一种纳米金酶传感器检测水中亚硝酸盐的方法
【专利摘要】一种纳米金酶传感器检测水中亚硝酸盐的方法，包括以下步骤：⑴将裸金电极浸入1,6-己二硫醇的乙醇溶液中；⑵再将裸金电极浸入纳米金溶液中修饰；⑶将电极浸入辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液中避光修饰；⑷绘制亚硝酸盐检测的标准曲线；⑸检测，计算出待测溶液中亚硝酸盐的浓度。本发明不仅利用纳米金粒子对辣根过氧化物酶的强吸附作用，提高了电极上辣根过氧化物酶的负载量，而且纳米金粒子能够活化修饰电极表面，加速修饰电极上电子的转移，使响应电流增大，拓展线性范围。采用本发明的方法，检测水中亚硝酸盐，线性范围宽，水中亚硝酸盐回收率在96.5％～105％之间。
【专利说明】一种纳米金酶传感器检测水中亚硝酸盐的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测水中亚硝酸盐的方法，尤其是涉及一种纳米金酶传感器检测 水中亚硝酸盐的方法。
【背景技术】
[0002] 当摄入的亚硝酸盐过量时，人体内正常的血红蛋白在亚硝酸盐作用下转化为高铁 血红蛋白，失去对氧分子的携载能力，造成机体内供氧不足，严重者会危及生命，当人体亚 硝酸盐摄入量达到1?3克即可致死。此外，胺类和酰胺类化合物与亚硝酸根反应可生成 致癌性的亚硝胺类物质，人类的食道癌、胃癌、肝癌等均与亚硝胺类物质有关。
[0003] 亚硝酸盐的测定方法虽多，且各有其优点；但各种方法也存在各自缺点：光谱法 所用仪器设备简单、价廉，实用性和可操作性强，易于在基层单位使用，但其灵敏度相对较 低，检测下限高；色谱法精确度高，可同时测定多种成分，但所用仪器设备复杂，操作繁琐； 电化学分析法仪器简单，操作简便，分析速度快，但目前存在线性范围窄，专一性差等问题。
[0004] 王米娜采用构建的辣根过氧化物酶电化学传感器对水中NaNO2进行检测，线性范 围为8.3X10_ 4-L05X10_2mol /L (参见王米娜，刘慧宏.固定化辣根过氧化物酶电化 学测定有机过氧化物和亚硝酸盐.襄樊学院学报，2009，30(2): 5-9)。马超越采用纳 米二氧化锰壳聚糖复合膜固载辣根过氧化物酶，制备成酶生物传感器，对水中NaNO2进行 检测，线性范围为1.45X10_ 7mol/L-1.45X10_3mol/L (参见马超越.固定化辣根过氧化 物酶生物传感器制作及应用研究.河南工业大学，2011)。郑冬云等构建了聚溴酚蓝修 饰玻碳电极，对水中NaNO 2进行检测，线性范围在2. OOXKT8 -1.09 X 10_4mol /L (参见郑 冬云，刘晓军，朱珊莹，等.电化学传感法测定水中亚硝酸盐.中国环境监测2014， 30(4) : 140-145)。可见，现有方法的线性范围在2-4个数量级。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种能快速响应，操作简 单，线性范围宽，专一性好，灵敏度高的纳米金酶传感器检测水中亚硝酸盐的方法。
[0006] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种纳米金酶传感器检测水中亚硝酸 盐的方法，包括以下步骤： ⑴将裸金电极浸入1，6-己二硫醇（HDT)的乙醇溶液中10-15小时；1，6-己二硫醇通 过分子自组装修饰于裸金电极表面；分别用无水乙醇和超纯水从侧面冲洗掉金电极表面物 理吸附的1，6-己二硫醇； 所述1，6-己二硫醇（HDT)的乙醇溶液中，1，6-己二硫醇浓度优选为0. 8 - I. 2 mmol/ L，更优选 lmmol/L ; ⑵将经步骤（1)修饰上1，6-己二硫醇的裸金电极浸入纳米金溶液中，2-6°C避光修饰 10-15小时；用超纯水从侧面冲洗掉物理吸附的纳米金粒子； 所述纳米金溶液的浓度优选为〇. 1-0. 3mmol/L ; ⑶将经步骤（2)纳米金修饰的电极浸入辣根过氧化物酶（HRP)的磷酸盐缓冲溶液 中；2-6°C避光修饰10-15小时；HRP通过静电吸附作用固定于纳米金粒子上，然后将电极 用磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，浓度为〇· 08 - 0· 12 mol/L (优选0· lmol/L)，pH为 6. 