一种测定小而密脂蛋白的试剂、方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种测定小而密脂蛋白的试剂、方法和试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 血液中存在的脂蛋白根据其比重大致分为高密度脂蛋白（HDL)、低密度脂蛋白 (LDL)、极低密度脂蛋白（VLDL)以及乳糜微粒(CM)4类。其中低密度脂蛋白（LDL)是由一系列 大小、密度和化学组成各异的颗粒组成。一般将LDL亚组分中颗粒较小密度较大的LDL称为 小而密脂蛋白（small dense Low-Density Lipoprotein，简称sdLDL);将颗粒较大、密度较 小的LDL称为大而轻LDL，简称LgLDL;介于二者之间的亚组分为中密度LDL。近来研究发现， 与普通LDL相比，sdLDL致动脉粥样硬化的能力更强，是公认的引发心血管病的重要危险因 素之一。
[0003] 目前在临床检测应用中，测定sdLDL的方法有电泳法、超速离心法和分级沉淀法 等。但这些方法检测时间很长，不能进行大规模自动化检测，且需要昂贵的仪器设备，故不 能应用于一般的临床医学检测。并且，目前也不存在专门针对小而密脂蛋白的任何检测方 法。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，针对目前缺乏专门针对小而密脂蛋白的检测方法 的不足，提供一种测定小而密胆固醇的试剂、方法和试剂盒。本发明所述的试剂配制简单方 便，能够高效、准确地应用于所述方法中进行特异性检测sdLDL。本发明所述的测定方法，能 够特定、专一地检测小而密脂蛋白（sdLDL)。并且该测定方法可靠性高、成本低、效率高，能 够大规模自动化特异性检测sdLDL。本发明所述的试剂盒操作简便，能够高效、准确地特异 性检测sdLDL。
[0005] 本发明通过广泛深入的研究，发现将血清样品与包括适宜浓度的聚乙烯硫酸 (PVS)、聚乙二醇(PEG)、硫酸葡聚糖或磷钨酸和肝素等其他成分组成的第一试剂反应，能够 较为完全地清除HDL并且掩蔽LgLDUVLDL和CM;再与组分及其含量经特殊选择的第二试剂 反应，从而进一步准确测定血清标本中sdLDL的含量。
[0006] 本发明的技术方案之一是提供一种测定小而密脂蛋白的第一试剂，其包括以下的 组分：
[0007] 0.1~10mmol/L 4-氨基安替比林，
[0008] lmg/L~500mg/L试剂A，所述试剂A为选自聚乙烯硫酸、聚乙二醇、硫酸葡聚糖和磷 钨酸中的一种或多种，所述百分比为质量百分比，
[0009] 10 ~300U/mL 肝素钠，
[0010] 0.1 ~90mmol/L 二价金属离子，
[0011] 0.05~6 %表面活性剂A，所述表面活性剂A为花王公司的Emulgen A90、花王公司 Emulgen B66和苯乙稀苯酸聚氧乙稀（16)醚中的一种或多种，
[0012] 0.5~2KU/L胆固醇酯酶，
[0013] 1~3.5KU/L胆固醇氧化酶，和
[0014] 100~300KU/L过氧化氢酶。
[0015] 本发明所述的第一试剂中，所述4-氨基安替比林的含量为0.1~10mm〇l/L，较佳地 为0 · 75~2 · 5mmol/L，更佳地为 1 · 25~2 · 5mmol/L。
[0016] 本发明所述的第一试剂中，所述试剂A为选自聚乙烯硫酸、聚乙二醇、硫酸葡聚糖 和磷妈酸中的一种或多种。较佳地，所述试剂A为聚乙稀硫酸，所述试剂A的含量为lmg/L~ 200mg/L，更佳地为200mg/L。更佳地，所述聚乙烯硫酸的平均分子量为170K。较佳地，所述试 剂A为聚乙二醇，所述试剂A的含量为0.1~0.3g/L，更佳地为0.3g/L。更佳地，所述聚乙二醇 的平均分子量为6000。较佳地，所述试剂A为硫酸葡聚糖，所述试剂A的含量为0.05g/L~ 〇.5g/L，更佳地为0.5g/L。更佳地，所述硫酸葡聚糖的平均分子量为50K。较佳地，所述试剂A 为磷妈酸，所述试剂A的含量为1~3mg/L，更佳地为3mg/L。
[0017]本发明所述的第一试剂中，所述肝素钠的含量为10~300U/mL，较佳地为90~ 200U/mL，更佳地为 100 ~200U/mL。
