据本发明的低过敏性变体的片段或变体，或是根据一种或多种根据本发明的低 过敏性变体的多聚体，或者其特征在于，一种或多种根据本发明的低过敏性变体或其片段、 变体或多聚体是重组融合蛋白的组成部分。
[0043] 此外，本发明提供编码根据本发明的低过敏性变体的DNA分子。
[0044] 本发明进一步提供包含与表达控制序列功能性连接的这种根据本发明的DNA分 子的重组表达载体。表达控制序列是指，启动子或借助于其影响目标蛋白表达和功能性连 接于目标基因但不必必须位于目标基因的直接邻近处的序列区段。
[0045] 根据本发明还提供用根据本发明的DNA分子或根据本发明的表达载体转化的非 人宿主生物。
[0046] 根据本发明还提供通过培养根据本发明的非人宿主生物和获得得自配养物的相 应的过敏原变体的制备根据本发明的低过敏性变体的方法。
[0047] 适合的非人类宿主生物可以是原核或真核的、单细胞或多细胞生物，如细菌或酵 母菌。根据本发明优选的宿主生物是大肠杆菌（AcWi)。
[0048] 可以通过脯氨酸57的、脯氨酸79和脯氨酸101的脯氨酸29 + 30的缺失来研究 单个或两个紧紧相邻的脯氨酸的缺失对Phlp6的IgE结合能力的影响。在Phlp6野生 型蛋白中，这些脯氨酸位于a-螺旋的开头或末端的环区域内（图1;图2)。脯氨酸61和脯 氨酸108优选不改变，因为相应的变体未表现显著的效果。可以类似地研究根据本发明的 禾本科的其它第6组过敏原例如Poap6的对应的同源位置中的脯氨酸突变对IgE结合能 力的影响。
[0049] 为更快地高产量纯化，为这些研究提供了具有编码N-末端六-组氨酸-融合部分 (+6His)的序列的编码DNA(图5,SEQIDN0:5;图6,SEQIDN0:6)。可以同样按照标准 方法纯化药用目的可使用的根据本发明的无标签的变体和野生型的蛋白质并确认His标 签蛋白的结果。
[0050] 相应地制备例如编码蛋白质rPhlp6d[P29, 30] + 6His、rPhlp6d[P57] + 6His、rPhlp6d[P79] + 6His和rPhlp6d[P101] + 6His的序列。可以在所有已知的 真核和原核表达系统、优选在大肠杆菌中表达所述序列。随后用标准方法纯化作为可溶性 单体的蛋白。最后，可以通过在变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE)中分析而检查纯度（图 7)。
[0051] 与折射仪（RI检测器)和多角度光散射检测器（MALS探测器)偶联的分析凝胶过滤 (SEC)允许在线测定洗脱蛋白质的分子量（SEC/MALS/RI方法)。
[0052] 因此，通过SEC/MALS/RI的rPhlp6 d[P29, 30] + 6His、rPhlp6 d[P57]+ 6His、rPhlp6 d[P79] + 6His和rPhlp6 d[P101]+6His分析显示根据本发明的变体 在溶液中作为纯单体存在（图8,表1)。
[0053] 可以通过其中蛋白质被固定在硝酸纤维素膜上并与临床确定的草花粉过敏症患 者的个体血清的IgE抗体相接触的方法确定根据本发明的重组变体的IgE结合能力（带测 试)。随后通过酶反应使过敏原变体/抗体复合物显色（图9)。
[0054] 在该方法中，突变体rPhlp6d[P101] + 6His表现出与未修饰的过敏原相同的 良好的与所有测试血清的IgE结合力（图9)。因此，脯氨酸101的缺失对Phlp6的IgE结 合能力没有显著影响。突变体rPhlp6d[P29,30] + 6His、rPhlp6d[P57] + 6His和 rPhlp6d[P79] + 6His的IgE结合力在不同的草花粉过敏症患者的血清中差别尤其显 著。这是由各过敏症患者的IgE群体的组成中的IgE抗体的亲和力和表位特异性的变化而 产生。相比于未修饰的rPhlp6wt+ 6His，突变体rPhlp6d[P57] + 6His和rPhlp 6d[P79] + 6His显示出与大部分血清明显降低的IgE反应性。然而，最低的IgE结合力通 常在突变体rPhlp6d[P29,30] + 6His的情况下观察到（图9)。