8-7. 2,冲洗干净，得到可用于亚硝酸盐检测的辣根过氧化物酶生物传感器，标记为Au电 极-HDT-纳米金-HRP修饰电极； 所述辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液中，辣根过氧化物酶浓度优选为4 一 6 mg/ mL，更优选5mg/mL ;所述磷酸盐缓冲溶液指磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，浓度优选为 0· 08 - 0· 12 mol/L (更优选 0· lmol/L)，pH 优选为 6. 8-7. 2 ; (4) 以步骤（3)制备的Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰电极为工作电极，采用循环伏安 法得到HRP修饰电极在不同浓度亚硝酸盐溶液中的响应电流，亚硝酸盐浓度与相应的响应 电流之间的函数关系即亚硝酸盐检测的标准曲线； (5) 以步骤（3)制备的Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰电极对亚硝酸盐待测溶液进行检 测，工作电位选用E= 0. 70-0. 80V，得到的响应电流根据步骤⑷获得的标准曲线即可计算出 待测溶液中亚硝酸盐的浓度。
[0007] 本发明通过1，6-己二硫醇（HDT)分子自组装技术将1，6-己二硫醇分子固定于裸 金电极表面，然后通过金硫键将纳米金粒子固定于1，6-己二硫醇分子上，最后通过静电吸 附作用将辣根过氧化物酶固定于纳米金粒子表面，从而实现辣根过氧化物酶在裸金电极表 面的有效固定。本发明的生物传感器灵敏度好、检测限底、选择性好，能够实现对亚硝酸盐 的快速准确测定。
[0008] 本发明具有以下优点： 本发明不仅利用纳米金粒子对辣根过氧化物酶的强吸附作用，提高了电极上辣根过氧 化物酶的负载量，而且纳米金粒子能够活化修饰电极表面，加速修饰电极上电子的转移，使 响应电流增大，从而拓展了线性范围。采用本发明的方法，检测水中亚硝酸盐，线性范围宽， 在9.06父1〇- 8!11〇1/1?3.98\1〇-3111〇1/1，达5个数量级，水中亚硝酸盐回收率在96.5%? 105 %之间。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1表示不同修饰电极在5mmol/L亚硝酸盐-磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安图， 曲线a、b、c、d分别表示Au电极、Au电极-HDT修饰电极、Au电极-HDT-纳米修饰电极、Au 电极-HDT-金纳米-HRP修饰电极在亚硝酸盐浓度为5mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中的循环 伏安图； 图2表示亚硝酸盐的浓度在9. 06 X 10_8-3. 98 X 10_3mol/L范围内时，亚硝酸盐在Au电 极-HDT-纳米金-HRP修饰电极上的响应电流和亚硝酸盐浓度的线性关系图。
【具体实施方式】
[0010] 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0011] 实施例1 本实施例包括以下步骤： ⑴将裸金电极浸入浓度为lmmol/L的1，6-己二硫醇（HDT)的乙醇溶液中12小时，再 分别用无水乙醇和超纯水从侧面冲洗掉金电极表面物理吸附的HDT ; ⑵将经步骤（1)修饰上HDT的裸金电极浸入制备好的纳米金溶液（所述纳米金溶液 的浓度为〇. 