专利名称：乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶的方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学、食品化学、食品科学、食品安全等领域，具体涉及一种乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶的方法。该发明生产的亚硝酸还原酶主要应用于消除农产品、食品、饲料和环境中亚硝酸盐残留，提高食品安全和食品质量，减少亚硝酸盐引起的食物中毒和癌症发生率。
背景技术：
农业生产氮肥大量施用，N、P、K比例失调，使环境中硝酸盐、亚硝酸盐大量富集，致使农产品、食品及饲料中大量亚硝酸盐残留。亚硝酸盐是一种对人体有害的物质，它不仅使人、畜和禽直接中毒、致死；而且是致癌物亚硝胺的前体。据我国卫生部食品卫生监督检验所对北京、河南、青岛、吉林地区的蔬菜、粮食、鲜鱼类、鲜肉类、鲜蛋类、食盐、酱腌菜、乳与乳制品中亚硝酸盐分析，调查结果表明，市场供应的正常八大类食品均有亚硝酸盐被检出，其中酱腌菜的检出率高达94.7％，最高值为85.6mg/kg。据山东省食品卫生监督检验所食物中毒资料显示1983～1997年全省共发生亚硝酸盐引起的食物中毒82起，发病1089人，造成死亡39人。亚硝酸盐中毒，潜伏期最短为10min，最长的4h，平均在30min左右发病。据不完全统计，目前全国的发病率增加了十几倍甚至几十倍。因此，采取有效措施消除和减少农产品、食品、饲料和环境中亚硝酸盐残留是食品安全生产、提高食品质量，减少亚硝酸盐引起的食物中毒和癌症发生率的必要条件。查新表明消除农产品、饲料、食品及环境中亚硝酸盐残留国内外还没有比较科学、便捷、有效、快速的方法。
亚硝酸还原酶是降解亚硝酸盐最有效途径。亚硝酸盐在亚硝酸还原酶的作用下转化为氨，可表示为因此，在农产品、食品、饲料和环境中加入亚硝酸还原酶可以快速降解亚硝酸盐，排除其对人类的危害和致病性。利用对人有益的乳酸菌发酵生产的亚硝酸还原酶，在原料前处理时期添加0.01‰～0.5‰的亚硝酸还原酶，在20～60℃保温5～60min，即可将残留于农产品、食品、饲料和环境中的亚硝酸盐完全降解。在应用上解决了亚硝酸盐残留对人、畜和禽产生的危害和致病性。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶的方法，该方法是在26～32℃、亚硝酸盐诱导下乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶的方法，这种生产方法获得的亚硝酸还原酶粗酶液活性可以达到2600U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。当该酶的活性为1000U/ml或1000U/g，0.01‰～0.5‰的使用量应用于农产品、食品、饲料和环境中，在20～60℃保温5～60min可以将残留的亚硝酸盐完全降解。利用亚硝酸还原酶消除亚硝酸盐残留操作简单、方便、快捷、成本低、安全可靠。可以从根本上解除亚硝酸盐残留引起人、畜和禽直接中毒、致死、致癌的危害。
本发明所述的一种乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶的方法具体包括以下步骤(1)将产生亚硝酸还原酶的乳酸菌进行活化、按常规方法逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(2)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～8％接种量接入液体产酶培养基中，在26～32℃培养36～72h时，添加40～150mg/L亚硝酸盐，再培养12～24h，即乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶结束；(3)将(2)的发酵液在8,000～10,000rpm，离心收集乳酸菌菌体；(4)用(3)收集到的菌体体积2～3倍pH值7.0的缓冲液清洗，待菌体完全悬浮后在8,000～10,000rpm离心收集乳酸菌菌体，重复上述清洗菌体操作2～3次，最终将菌体制备成乳酸菌菌悬液；(5)将(4)制备成的乳酸菌菌悬液减压破碎菌体；(6)将(5)得到的菌体破碎悬液在12,000～140,000rpm、4℃离心，收集到的上清液即为粗酶液。
(7)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，可商购获得，活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。亚硝酸还原酶产生乳酸菌(例如，CGMCC菌种编号1.11或1.19或1.557或1.2029或1.1480或1.1878等)，菌株活化后发酵生产亚硝酸还原酶时按产酶条件进行培养，该菌株在4℃环境中可保存4个月。
具体实施例方式实施例一(1)、培养基制备①菌种活化培养基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH值6.8，121℃高压蒸气灭菌30min。
②液体种子培养基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，自来水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
③产酶培养基酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸钠0.5～2.0g，柠檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自来水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
(2)将产生亚硝酸还原酶的乳酸菌，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行活化；(3)将(2)活化好的乳酸菌接种3针至5ml的液体种子试管中，在26～28℃培养48～72h，而后按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将(3)制备的二级种子按发酵液体积3～5％的接种量接入10L的产酶培养基中，在26～28℃培养60～72h时，添加40～80mg/L亚硝酸盐，再培养12～24h，即乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶结束。
(5)将(4)的发酵液在8,000～10,000rpm，离心收集乳酸菌菌体；(6)用(5)收集到的菌体体积2～3倍pH值7.0的磷酸盐缓冲液清洗，待菌体完全悬浮后在8,000～10,000rpm离心收集乳酸菌菌体，重复上述清洗菌体操作2～3次，最终将菌体制备成乳酸菌菌悬液；(7)将(6)制备成的乳酸菌菌悬液减压破碎菌体；(8)将(7)得到的菌体破碎悬液在12,000～140,000rpm、4℃离心，收集到的上清液即为粗酶液。
(9)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(8)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
实施例二(1)、培养基制备①菌种活化培养基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH值6.8，121℃高压蒸气灭菌30min。
②液体种子培养基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，自来水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
