专利名称：真菌酸性核酸酶检测试剂、制备方法及真菌酸性核酸酶的检测方法
技术领域：
本发明涉及真菌酸性核酸酶检测试剂、制备方法及真菌酸性核酸酶的检测方法。
背景技术：
核酸酶(nucleases)是指所有可以水解核酸的酶。不同来源的核酸酶，其专一性、 作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶(RNase)，有些核酸酶 只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶(DNase)，有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也 能作用于DNA，因此统称为核酸酶(nuclease)。根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶 分为核酸外切酶(exonuclease)和核酸内切酶(endonuclease)。根据核酸酶的最适作用 PH，可将核酸酶分为碱性核酸酶和酸性核酸酶，细菌的核酸酶多为碱性核酸酶(如金黄色 葡萄球菌核酸酶)，而真菌的核酸酶多为酸性核酸酶(如桔青霉的核酸酶)。测定核酸酶的活力一般采用紫外比色法(张树政.酶制剂工业.科学出版 社.1998,749-750.)，该方法比较繁琐，所需试剂较多，但可以对核酸酶活性进行较准确的 定量测定。该方法不能对核酸酶进行快速定性检测。采用核酸电泳条带的弥散，虽然可以部分表观核酸分子的降解程度(沈鹤柏，夏 静芬，吴庆锋，余沛涛，章宗穰.Ce离子对寡聚脱氧核苷酸的断裂作用.上海师范大学学报 (自然科学版)，2000，3:67-72)，但不能用于检测核酸酶。郭良洽(郭良洽，叶芳贵，林旭 聪，谢增鸿.甲苯胺蓝荧光猝灭法测定核酸.光谱学与光谱分析，2006，Noll 121 124 ； Kui Jiao, Qing-Jun Li, Wei Sun, Zeng-Jian Wang. Voltammetric Detection of the DNA Interaction with Toluidine Blue. Electroanalysis. 2005,11 :997 1002)等以甲苯胺 蓝为荧光探针，基于DNA对甲苯胺蓝的荧光猝灭作用，建立了一种定量测定DNA的新方法。 在pH 8. 5的Tris-HCl缓冲溶液中，测定小牛胸腺DNA的线性范围为0. 1-610 u g/mL，检测 限为 27ng/mL。对于细菌产生的碱性核酸酶，Steritfeld等(Streitfeld，MM.，Hoffmann EM, and Janklow HM. Evaluation of extracellular deoxyribonuclease activity in Pseudomonas. J. Bacteriol. 1962. 84 77 80)最早采用甲苯胺兰0检测细菌对DNA的水 解作用，产生有色沉淀圈来进行判别酶活性的有无。Smith等(Smith，PB，Hancock GA, and Rhoden DL. Improved medium for detectingdeoxyribonuclease-producing bacteria. Apple. Microbiol. 1969，18 991 993)将甲基绿(methylgreen, MG)用于检测细菌对 DNA 的水解作用。目前甲苯胺兰-DNA琼脂培养基已被用于金黄色葡萄球菌碱性核酸酶的检测 (TNase试验)中(United States Patent 4481291 ；孟昭赫.食品卫生检验方法注解微生 物学部分(第一部分)[M].北京人民卫生出版社，1990.)，用于检验样品中是否存在金黄 色葡萄球菌，但对核酸酶活力没有定量分析。