[0055] 此外，可以通过IgE抑制试验（EAST)检验根据本发明的重组变体与人IgE抗体的 结合能力。在该方法中，可以在溶液中研究过敏原/IgE的相互作用，由此能排除例如由于 固定于膜上导致的测试物质的表位的干扰屏蔽。
[0056] 在该实施例中，选择了在条带试验中通过其与突变体rPhlp6d[P29,30] + 6His的IgE结合力显著不同的两种草花粉过敏症患者的血清。血清P32代表在条带测试中 仍然表现出可检测的与rPhlp6d[P29,30] + 6His的IgE结合的血清组(组"A")，而选择 血清P82作为不再具有可检测的反应性的血清组的代表(组"B"）（图9,图14)。
[0057] 用这种测试方法，可以验证相比于未修饰的rPhlp6wt+ 6His，突变体rPhlp 6d[P29,30] + 6His、rPhlp6d[P57] + 6His和rPhlp6d[P79] + 6His的降低的 IgE 结合力，与条带测试的结果一致（图10)。
[0058] 因此，条带测试方法的结果不可归因于IgE表位的部分屏蔽，而是正确地反映了 溶解的蛋白质的降低的IgE结合能力。
[0059] 在使用血清P32的情况下，突变体rPhlp 6d[P101] + 6His在整个浓度范围内 表现出相当于野生型过敏原的IgE结合力（图10)。在使用血清P82时，仅仅在低蛋白浓度 观察到低的IgE结合力，而在高浓度时IgE结合力再次相当于野生型过敏原的IgE结合力 (图 10)〇
[0060] 因此，通过脯氨酸残基101的缺失来降低PhlP6的IgE结合能力在原则上也是 可能的，但这种效果显然是如此小以至于它在条带测试方法中根本不能检测到和在IgE抑 制试验中仅在低浓度时能检测到（图9,图10)。
[0061] 相反，突变体rPhlp6d[P29, 30] + 6His、rPhlp6d[P57] + 6His和rPhlp 6d[P79] + 6His的降低的IgE结合能力在条带测试中可以用大部分过敏症患者的血清轻 易地检测到，并且在IgE抑制试验中在整个检测浓度范围内均被给出（图9,图10)。
[0062] 这基本上证明，第6组过敏原的脯氨酸6的缺失可以降低IgE结合能力。另一方 面，只有某些脯氨酸的缺失导致相关的降低的IgE结合力。
[0063] 借助于用临床确定的草花粉过敏症患者的嗜碱性粒细胞的试验，可以在体外检测 根据本发明的变体的降低的IgE结合能力对人效应细胞活化的作用。
[0064] 测试中采用的粒细胞是由过敏症患者(在本例的过敏症患者P21)的全血分离的。 该过敏症患者代表在条带试验方法中其IgE抗体表现出与rPhlp 6d[P29,30] + 6His的 可检测的结合力的这样的过敏症患者(组"A" ；图9,14)。
[0065] 在重组野生型过敏原和根据本发明的变体rPhlp6d[P29,30] + 6His、rPhlp 6d[P57] + 6His和rPhlp 6d[P79] + 6His相同浓度情况下，本发明的变体表现出对与 膜结合的IgE抗体更低的结合力并因此导致嗜碱性粒细胞活化的急剧降低（图11)。
[0066] 因此该结果验证了突变体rPhlp6d[P29, 30] + 6His、rPhlp6d[P57] + 6His 和rPhlp 6d[P79] + 6His的功能性降低的致敏性。因此该测试可以验证，至少在部分过 敏症患者中，在Phlp 6的这两个区域中脯氨酸突变也降低了 IgE结合能力。
[0067] 因此本发明进一步提供脯氨酸单独突变的禾本科的第6组过敏原的低 过敏性变体，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phlp 6的氨基酸序列中29、30、57、79位 脯氨酸。
