一种铬螯合型免疫复合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及属于医学领域，具体涉及铬螯合型免疫复合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 免疫复合物（Immunecomplexes，IC)是抗原抗体结合的产物，根据全国科学技术 名词审定委员会的定义，是指抗体与可溶性抗原结合而形成的复合物。它分为两类，一种是 组织中固定的免疫复合物，而另一种则是游离于血液中的免疫复合物，成为循环免疫复合 物（circulatingimmunecomplexes，CIC)。免疫复合物在清除和破坏各种抗原中起着不 可缺少的作用，机体免疫反应的结果就是不断产生免疫复合物。当机体内抗原（或抗体） 数量略多于抗体（或抗原）时，就会形成中等分子大小的免疫复合物，它既不易被吞噬细胞 吞噬，又不能通过肾小球滤孔排出，可较长时间游离于血液和其他体液中。当血管壁通透性 增加时，此类IC可随血液沉积在某些部位的毛细血管壁或嵌合在肾小球基底膜上，激活补 体导致免疫复合物沉积。这些沉积或镶嵌于血管壁或组织的免疫复合物，乃造成血管基膜 炎症和组织损伤的始动因素。免疫复合物可通过以下几方面造成组织损伤：1)激活补体： 沉积的IC通过激活补体，产生过敏毒素和具有趋化效应的活性片段，趋化至局部的肥大细 胞、嗜碱性粒细胞释放活性介质致局部血管通透性增高，引起渗出和局部水肿；2)吸引白 细胞浸润和集聚：中性粒细胞在吞噬IC时释放毒性氧化物和溶酶体酶，损伤邻近组织；3) 活化血小板：IC可通过活化血小板释放血管活性胺类物质，导致血管扩张、通透性增加，加 剧局部渗出和水肿，并激活凝血机制，形成微血栓，引起局部缺血、出血和组织坏死。
[0003] 多种疾病的发生都与免疫复合物的沉积息息相关，如系统性红斑狼疮、类风湿性 关节炎、肾病综合征、冷球蛋白血症、脉管炎、细菌、病毒和寄生虫感染、过敏反应、自身免疫 疾病、皮肤病等。早在上世纪90年代，就有学者发现，在正常机体中，免疫复合物被不断降 解，因而一般检测不到免疫复合物或只呈现低浓度，而在上述一系列疾病中，血清中的免疫 复合物即CIC含量显著升高。虽然CIC检测不具有疾病特异性，但其检测能提供关于免疫 病理、疾病的发展及预后方面的信息。在某些微生物感染、自身免疫中，检测循环免疫复合 物可用作疾病活动性、评价机体的机能和检测疗效的指标。而近些年来，学者们致力于研究 特异性的免疫复合物，研究各种特异性免疫复合物与疾病致病、疾病发展、疾病诊断等各方 面的关系，而这些研究将促使我们对疾病有更深一步了解。
[0004] 铬（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一种过渡金属，铬广泛应用于电镀、鞣 革、颜料、油漆、合金、印染等各个方面，与人们的生活息息相关，但是同样也对人类的身体 健康产生巨大影响。在美国，Cr与Hg、Cd、Pb被称为四大环境污染物。自然界中络主要以 三价和六价的形式存在，而一般认为，三价铬是人类所需的微量元素，而六价铬才是明显的 毒性物质。由于六价铬易通过细胞膜进入细胞，而且可以通过一系列反应，产生强烈的细 胞毒性及基因毒性，因而普遍认为六价铬的毒性高于三价铬，达10 - 100倍。六价铬进入 体内后，可以引发氧化应激、染色体畸变、细胞凋亡、多种DNA损伤（包括单链断裂、DNA-蛋 白质交联、DNA-氨基酸交联、Cr-DNA配合物形成等），从而造成机体多处组织、器官、系统 损伤。不仅如此，六价铬还被认为是一种强有力的致癌物，早在1990年国际癌症研究组织(InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)就将六价络作为一种人类致癌 物。关于六价铬的细胞毒性、基因毒性、致癌性已成为当前广泛研究的课题。
[0005] 铬与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。 随着对铬毒性研究的深入，人们逐渐认识到铬与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重 要的角色，被认为是了解铬的毒性机理的关键所在，因此，对铬和蛋白质相互作用的研究就 显得愈发重要。而现在关于铬与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与铬之 间的关系还不清楚，因而加强对于铬与蛋白质之间的关系至关重要。