25mmol/L)中，于4°C避光条件下修饰12小时，然后再用超纯水从侧面冲洗掉物 理吸附的纳米金粒子； ⑶将经步骤（2)纳米金修饰的电极浸入5mg/mL的HRP磷酸盐缓冲溶液(磷酸氢二 钾-磷酸二氢钾，浓度为〇. I mol/L，pH为7)中，4°C条件下避光修饰12小时，然后将电极 用缓冲溶液(磷酸氢二钾-磷酸二氢钾，〇. lmol/L，pH为7)冲洗干净，得可用于亚硝酸盐检 测的辣根过氧化物酶生物传感器； (4)通过循环伏安法检测5mmol/L亚硝酸盐在裸金电极、Au电极-HDT修饰电极、Au电 极-HDT-纳米修饰电极、Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰电极上电化学行为的差异，亚硝酸 盐浓度为5mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=7)组成：亚硝酸盐浓度5mmol/L，磷酸氢二钾-磷 酸二氢钾浓度〇· lmol/L，KCl浓度0· lmol/L，循环伏安法参数设置：电势扫描范围0?8V， 扫描速度〇. lV/s (结果如图1所示)。图1表示不同修饰电极在5mmol/L亚硝酸盐-磷酸 盐缓冲溶液中的循环伏安图，曲线a、b、c、d分别表示Au电极、Au电极-HDT修饰电极、Au 电极-HDT-纳米修饰电极、Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰电极在亚硝酸盐浓度为5mmol/ L的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安图。由图1分析发现当Au电极、Au电极-HDT修饰电极、 Au电极-HDT-金纳米纳米金修饰电极、Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰电极在亚硝酸盐溶 液中进行循环伏安扫描时，亚硝酸盐在各支电极表面均产生氧化峰电流并且无还原峰电流 出现，说明亚硝酸盐在各电极表面均发生不可逆氧化反应。Au电极-HDT-纳米金-HRP修 饰电极表面的氧化峰电流最大，裸金电极氧化峰电流次之，Au电极-HDT修饰电极和Au电 极-HDT-纳米金修饰电极氧化峰电流最小。
[0012] 以上分析结果证明，引入的金纳米粒子不仅在一定程度上增大了亚硝酸盐发生氧 化反应的比表面积和电子传递比表面积而且有效地保护了 HRP对亚硝酸盐的催化活性。因 此在金纳米粒子和HRP的协同作用下Au电极-HDT-金纳米-HRP修饰电极表现出对亚硝酸 盐良好的电化学催化活性，从而使得亚硝酸盐在Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰电极表面 氧化峰电流最大，并且由于HRP的高效固定使得Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰电极比裸 金电极在亚硝酸盐检测中拥有更好的灵敏度和选择性。
[0013] 4.以Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰电极为工作电极，采用电流-时间曲线 法分别得到HRP修饰电极在不同浓度亚硝酸盐溶液中的响应电流。分析和研究当亚硝 酸盐浓度分别为 9. 06Xl(T8mol/L、2· 09Xl(T7mol/L、5· 96Xl(T6mol/L、9· 06Xl(T6mol/L、 3. 98Xl(T5mol/L、7· 94Xl(T5mol/L、2.09Xl(T4mol/L、5· 96Xl(T4mol/L、9· 06Xl(T4mol/L、 2. 09X 10_3mol/L、3. 98X 10_3mol/L时与相应的响应电流之间的函数关系并据此得到亚硝 酸盐检测的标准曲线和线性范围；根据最低检测下限（LOD) = 3〇/k (〇表示空白标准 偏差，k表示标准曲线的斜率)，计算本方法的检出限(如图2所示)。图2表示在最优实验 条件下(工作电位0· 76V，pH=7)，当亚硝酸盐的浓度在9· 06X l(T8mol/L?3· 98X l(T3mol/ L范围内时，亚硝酸盐在Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰电极上的响应电流和亚硝酸盐浓 度满足线性关系：Ι/μΑ = -0.0424 - 2.7791C /mmol/L [N02-]，R2=0.9996,检测下限为 6.57Xl(T8mol/L (根据 LOD= 3〇/k)。