[0068] 本发明优选提供脯氨酸单独突变的Phlp6或Poap6的低过敏性变体，所述脯 氨酸在比对中对应于野生型Phlp 6的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。
[0069] 本发明尤其优选提供脯氨酸单独突变的Phlp 6的低过敏性变体，所述脯氨酸在 比对中对应于野生型Phlp 6的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。
[0070] 尤其优选的是脯氨酸去除突变的禾本科（Z5Oaceae)的第6组过敏原的低过敏性变 体，所述脯氨酸在比对中对应于成熟Phlp 6.0102 (SEQ IDN0:2)的氨基酸序列中29、30、 57、79位脯氨酸。
[0071] 本发明进一步优选提供脯氨酸被单独去除的禾本科（Z5Oaceae)的第6组过敏原 的低过敏性变体，所述脯氨酸根据本发明的在比对中对应于野生型Phlp 6的氨基酸序列 中29、30、57、79位脯氨酸的。
[0072] 此外，本发明进一步提供根据本发明的脯氨酸被单独取代的禾本科（Z5Oaceae)的 第6组过敏原的低过敏性变体，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phlp6的氨基酸序列 中29、30、57、79位脯氨酸。此处，脯氨酸被例如亮氨酸（L)替代。然而，根据本发明，根据 本发明的脯氨酸可以被任何氨基酸替代。
[0073] 尤其地，低过敏性变体rPhlp6d[P29]、rPhlp6d[P30]、rPhlp6d[P29, 30]、 rPhlp6d[P57]、rPhlp6d[P79]、rPhlp6P29L、rPhlp6P30L、rPhlp6P29L，P30L、 rPhlp6P57L和rPhlp6P79L以及类似的，包括所有下文所述的根据本发明的低过敏性 变体均是根据本发明的，其中遵循Phlp6、尤其是成熟Phlp6. 0102的序列的编号。
[0074] 而且，这些例子并不限于Phlp6的变体，而是尤其也涉及所有其它禾本科的Poa P6和第6组过敏原。
[0075] 此外，根据本发明的第6组过敏原的低过敏性变体仍可检测的IgE结合能力可通 过脯氨酸突变进一步降低。因此，由于突变体rPhlp6d[P29,30] + 6His强烈降低的IgE 结合力以及通过脯氨酸57和79缺失可以降低IgE结合能力的事实，产生包含组合突变的 核酸。基于突变体rPhlp6d[P29,30] + 6His的DNA，57和79位的脯氨酸缺失或被转换 为氨基酸亮氨酸。
[0076] 于此相应的，制备编码蛋白质rPhlp6d[P29, 30, 57] + 6His和rPhlp6 d[P29,30,79] + 6His以及rPhlp6d[P29,30]P57L+ 6His和rPhlp6d[P29,30]P79L + 6His的序列。这些变体编码在与Phlp6的a-螺旋连接的环的两个中携带脯氨酸突变 的蛋白（图2)。
[0077] 此外，制备编码rPhlp6d[P29, 30]P57LP79L+ 6His的核酸，以产生在三个环 区域中具有脯氨酸突变的过敏原变体（图2)。如上所述，优选在大肠杆菌中表达所述序列， 并且通过标准方法纯化所述蛋白质。
[0078] 同样通过SDS-PAGE和通过SEC/MALS/RI检测纯度（图12,图13)。因此根据本发 明的所有蛋白质均可以以高纯度和溶解度制备。
[0079] SEC/MALS/RI方法揭示了上述突变体在形成二聚体方面的显著差异（图13,表2)。 蛋白质rPhlp6d[P29,30,57] + 6His、rPhlp6d[P29,30]P57L+ 6His和rPhlp6 d[P29,30]P57LP79L+