[0006] 2004年美国学者A. Ramanaviciene等发现血清中循环免疫复合物含量与地方环 境污染有关，发现随着地区污染严重程度的增加，当地牛血清中的CIC含量显著增加，差异 具有统计学意义，因而可以作为评价地区污染的指标。但环境污染究竟是如何刺激机体内 CIC含量显著升高，是一种还是多种污染物共同作用导致其升高，CIC的升高是否因此会导 致机体损伤，增加机体对于疾病的易感性，这些都有待研究。众所周知，循环免疫复合物是 一种特殊意义的蛋白质，而铬可作用于全身多个系统的蛋白质，铬是否可以作用于循环免 疫复合物，而使循环免疫复合物含量改变、活性改变、功能改变，这些尚缺乏相关研究。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种铬螯合型免疫复合物，该 铬螯合型免疫复合物可用于检测地区人群血清中是否存在铬螯合型免疫复合物及其含量， 间接反映这个地区铬污染程度。
[0008] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0009] -种铬螯合型免疫复合物，该铬螯合型免疫复合物为以下复合物中的一种：
[0010] 铬离子结合于免疫复合物形成的复合物，或
[0011] 铬离子结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；或
[0012] 铬离子结合于免疫球蛋白后与载体蛋白结合形成的复合物。
[0013] 具体的，所述载体蛋白或免疫复合物至少含有锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中一 种结构，铬离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中至少一种与载体蛋白或免疫复合物结 合。
[0014] 具体的，所述载体蛋白为抗体蛋白、脂蛋白、血红蛋白、核抗原、异种血清抗原、病 毒、细菌、原虫、蠕虫中的一种。
[0015] 进一步的，铬离子通过螯合剂与载体蛋白结合后再与能和载体蛋白特异性结合的 抗体结合。
[0016] 进一步的，所述螯合剂为ITCBE、EDTA、多磷酸盐、氨基羧酸、1，3-二酮、羟基羧酸 中的一种。
[0017] 本发明还提供了两种制备铬螯合型免疫复合物的方法，通过这两种方法获得铬螯 合型免疫复合物。
[0018] 其中，第一种制备方法包括：
[0019]A)合成铬螯合型免疫复合物的步骤：先将螯合剂与载体蛋白结合，再与铬离子络 合；
[0020]B)提纯铬螯合型免疫复合物的步骤：采用免疫亲和层析法去除步骤A)合成的铬 螯合型免疫复合物中未参与反应的载体蛋白、特异性抗体及铬离子。
[0021 ] 具体地，所述铬螯合型免疫复合物的制备方法中，
[0022] 所述步骤A)具体步骤如下：
[0023] (1)配制螯合剂：将螯合剂溶于溶剂中，配制成螯合剂溶液；
[0024] (2)配制载体蛋白溶液：将载体蛋白加入到硼酸盐溶液中；
[0025] (3)搅拌过夜：将步骤⑴螯合剂溶液加入到步骤⑵的载体蛋白溶液中，搅拌后 于摇床中作用2_30h，得到混合液；
[0026] (4)透析袋预处理：在透析袋中加入EDTA-NaHCO3溶液煮沸，弃废液后用ddH20冲 洗；重复该步骤1_3次；
[0027] (5)透析：将步骤（3)的混合液装入经步骤（4)处理后的透析袋中，用CldH2O透析， 换水2-3次，4°C透析过夜之后，收集液体；
[0028] (6)铬离子螯合：在上述步骤（5)中的液体中加入HCl溶液调整pH至7. 0,缓慢加 入铬盐溶液，边滴加边振荡，之后于摇床中作用2-30h，然后重复步骤（5) -次，收集液体， 得到铬螯合型抗原；
[0029] (7)在上述铬螯合型抗原中加入能与载体蛋白特异性结合的抗体反应后得到铬螯 合型免疫复合物；
[0030] 所述步骤B)具体步骤如下：