[0014] 5.工作电位选用E= 0. 76V，根据需要将不同质量的亚硝酸盐分别直接加入矿 泉水(不含亚硝酸盐）中，配制成不同浓度的亚硝酸盐-磷酸盐缓冲溶液。然后再用Au电 极-HDT-纳米金-HRP修饰电极对亚硝酸盐待测样品溶液进行检测，分析得到的电流-时间 曲线，通过相关实验数据计算样品中的亚硝酸盐浓度和样品的加标回收率，所得结果列于 表1中。
[0015] 表1为矿泉水样品中亚硝酸盐的回收率检测，测得回收率在96. 5%?105%之间， 证明HRP修饰电极选择性较好，很好克服了矿泉水中相关离子的干扰。
[0016]
【权利要求】
1. 一种纳米金酶传感器检测水中亚硝酸盐的方法，其特征在于，包括以下步骤： ⑴将裸金电极浸入1，6-己二硫醇的乙醇溶液中10-15小时；分别用无水乙醇和超纯 水从侧面冲洗掉金电极表面物理吸附的1，6-己二硫醇； ⑵将经步骤（1)修饰上1，6-己二硫醇的裸金电极浸入纳米金溶液中，2-6°C避光修饰 10-15小时；用超纯水从侧面冲洗掉物理吸附的纳米金粒子； ⑶将经步骤（2)纳米金修饰的电极浸入辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液中；2-6°C 避光修饰10-15小时；HRP通过静电吸附作用固定于纳米金粒子上，然后将电极用浓度为 0. 08 - 0. 12 mol/L，pH为6. 8-7. 2的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液冲洗干净，得到可 用于亚硝酸盐检测的辣根过氧化物酶生物传感器,标记为Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰 电极； (4) 以步骤（3)制备的Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰电极为工作电极，采用循环伏安 法得到HRP修饰电极在不同浓度亚硝酸盐溶液中的响应电流，亚硝酸盐浓度与相应的响应 电流之间的函数关系即亚硝酸盐检测的标准曲线； (5) 以步骤（3)制备的Au电极-HDT-纳米金-HRP修饰电极对亚硝酸盐待测溶液进行检 测，工作电位选用E= 0. 70-0. 80V，得到的响应电流根据步骤⑷获得的标准曲线即可计算出 待测溶液中亚硝酸盐的浓度。
2. 根据权利要求1所述的纳米金酶传感器检测水中亚硝酸盐的方法，其特征在于，步 骤（1)中，所述1，6-己二硫醇的乙醇溶液中，1，6-己二硫醇浓度为0. 8 - 1. 2 mmol/L。
3. 根据权利要求2所述的纳米金酶传感器检测水中亚硝酸盐的方法，其特征在于，所 述1，6-己二硫醇的乙醇溶液中，1，6-己二硫醇浓度为lmmol/L。
4. 根据权利要求1或2所述的纳米金酶传感器检测水中亚硝酸盐的方法，其特征在于， 步骤（2)中，所述纳米金溶液的浓度为0. 1-0. 3mmol/L。
5. 根据权利要求1或2所述的纳米金酶传感器检测水中亚硝酸盐的方法，其特征在于， 步骤（3)中，所述辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液中，辣根过氧化物酶为4 一 6 mg/mL ; 所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾溶液，浓度为〇. 08 - 0. 12 mol/L，pH为 6. 8_7. 2。
6. 根据权利要求1或2所述的纳米金酶传感器检测水中亚硝酸盐的方法，其特征在于， 步骤（3)中，所述辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液中，pH为6. 8-7. 2。
【文档编号】G01N27/327GK104316580SQ201410556468
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】李忠海, 付湘晋, 郭筱兵, 黎继烈 申请人:中南林业科技大学