③产酶培养基酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸钠0.5～2.0g，柠檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自来水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
(2)将产生亚硝酸还原酶的乳酸菌，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行活化；(3)将(2)活化好的乳酸菌接种3针至5ml的液体种子试管中，在28～30℃培养48～60h，而后按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将(3)制备的二级种子按发酵液体积6～8％的接种量接入20L的产酶培养基中，在28～30℃培养36～48h时，添加81～120mg/L亚硝酸盐，再培养12～24h，即乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶结束。
(5)将(4)的发酵液在8,000～10,000rpm，离心收集乳酸菌菌体；(6)用(5)收集到的菌体体积2～3倍pH值7.0的磷酸盐缓冲液清洗，待菌体完全悬浮后在8,000～10,000rpm离心收集乳酸菌菌体，重复上述清洗菌体操作2～3次，最终将菌体制备成乳酸菌菌悬液；(7)将(6)制备成的乳酸菌菌悬液减压破碎菌体；(8)将(7)得到的菌体破碎悬液在12,000～140,000rpm、4℃离心，收集到的上清液即为粗酶液。
(9)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(8)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
实施例三(1)、培养基制备①菌种活化培养基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgS04·7H2O0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH值6.8，121℃高压蒸气灭菌30min。
②液体种子培养基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，自来水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
③产酶培养基酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸钠0.5～2.0g，柠檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自来水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
(2)将产生亚硝酸还原酶的乳酸菌，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行活化；(3)将(2)活化好的乳酸菌接种3针至5ml的液体种子试管中，在30～32℃培养36～48h，而后按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(4)将(3)制备的二级种子按发酵液体积3～5％的接种量接入50L的产酶培养基中，在30～32℃培养36～48h时，添加121～150mg/L亚硝酸盐，再培养12～24h，即乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶结束。
(5)将(4)的发酵液在8,000～10,000rpm，离心收集乳酸菌菌体；(6)用(5)收集到的菌体体积2～3倍pH值7.0的磷酸盐缓冲液清洗，待菌体完全悬浮后在8,000～10,000rpm离心收集乳酸菌菌体，重复上述清洗菌体操作2～3次，最终将菌体制备成乳酸菌菌悬液；(7)将(6)制备成的乳酸菌菌悬液减压破碎菌体；(8)将(7)得到的菌体破碎悬液在12,000～140,000rpm、4℃离心，收集到的上清液即为粗酶液。
(9)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(8)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
实施例四按实施例一、二和三方法生产的乳酸菌亚硝酸还原酶，经测定，粗酶液平均酶活性为2600U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同活性、纯度和剂型的酶制剂。将活性为1000U/ml或1000U/g的亚硝酸还原酶，按原料重量0.01‰～0.5‰的量添加于农产品、食品、饲料和环境中，在20～60℃处理5～60min进行亚硝酸盐检测，检测结果见下表。
检测结果表明残留于农产品、食品、饲料和环境中的亚硝酸盐，经亚硝酸还原酶制剂处理，亚硝酸盐完全降解；同时也说明亚硝酸还原酶是消除亚硝酸盐残留最简单、方便、快捷，有效的方法。
权利要求
1.一种乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶的方法，其包括以下步骤(1)将产生亚硝酸还原酶的乳酸菌按常规方法进行活化、逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(2)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～8％接种量接入液体产酶培养基中，在26～32℃培养36～72h时，添加40～150mg/L亚硝酸盐，再培养12～24h；(3)将(2)的发酵液在8,000～10,000rpm，离心收集乳酸菌菌体；(4)用(3)收集到的菌体体积2～3倍pH值7.0的缓冲液清洗，待菌体完全悬浮后，在8,000～10,000rpm下离心收集乳酸菌菌体，重复上述清洗菌体操作2～3次，最终将菌体制备成乳酸菌菌悬液；(5)将(4)制备成的乳酸菌菌悬液减压破碎菌体；(6)将(5)得到的菌体破碎悬液在12,000～140,000rpm、4℃离心，收集到的上清液即为粗酶液。
2.根据权利要求1所述的方法，在步骤(6)之后包括将步骤(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中液体产酶培养基为酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸钠0.5～2.0g，柠檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自来水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
全文摘要
本发明提供一种乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶的方法，将产生亚硝酸还原酶的乳酸菌进行活化、按常规方法逐级扩大培养，制备成液体种子；按发酵液体积的3～8％接种量接入液体产酶培养基中，在26～32℃培养36～72h时，添加40～150mg/L亚硝酸盐，再培养12～24h，即乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶结束；这种生产方法获得的亚硝酸还原酶粗酶液活性可以达到2600U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度、纯度和剂型的酶制剂。
文档编号C12N9/02GK1687408SQ200510073389
公开日2005年10月26日 申请日期2005年6月3日 优先权日2005年6月3日
发明者张庆芳, 迟乃玉 申请人:张庆芳, 迟乃玉