真菌的核酸酶是酸性酶，故上述培养基不能直 接用于真菌核酸酶的检验测定。由上述文献资料可见，采用可用于真菌酸性核酸酶快速检测、以及定量测定的方法尚未见有报道。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是提供一种真菌酸性核酸酶检测试剂，为此，本 发明采用以下技术方案所述试剂为凝胶剂，在液体状态时，所述试剂的pH = 5. 0 6. 0， 在所述试剂中DNA 或 RNA 浓度为 0. 025 0. 125% (g/100mL)；锌离子的浓度为1 3X l(T3mol/L、钙离子的浓度为1. 5 2. 5X l(T5mol/L ；甲苯胺兰的浓度为2 4X 10_4mOl/L ；琼脂的含量以所述检测试剂冷却后能够凝固为准。由于采用本发明的上述技术方案，本发明所制得的检测试剂能够仅用4-8小时即 可快速检测真菌酸性核酸酶的活性，且较为灵敏，以核酸酶P为例，最低检测限为5个酶活 单位(采用比色法测定。张树政.酶制剂工业.科学出版社.1998，749-750.)；利用本发 明所制得的试剂进行真菌酸性核酸酶的活性检测，效率高，根据样品量的多少可在同一板 上同时检验，所用试剂无需湿热灭菌处理，简便、节省成本；在一定范围内酶活性的大小与 粉红色透明变色圈直径成正比关系，可用于核酸酶的定量检测，在核酸酶微生物菌种的高 通量筛选方面有重要价值。本发明实现了真菌酸性核酸酶常规条件下的快速高效检验与测 量。在食品、医药及酶酶制剂工业将有十分广泛应用前景。本发明另一个所要解决的技术问题是提供一种前述真菌酸性核酸酶检测试剂的 制备方法。为此，本发明采用以下技术方案，它包括以下步骤1)、称取DNA用蒸馏水进行溶解，放入沸水浴中水浴，然后冰浴以达到DNA热变性； 或者，称取RNA用馏水进行溶解；2)、在pH5. 0-6. 0的醋酸缓冲液或酸性蒸馏水中加入琼脂，煮沸熔化；3)、待步骤2)配制的溶液冷却到50_58°C之后，在其中加入步骤1)配制的溶液以 及微量元素混合均勻，所述微量元素为锌离子和钙离子；4)、在步骤3)制得的溶液中再加入甲苯胺兰溶液混合均勻，倒入培养皿；5)、静置冷却，凝固后即得真菌酸性核酸酶检测试剂。上述步骤中，DNA或RNA、锌离子、钙离子、甲苯胺兰、琼脂的用量按照检测试剂体 积以及前述的浓度计算。由于采用本发明的上述技术方案，本发明能够快速、方便地制得上述检测试剂。本发明再一个所要解决的技术问题是提供一种采用前述真菌酸性核酸酶检测试 剂检测真菌酸性核酸酶的方法。为此，本发明采用以下技术方案它在装有凝固的真菌酸性 核酸酶检测试剂的培养皿表面放置牛津杯，用移液器吸取100 300微升核酸酶样品溶液， 注入到上述牛津杯中，在室温 37°C的条件下静置，等待粉红色变色圈是否出现，以判断是 否具有活性。进一步地，它量取所述粉红色变色圈直径；被检测真菌酸性核酸酶活性的对数值 与变色圈直径成正比，Ln(NU) = a (d)2，其中，NU表示核酸酶活力，a表示相关系数，d表 示粉红色变色圈的直径。由于采用本发明的上述技术方案，本发明能够仅用4-8小时即可快速检测真菌酸性核酸酶的活性，且较为灵敏，以核酸酶P为例，最低检测限为5个酶活单位(采用比色法 测定。张树政.酶制剂工业.科学出版社.1998，749-750.)；利用本发明进行真菌酸性核 酸酶活性检测，效率高，根据样品量的多少可在同一板上同时检验，无需无菌操作，简便、节 省成本；在一定范围内酶活性的大小与粉红色透明变色圈直径成正比关系，可对核酸酶定 量检测，在高产核酸酶微生物菌种的高通量初筛方面有重要价值。本发明实现了真菌酸性 核酸酶常规条件下的快速高效检验与测量。
图1为本发明实施例3所提供的检测试剂检测酸性核酸酶的酶解圈形态图。
