了AMOS-PCR方法；丁家波等建 立的布鲁菌属鉴定多重PCR方法可对不同种的布鲁菌进行快速、敏感、准确地鉴别。（3)血 清学诊断方法，包括试管凝集试验（SAT)、虎红平板凝集试验（RBPT)、补体结合试验（CFT)、 酶联免疫吸附试验（ELISA)等。RBPT快速方便，适于大量筛选；SATXFT的敏感性和特异性 相对较高，是一些国家和机构公认的确诊实验。ELISA是公认的特异性和敏感性相对较高的 布病诊断方法。其中，cELISA(竞争酶联免疫吸附试验）为OIE推荐的布病诊断方法。
[0004] 布鲁菌是一种兼性胞内寄生菌，感染机体后主要引起以细胞免疫为主，体液免疫 为辅的免疫应答。而细胞介导免疫应答可以产生多种细胞因子，这些细胞因子在机体对抗 细菌感染的过程中发挥重要的作用。对于不同细胞因子的检测，一方面可以对机体的免疫 水平和感染状况进行评价，另一方面对机体感染布鲁菌初期，布病的及时准确诊断提供了 有力的监测目标。特别是IFN-y的分泌是机体产生T细胞免疫反应的重要指标，其在对抗 布鲁菌感染中起着重要作用，IFN-Y的分泌状况可间接反映微生物感染机体后不同蛋白在 体内刺激产生细胞免疫的状况。鉴于针对细胞因子的检测在结核病诊断中的成功应用，抗 原特异性的IFN-Y检测或许可以成为牛，羊等动物布病诊断的潜在手段之一。因此，探索 特异、敏感的刺激原对牛布病的检测和预防控制有着重要意义。
[0005] L7/L12蛋白（核糖体蛋白L7/L12,基因名为rplL)是布鲁菌胞浆核蛋白，是核糖 体的重要组成部分，其在不同的布鲁菌中基因同源性高达97. 1%以上。L7/L12是一种T 细胞优势抗原，能特异性增强IFN-Y的转录和表达，在机体抗布鲁菌感染的过程中发挥重 要作用。
[0006] 目前，尚没有将布鲁菌L7/L12蛋白作为外周血y-干扰素体外释放试验的特异性 刺激原用于牛布病诊断的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种具有较高特异性和良好敏感性的布鲁菌L7/L12重组 蛋白，作为牛布病外周血Y-干扰素体外释放试验的特异性刺激原，期望能够在牛布病的 早期诊断中得到应用。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明的第一方面公开了L7/L12蛋白在制备牛布病外周血y-干扰素体外释放 试验的刺激剂中的新用途。
[0010] 优选地，所述L7/L12蛋白作为外周血Y-干扰素体外释放试验的刺激原。
[0011] 更优选地，所述L7/L12蛋白作为外周血y-干扰素体外释放试验的唯一刺激原。
[0016] 本发明的第二方面公开了一种牛外周血y-干扰素体外释放试验刺激剂，所述刺 激剂采用L7/L12蛋白作为外周血y-干扰素体外释放试验的刺激原。
[0017] 优选地，所述L7/L12蛋白作为外周血y-干扰素体外释放试验的唯一刺激原。
[0018] 本发明的第三方面公开了一种牛IFN-Y试剂盒，所述试剂盒中包括前述牛外周 血y-干扰素体外释放试验刺激剂。
[0019] 本发明的第四方面公开了布鲁菌L7/L12蛋白的制备方法。所述L7/L12蛋白可利 用常规基因工程的制备方法获得。例如：通过PCR方法扩增相应的编码基因序列，经克隆筛 选和测序鉴定正确后，利用pET-28a(+)质粒构建原核表达载体，将鉴定正确的重组表达载 体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，筛选获得阳性转化子，再以IPTG诱导表达，对胞内可溶性表达 的L7/L12蛋白进行亲和层析纯化，即得。
[0020] 进一步的，所述制备方法为：提取牛布鲁菌疫苗株S19基因组DNA作为模板，PCR 扩增rplL基因片段，将rplL片段插入pMD20-T载体转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆； 酶切、回收和连接rplL与pET-28a(+)片段，构建重组质粒pET-28a(+)-rplL，转化大肠杆 菌BL21 (DE3) ;IPTG诱导表达，超声裂解，上清经NI-NTA柱纯化；收集洗脱液于PBS中透析 24h，进行浓度和纯度测定，即得。
[0021] 本发明的有益效果为：
[0022] (1)本发明首次公开了L7/L12蛋白用于制备牛布病外周血丫-干扰素体外释放试 验特异性刺激剂的新用途。将本发明的L7/L12蛋白和其它4种布鲁菌抗原蛋白作为候选 刺激原，依照Prionics公司BOVIGAM?MycobacteriumbovisGammaInterferonTestKit forcattle(简称Prionics公司牛IFN-y试剂盒）说明书检测奶牛外周血样品中IFN-y 水平。结果显示，本发明的L7/L12蛋白作为外周血Y-干扰素体外释放试验刺激原的检测 效果好于其它4种布鲁菌抗原蛋白，与商品化的布鲁菌病cELISA抗体检测试剂盒的阳性和 阴性检测符合率分别为75. 0%和90. 7%，总符合率为89. 0%，显示出其作为牛布病外周血 y_干扰素体外释放试验刺激原的应用价值。
[0023] (2)本发明中所用的诊断抗原L7/L12蛋白为牛布鲁菌的主要优势抗原之一，病原 感染后该抗原在体内能持续存在，而且通过体外刺激感染牛的外周血可以引起IFN-y的 上调表达，且IFN-y的表达上调与布病感染之间存在一定的相关性，这对于布病的新型诊 断方法的研究具有重大参考意义。
【附图说明】
[0024] 图I:(a)为L7/L12基因的PCR扩增鉴定图，其中，M:DL2000DNAmarker，l:目的 基因rplL的PCR产物鉴定；
[0025] (b)为重组质粒pMD20-T-rplL鉴定图，其中M:DL2000DNAmarker，Ml:A14DNA marker，l:pMD2〇-T_rplL质粒未酶切鉴定，2 :pMD2〇-T_rplL质粒BamHI和XhoI双酶切鉴 定；
[0026] (c)为pET-28a(+)-rplL的PCR鉴定图，其中M:DL2000DNAmarker，1 :目的基因 rplL的PCR产物鉴定。
[0027] 图2 :L7/L12蛋白的SDS-PAGE分析，其中M:蛋白marker，1 :重组蛋白L7/L12上 清，2 :重组蛋白L7/L12沉淀，3 :BL21(DE3)-pET-28a(+)空载体对照。
[0028] 图3 :L7/L12重组蛋白的Westernblotting分析，其中M:预染蛋白marker，1 :纯 化的L7/L12重组蛋白。
[0029] 图4 :不同刺激原刺激效果的比较。
【具体实施方式】
[0030] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0031 ] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarbor LaboratoryPress，1989andThirdedition，2001;Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSIN MOLECULARBIOLOGY,Johnffiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates；theseries METHODSINENZYM0L0GY，AcademicPress，SanDiego;Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREAND FUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego, 1998!METHODSINENZYM0L0GY， Vol. 304,Chromatin(P.M.ffassarmanandA.P.ffolffe,eds.),AcademicPress,SanDiego, 1999 ;和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol. 119,ChromatinProtocols(P.B.Becker， ed.)HumanaPress，Totowa，1999 等。
[0032] 实施例I:基因工程菌的构建
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