[0031] (a)将上述A)步骤合成的铬螯合型免疫复合物复溶于生理盐水中，得到铬螯合型 免疫复合物溶液；
[0032] (b)层析柱预处理：使用稀释缓冲液冲洗管路，在层析柱中装入能与免疫复合物 特异性结合的填料，装柱后继续用稀释缓冲液平衡柱子；
[0033] (C)上样：待柱子平衡后，用稀释缓冲液稀释上述（a)步骤得到的铬螯合型免疫复 合物溶液，然后上柱，铬螯合型免疫复合物吸附在填料上，未反应的载体蛋白、抗体、铬离子 随稀释缓冲液流出；
[0034] (d)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗柱子，至基线平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0035] (e)收集：收集步骤（d)中洗脱处理后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0036] (f)将经过步骤（e)收集到的洗脱液装入透析袋用CldH2O透析除盐，换水2-4次后， 4 °C透析过夜，收集样本；
[0037] (g)层析柱预处理：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入 能与Cr特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡柱子；
[0038] (h)上样：待步骤（g)的柱子平衡后，用稀释缓冲液稀释上述步骤（f)的样本，然 后将稀释后的样本上柱，铬螯合型免疫复合物吸附在填料上，未反应的抗原抗体复合物会 随稀释缓冲液流出；
[0039] ⑴洗脱：步骤（h)之后用稀释缓冲液冲洗柱子，至基线平衡，然后使用 0? 5-1.Omol/L的Na2HPO4进行洗脱；
[0040] (j)收集：收集步骤（i)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0041] (k)对步骤（j)收集到的洗脱液装入透析袋用CldH2O透析除盐，换水三次后，4°C透 析过夜，收集样本，即得到纯化的铬螯合型免疫复合物。
[0042] 本发明还提供了上述铬螯合型免疫复合物在制备检测铬螯合型免疫复合物的酶 联免疫试剂盒中的应用。
[0043] 本发明还提供了一种检测铬螯合型免疫复合物的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括 如权利要求1所述的铬螯合型免疫复合物的标准品。
[0044] 进一步的，上述试剂盒还包括至少一种以下试剂：含有可捕获抗原抗体复合物的 蛋白的包被液、含有可捕获金属Cr的抗体的包被液、酶标抗体。
[0045] -种定量检测铬螯合型免疫复合物的方法，其以已知含量的铬螯合型免疫复合物 作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结 合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯免疫复合物与原子吸收光谱结合法、 提纯免疫复合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感 耦合等离子体质谱结合法。
[0046] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0047] 1.首次合成了铬螯合型免疫复合物，并证实了在机体内铬可存在于免疫系统，并 证明了铬螯合型免疫复合物的存在；
[0048] 2.本发明实现了免疫复合物的特异性识别，并实现了铬螯合型免疫复合物的定量 检测，提供从免疫角度检测机体内的铬含量水平的方法，并为工业地区的铬污染水平提供 间接指标。
[0049] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0050] 图1为实施例1的铬螯合型免疫复合物通过聚丙烯酰胺凝胶介质的胶床所形成的 蛋白条带图；
[0051] 图2为实施例1的铬螯合型免疫复合物通过聚丙烯酰胺凝胶介质的胶床所形成的 蛋白条带的X荧光分析图；
[0052] 其中，图1中的M为Marker，IC为铬螯合型免疫复合物；图2中的横坐标为蛋白条 带位置，纵坐标为该