具体实施例方式实施例1真菌酸性DNA/RNA水解酶的快速检验检测试剂各组分含量如下DNA 或 RNA(g/100mL)，0.025%甲苯胺兰，2Xl(T4mol/L醋酸缓冲液，0.05mol/L微量元素锌离子IX l(T3mol/L、钙离子 1. 5X l(T5mol/L琼脂的含量以所述检测试剂冷却后能够凝固为准，具体以1. 5% (g/100mL)为宜。按照检测试剂体积以及前述的浓度，称取适量的DNA或RNA用适量醋酸缓冲液进 行溶解，醋酸缓冲液的PH = 5. 0-6. 0，优选pH5. 1，完全溶解之后放入沸水浴中水浴lOmin， 然后冰浴以达到DNA热变性；按照检测试剂体积以及前述的浓度，称取适量琼脂，加入醋酸缓冲液中，醋酸缓冲 液的 PH = 5. 0-6. 0，优选 pH5. 1，100°C煮沸熔化 5min ；待含琼脂溶液冷却到50_58°C优选55°C后，加入上述热变性的DNA或RNA溶液以 及微量元素混合均勻；微量元素为锌离子和钙离子，它们的用量按照检测试剂体积以及前 述的浓度计算；锌离子的加入可通过加入氯化锌或硫酸锌的方式实现，钙离子的加入可通 过加入氯化钙的方式实现。按照检测试剂体积以及前述的浓度，取适量甲苯胺兰溶液，将前段所配溶液加入 所述甲苯胺兰溶液，将它们混合均勻，倒培养皿(直径9cm)，每皿15mL ；静置冷却，凝固后备用。在上述培养皿表面按等距放置牛津杯3个。用移液器吸取100微升核酸酶溶液， 注入到上述牛津杯中；在室温 37°C的条件下静置4小时；有粉红色变色圈出现，表示存在酸性DNA/RNA核酸酶活性。但底色较透明导致粉 红色酶解圈过于透明，不便观察。实施例2真菌酸性DNA/RNA水解酶的检验检测试剂的各组分含量如下DNA 或 RNA(g/100mL)，0. 125%甲苯胺兰，4Xl(T4mol/L酸性蒸馏水(0.5mol/L 盐酸调节 pH)，pH5. 0-6. 0，优选 pH 5. 5
5
微量元素锌离子3X l(T3mol/L、钙离子 2. 5X l(T5mol/L琼脂的含量以所述检测试剂冷却后能够凝固为准，具体以1. 5% (g/100mL)为宜。按照检测试剂体积以及前述的浓度，称取适量的DNA或RNA用上述蒸馏水进行溶 解，完全溶解之后放入沸水浴中水浴lOmin，然后冰浴；按照检测试剂体积以及前述的浓度，称取适量琼脂，加入上述蒸馏水中，100°C煮 沸熔化5min ；待含琼脂溶液冷却到50_58°C优选55°C后，加入上述热变性的DNA或RNA溶液以 及微量元素混合均勻；微量元素为锌离子和钙离子，它们的用量按照检测试剂体积以及前 述的浓度计算；按照检测试剂体积以及前述的浓度，取适量甲苯胺兰溶液，将前段所配溶液加入 所述甲苯胺兰溶液，将它们混合均勻，倒培养皿(直径9cm)，每皿15mL ；静置冷却，凝固后备用。在上述培养皿表面按等距放置牛津杯3个。用移液器吸取300微升核酸酶溶液， 注入到上述牛津杯中；在室温 37°C的条件下静置8小时；有粉红色变色圈出现，表示存在酸性核酸酶活性。粉红色变色圈的直径较小但颜 色较深，便于观察；边缘弥散不便于定量分析。 实施例3真菌酸性DNA/RNA水解酶的检验检测试剂各组分含量如下DNA 或 RNA (g/100mL) ,0.1%甲苯胺兰，2. 5X l(T4mol/L酸性蒸馏水(0.5mol/L 盐酸调节 pH)，pH5. 0-6. 0，优选 pH 5. 5微量元素锌离子2X l(T3mol/L、钙离子 1. 5X l(T5mol/L琼脂的含量以所述检测试剂冷却后能够凝固为准，具体以1. 5% (g/100mL)为宜。按照检测试剂体积以及前述的浓度，称取适量的DNA或RNA用上述蒸馏水进行溶 解，完全溶解之后放入沸水浴中水浴lOmin，然后冰浴；按照检测试剂体积以及前述的浓度，称取适量琼脂，加入上述蒸馏水中，100°C煮 沸熔化5min ；待含琼脂溶液冷却到50_58°C优选55°C后，加入上述热变性的DNA或RNA溶液以 及微量元素混合均勻；微量元素为锌离子和钙离子，它们的用量按照检测试剂体积以及前 述的浓度计算；按照检测试剂体积以及前述的浓度，取适量甲苯胺兰溶液，将前段所配溶液加入 所述甲苯胺兰溶液，将它们混合均勻，倒培养皿(直径9cm)，每皿15mL ；静置冷却，凝固后备用。