生物通过口腔黏膜 摄取，作为注射疗法的替代用于临床试验和应用（James&Durham，2008，Clin.Exp-Allergy38: 1074-1088)。
[0022] 另一种可能性是用编码相关过敏原的可表达的DNA治疗(免疫治疗性接种)。在啮 齿类动物上通过注射编码过敏原的DNA提供了对免疫应答的过敏原特异性影响的实验证 据（Hsu等?1996，NatureMedicine2 (5):540_544，Weiss等，2006，Int.Arch.Allergy Immunol. 139: 332-345)。
[0023] 在所有这些治疗形式中，存在着过敏反应或者甚至过敏性休克的根本性风险 (Kleine-Tebbe，2006, Allergologie，4:135-156)。为了使这些风险最小化，米用了类过敏 原（Allergoid)形式的新颖的制备物。这些是化学修饰的过敏原提取物，其具有明显降低IgE反应性，但与未处理的提取物相比，具有相同的T细胞反应性（Fiebig1995Allergo J. 4 (6) :336_339,Kahlert等，1999，Int.Arch.AllergyImmunol，120: 146-157)。
[0024] 治疗优化用重组制备的过敏原是可行的。给定的，任选与患者的个体致敏模式相 一致的重组方法制备的高纯度过敏原的鸡尾酒可以替代来自天然过敏源的提取物，因为， 除了各种过敏原，后者包含相对大量的免疫原性的、但非过敏性伴随蛋白质。重组过敏原的 初步临床研究已经成功实施（Jutel等，2005，J.AllergyClin.Immunol.，116: 608-613; Valenta&Niederberger,2007,J.AllergyClin.Immunol. 119: 826-830)。
[0025] 突变的重组过敏原(其中IgE表位被改变，在不损害对治疗必需的T细胞表位） 有针对性地提供了能够用重组表达产物导致安全脱敏的现实前景（Schramm等.1999,J. Immunol. 162:2406-2414)。所述低过敏性的蛋白质可以以较高的计量在SIT期间使用，而 在此不增加不期望的IgE促进的副作用的概率。
[0026] 在过去，对于许多气源性过敏原(尤其花粉-和室内灰尘螨虫过敏原）和食物过敏 原而言，已经公开了这种具有降低的IgE结合性的"低过敏性"变体。从未改变DNA的过敏 原开始，尤其可以通过过敏原个别区段的片段化、寡聚化、缺失、点突变或重组（DNA重排)制 备并表达重组DNA(Ferreira等，2006，Inflamm. &Allergy-DrugTargets5: 5-14; Bhalla&Singh，2008,TrendsinBiotechnology26:153-161;Westritschnig等，2007， J.Immunol. 179: 7624-7634)。
[0027] 关于草的第6组过敏原，至今仅发表了单一突变策略，其中缺失了用于编码成熟 Phlp6的氨基酸1-30的前90个核苷酸。将该分子表达为组氨酸融合分子，净化并研究 其免疫学特性。N-末端缺失导致减弱的IgE结合力以及减小的嗜碱性粒细胞可刺激性 (Vrtala等，2007,J.Immunol. 179: 1730-1739)。在以后的论文中，同样的分子与Phlp 2的重组变体相连成为杂交分子（Linhart等，2008,Biol.Chem. 389: 925-933)。对于第 6组的草花粉过敏原而言，迄今仍没有公开如用于其它过敏原所述的基于点突变的突变策 略。
[0028] 本发明基于的目标在于在蛋白质-和DNA水平上提供彦本疼的第6组的新型变 体，其特点为降低IgE反应性同时很大程度地保留T细胞反应性，并因此适合用于治疗和预 防特异性免疫治疗和免疫治疗性DNA接种。