[0018] 本发明所述的第一试剂中，所述二价金属离子为本领域常规的金属离子，较佳地 为镁离子或锰离子，更佳地为镁离子，最佳地为硫酸镁。所述二价金属离子的含量为〇. 1~ 50mmol/L，较佳地为 20 ~90mmol/L，更佳地为 25 ~50mmol/L。
[0019] 本发明所述的第一试剂中，所述表面活性剂A的含量为0.05~6%，较佳地为0.2~ 0.86%，更佳地为0.37~0.5%，所述百分比为质量百分比。较佳地，所述表面活性剂A为与 高密度脂蛋白相互作用的表面活性剂；较佳地，所述表面活性剂A为花王公司的Emulgen A90、花王公司Emulgen B66和苯乙稀苯酸聚氧乙稀（16)醚中的一种或多种。更佳地为花王 公司的Emulgen A90和花王公司Emulgen B66中的一种或两种。最佳地为花王公司的 Emulgen A90。
[0020] 本发明所述的第一试剂中，所述胆固醇酯酶的含量为0.5~2KU/L，较佳地为0.6~ 0.8KU/L。
[0021] 本发明所述的第一试剂中，所述胆固醇氧化酶的含量为1~3.5KU/L，较佳地为2~ 3.0KU/L。
[0022]本发明所述的第一试剂中，所述过氧化氢酶的含量为100~300KU/L，较佳地为200 ~300KU/L。
[0023] 本发明中，较佳地，所述第一试剂还包括缓冲液。所述缓冲液为本领域常规的缓冲 液，较佳地为MOPS缓冲液或M0PS0缓冲液，更佳地为MOPS缓冲液。所述缓冲液的含量为本领 域常规的含量，较佳地为25~120mmo 1 /L，更佳地为25~50mmo 1 /L。
[0024] 本发明中，较佳地，所述第一试剂还包括稳定剂。所述稳定剂为本领域常规的稳定 剂，较佳地选自抗坏血酸氧化酶、牛血清白蛋白、氯化钠或EDTA中的一种或多种，更佳地为 牛血清白蛋白、氯化钠或EDTA中的一种或多种，最佳地为牛血清白蛋白、氯化钠和EDTA。所 述稳定剂的含量为本领域常规的含量，其中，较佳地抗坏血酸氧化酶的含量为1~10KU/L; 所述牛血清白蛋白的含量较佳地为0.1~lg/L，更佳地为0.1~0.25g/L;所述氯化钠的含量 较佳地为5~55mmol/L，更佳地为5~25mmol/L;较佳地，所述EDTA的含量为0.5~5mmol/L。
[0025] 本发明中，较佳地，所述第一试剂还包括防腐剂。所述防腐剂为本领域常规的防腐 剂，较佳地为Procl in-300。所述防腐剂的含量为本领域常规的含量，较佳地为0.01~ 0.5%，所述百分比为质量百分比。
[0026] 本发明中，更佳地，所述的第一试剂包括以下的组分：
[0027] 2.50mM 4-氨基安替比林，
[0028] 0.5g/L硫酸葡聚糖，
[0029] 100U/mL 肝素钠，
[0030] 20mM 硫酸镁，
[0031] 0.80%Emulgen A-90,0.06%Emulgen B-66,
[0032] 2.0KU/L胆固醇酯酶，
[0033] 3.5KU/L胆固醇氧化酶，
[0034] 200KU/L过氧化氢酶，
[0035] 20mM MOPS缓冲液，
[0036] 5mM 氯化钠，
[0037] 〇.5mM EDTA，和
[0038] 0.25g/L BSA，所述百分比为质量百分比。
[0039] 本发明还提供了所述第一试剂的制备方法，其包括以下步骤:将上述试剂A、肝素 钠、二价金属离子、4-氨基安替比林和表面活性剂A加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至 6.40-6.70,然后加入胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢酶，即得第一试剂。
[0040] 本发明中，较佳地，所述缓冲液、所述稳定剂和所述防腐剂中的一种或多种在调节 pH之前添加。
[0041 ]本发明所述第一试剂的形态为澄清液体。
[0042] 本发明的技术方案之二是提供一种测定小而密脂蛋白的第二试剂，其包括以下的 组分：
[0043] 0.2~10KU/L过氧化物酶，
[0044] 0.3~20mmol/L Trinder's色原化合物，
[0045] 0.1~0.3%叠氮钠，和，
[0046] 0.05~12%表面活性剂B，所述表面活性剂B为花王公司的EmulgenA60和巴斯夫 公司的Pluronic F-88中的一种或两种，所述百分比为质量百分比。
[0047]本发明所述第二试剂中，所述过氧化物酶的含量为0