在上述培养皿表面按等距放置牛津杯3个。用移液器吸取200微升核酸酶溶液， 注入到上述牛津杯中；在室温 37°C的条件下静置6小时；图1显示了上述检查的结果，在 图中有粉红色变色圈出现，表示存在核酸酶活性。通过本实施例的检测试剂进行核酸酶活 性检测，变色圈的直径较小但颜色越深，便于观察，蓝色底色与粉红色变色圈对比清晰，边 缘清晰整齐，是本发明的最佳实施方式，在这种情况下，对核酸酶活性既可进行定性也可定 量分析。定量分析具体为
待粉红色变色圈出现直至粉红色变色圈直径不再变化，量取所述变色圈直径；被检测真菌酸性核酸酶活性的对数值与变色圈直径成正比。Ln(NU) = α (d)2，其 中，NU表示核酸酶活力，α表示相关系数，可通过回归计算获得，d表示粉红色变色圈的直径。
权利要求
一种真菌酸性核酸酶检测试剂，其特征在于所述试剂为凝胶剂，在液体状态时，所述试剂的pH＝5.0～6.0，所述试剂中DNA或RNA浓度为0.025～0.125％(g/100mL)；锌离子的浓度为1～3×10-3mol/L、钙离子的浓度为1.5～2.5×10-5mol/L；甲苯胺兰的浓度为2～4×10-4mol/L；琼脂的含量以所述检测试剂冷却后能够凝固为准。
2.如权利要求1所述的一种真菌酸性核酸酶检测试剂，其特征在于它为在溶液状态下 倒入至培养皿后凝固所得的试剂。
3.权利要求1所述的真菌酸性核酸酶检测试剂的制备方法，其特征在于它包括以下步骤1)、称取DNA用蒸馏水进行溶解，放入沸水浴中水浴，然后冰浴，以达到DNA热变性，或 者，称取RNA用馏水进行溶解；2)、在pH5.0-6. 0的醋酸缓冲液或酸性蒸馏水中加入琼脂，煮沸熔化；3)、待步骤2)配制的溶液冷却到50-58°C之后，在其中加入步骤1)配制的溶液以及微 量元素混合均勻，所述微量元素为锌离子和钙离子；4)、在步骤3)制得的溶液中再加入甲苯胺兰溶液混合均勻，倒入培养皿；5)、静置冷却，凝固后即得真菌酸性核酸酶检测试剂；上述步骤中，DNA或RNA、锌离子、钙离子、甲苯胺兰的用量按照检测试剂体积以及在权 利要求1中所述的浓度计算。
4.采用权利要求1或2所述方法制得的真菌酸性核酸酶检测试剂检测真菌酸性核酸酶 的方法，其特征在于它在装有凝固的真菌酸性核酸酶检测试剂的培养皿表面放置牛津杯， 用移液器吸取100 300微升核酸酶样品溶液，注入到上述牛津杯中，在室温 37°C的条件 下静置，等待粉红色变色圈是否出现，以判断是否具有活性。
5.如权利要求4所述的检测真菌酸性核酸酶的方法，其特征在于它量取所述粉红色变 色圈直径；被检测真菌酸性核酸酶活性的对数值与变色圈直径成正比，Ln(NU) = α (d)2，其中，NU 表示核酸酶活力，α表示相关系数，d表示粉红色变色圈的直径。
全文摘要
本发明提供了一种真菌酸性核酸酶检测试剂，所述试剂为凝胶剂，在液体状态时，所述试剂的pH＝5.0～6.0，在所述试剂中含有DNA或RNA、锌离子、钙离子、甲苯胺兰、琼脂。本发明还提供了上述检测试剂的制备方法以及采用所述检测试剂检测真菌酸性核酸酶的方法。本发明能够仅用4-8小时即可快速检测真菌酸性核酸酶的活性，且较为灵敏，还可用于核酸酶的定量检测，在核酸酶微生物菌种的高通量筛选方面有重要价值。本发明实现了真菌酸性核酸酶常规条件下的快速高效检验与测量。在食品、医药及酶酶制剂工业将有十分广泛应用前景。
文档编号C12Q1/44GK101871008SQ20101018756
公开日2010年10月27日 申请日期2010年5月31日 优先权日2010年5月31日
发明者梁新乐 申请人:浙江工商大学