【发明内容】
[0029] 令人惊讶地已经发现，这样的彦本疼的第6组过敏原的变体与野生型 的过敏原相比具有降低的IgE的反应性，同时很大程度地保留的与T淋巴细胞的反应性，并 因此是低过敏性的，在所述禾本科中脯氨酸单独或组合突变，所述脯氨酸对应 于比对中野生型Phlp6的氨基酸序列中位置29、30、57、79的脯氨酸。
[0030] 因此本发明提供禾本科（Z5Oaceae)的第6组过敏原的低过敏性变体，在所述禾本 科中脯氨酸单独或组合突变，所述脯氨酸对应于比对中野生型Phlp6的氨基 酸序列中位置29、30、57、79的脯氨酸。
[0031] 尤其优选的是根据本发明的过敏原变体，其特征在于，脯氨酸缺失或被取代。
[0032] 优选根据本发明的低过敏性的第6组过敏原的变体，所述过敏原来自早熟禾亚 科（/boiofeae)亚科，优选来自早熟禾超族（/bot/ae)和Triticodae，优选代表为猫尾草iPhleumpratensel^ 毛卑iHolcuslanatus\7]^^L藤iPhalarisaquatica)、贵花等 iAnthoxanthumodoraturn)^%^{Dactylisglomerata)^?^^(Loliumperenne)n^ 地早熟禾（/3OajOrateasis)、草甸羊茅（/festocajOrateasis)、大麦（ZforofeiM?n/j^are)、 黑麦（fecaJecereaJe)和小麦（7_ritici/a?ae^ina?)。优选的是根据本发明的来自小麦 (Tri11cumaestivuni)nM ^(Secalecereale)^AmHordewnvulgare)Tria 6、 Sec c 6和Horv6的低过敏性变体。尤其优选根据本发明的早熟禾超族（/bot/ae)的第6 组过敏原的低过敏原变体。这些第5组过敏原优选来自猫尾草jOratease)、黑麦 草（Zoiii/a?jOere/Me)、草地早熟禾（/3OajOrateasis)、绒毛草（//oici/61ianatos)和水生藹 (/3AgJari1S1agWatica)的Phl p 6、Poa p 6、Hol p 6、Lol p 6和Pha a 6,并且最特别优 选的是Poa p 6和Phl p 6,尤其为Phl p 6。上面提到的过敏原及其前体蛋白的所有自然 存在的同分异构体、同质多形体和变体也是根据本发明的。
[0033] 在根据本发明的低过敏性变体中，优选的是突变的脯氨酸，其在比对中对应于成 熟卩111?6.0101或其变体（5￡〇10勵:4、5￡〇10勵：7、5￡〇10勵:8)或成熟？111?6.0102(SEQIDN0:2)、尤其优选成熟Phlp6.0102的氨基酸序列中的位置29、30、57、79的脯氨 酸。
[0034] 尽管已知脯氨酸会对蛋白质结构产生影响，但将有针对性的脯氨酸残基的点突变 作为形成过敏原的低过敏性突变体的起始点仅对尘螨Zkriflae的第2 组主要过敏原的（Derf2,脯氨酸残基残基被丙氨酸替代）进行了研究（Takai等，2000， Eur.J.Biochem. 267:6650-6656)。然而，在3个点突变的情况下，IgE结合能力和刺激 嗜碱性细胞的能力只是略有下降，而其他三个的情况如同未修饰的过敏原。在Derf2情 况下，脯氨酸突变因此表现出过敏性的仅仅非常微弱的降低或者没有降低。没有公开通过 脯氨酸交换突变制备低过敏性突变体的进一步策略。因此，本领域技术人员不能预期脯氨 酸突变将成功地作为产生过敏原的低过敏性突变体的起点。
[0035] 此外，迄今没有对任何过敏原进行研究，脯氨酸残基的特异性缺失如何对表达产 物的整个IgE的结合能力产生影响以及对过敏相关的效应细胞的活化发生何种影响。
[0036] 成熟的Phlp6 或两种异构体（Phip6. 0101，GenBank:Z27082. 1， UniProt:P43215;Phlp6.0102，GenBank:Y16955，UniProt:065868)的氨基酸序列具有 7 个脯氨酸残基（图1)。氨基酸位置29、30、57、79和101的的脯氨酸直接位于a-螺旋的开 头或末端，并且参与蛋白质表面的形成（图2)。61位的脯氨酸残基是第三个螺旋的组成部 分，而脯氨酸108位于C末端附近。
[0037] 从Phlp6 异构体Phlp6. 0101(SEQIDNO:4)和Phlp6. 0102(SEQIDNO 2)的氨基酸序列出发制备重组的未修饰的野生型过敏原（rPhlp6wt;图4)和基因改变 的根据本发明的变体。与以下描述的制备方法相类似，也可以制备其它根据本发明的禾本 科的第6组过敏原（例如Poap6)的野生型蛋白和根据本发明的低过敏性变体。为此，优 选通过替代或缺失使脯氨酸单独或组合突变，所述脯氨酸在比对中对应于野生型Phlp6 的氨基酸序列中29、30、57、79位脯氨酸。
[0038] 根据本发明的过敏原变体适合于借助基因工程方法从克隆的DNA序列开始制 备。根据本发明的制备方法是本领域技术人员从相关的实验室操作规程和出版物已知的， 例如E.F.Fritsch，J.Sambrook，T.Maniatis，MolecularCloning，ColdSpringHarbor LaboratoryPress，1989。
[0039] 对于所述的第6组过敏原的变异，在其它位置的进一步改变-例如为了增加低过 敏性-自然也是可能的。这些修饰可以是，例如，氨基酸插入、氨基酸缺失、氨基酸替换和蛋 白质裂解成片段和蛋白质或其与其它蛋白质或多肽的片段的融合以及通过相同的蛋白质 或片段融合的多聚体。
[0040] 根据本发明的片段优选包含20-109个氨基酸，优选30-100个氨基酸，尤其优选 40-90个氨基酸。此外，本发明的变体包括例如在图18、19和20(SEQIDN0:8，SEQIDN0:9， SEQIDN0:10)中所述的具有前导的天然或人工的信号序列的前体蛋白，例如，ProPhlp 6。此外，根据本发明的是具有N-或C-末端融合标签(例如如图5和6中的His标签、MBP 标签、表达调控序列等）的融合蛋白质、杂合分子，如，例如，具有其它过敏原或其低过敏性 变体的融合物或以任何期望序列的片段的融合物。此外，本发明的变体还包括具有至少80% 的氨基酸序列与相关的第6组野生型过敏原具有同一性、优选至少90%的氨基酸序列与相 关的第6组野生型过敏原具有同一性、尤其优选至少95%的氨基酸序列与相关的第6组野 生型过敏原具有同一性的同源序列（同质多形体（SNPs)，异构体）。在这些变体中，一个或 几个氨基酸优选被保守替换，例如极性氨基酸被另一个极性氨基酸取代或中性氨基酸被另 一个中性氨基酸取代，但是被非保守取代的变体也是根据本发明的。多聚体优选包括通过 连接序列连接的或直接融合的根据本发明的低过敏性变体的二聚体或三聚体。
[0041] 这种变体的例子是按照图17和18的Phlp6. 0101的变体（SEQIDNO: 7、SEQID N0:8)，其中与本发明的作用无关的单个氨基酸已经被取代，或在N末端缺失三个氨基酸， 或其在N末端具有信号肽的前体序列以及类似物。本发明的变体的另外的例子是同质多形 的变体，例如，两种异构体Phlp6. 0101和Phlp6. 0102本身，和具有一个或多个氨基酸 替换、在N-和/或C-末端具有一个或多个氨基酸缺失或在氨基酸序列内具有相应的缺失 缺口的另外的变体。在氨基酸序列内或在N-和/或C末端在不同位置中具有单个或多个 氨基酸个别插入的或作为一个组插入的变体同样是根据本发明的。
[0042] 因此本发明还提供禾本科（Poaceae)的第6组过敏原的低过敏性变体，其特征在 于，它是根