一种亚硝酸盐还原酶及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一个新的亚硝酸盐还原酶基因，其编码的亚硝酸盐还原酶最适pH5.5；最适反应温度35℃；经0.1M?pH5.5缓冲液在30℃-50℃下处理1h，仍能保持90％以上的活性；具有较好的水解亚硝酸盐的能力；可作为饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。
【专利说明】一种亚硝酸盐还原酶及其编码基因
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及一种亚硝酸盐还原酶及其编码基因。
【背景技术】
[0002] 由于农业上氮肥的大量使用，环境中硝酸盐和亚硝酸盐大量富集，致使农产品、食 品以及饲料中有大量的亚硝酸盐残留。而亚硝酸盐是一种对人体有害的物质，它不仅使人、 畜禽直接中毒、致死，而且是致癌物亚硝胺的前体，据研究，食道癌与患者摄入的亚硝酸盐 量呈正相关。亚硝酸盐还原酶能够将饲料、食品以及环境中的亚硝酸盐还原成氨或是一氧 化氮。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种亚硝酸盐还原酶。
[0004] 本发明的另一目的是提供编码上述亚硝酸盐还原酶的基因。
[0005] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0006] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0007] 本发明所述亚硝酸盐还原酶XW4NIR可得自类芽孢杆菌（Paenibacillus Ash)，其 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本发明提供的亚硝酸盐还原酶XW4NIR总共含313个氨基酸，理论分子量为34kDa。 该酶的最适pH值为5. 5,在pH4. 0 - 7. 5的范围内维持50%以上的酶活性；经pH5. 5的缓冲 液在30°C -50°C下处理lh，仍能保持90%以上的活性；该酶最适温度为35°C ;在pH5. 5及 37°C下，该酶对0.5% (w/v)亚硝酸钠的比活力为1548. 12±66.81U/mg。
[0009] 本发明提供了编码上述亚硝酸盐还原酶的基因 XW4N，该基因序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[0010] 本发明通过PCR的方法分离克隆了亚硝酸盐还原酶XW4NIR的编码基因 XW4N，其 全长942bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。经BLAST比对，该亚硝酸盐还原酶基因 XW4N 编码的氨基酸序列与GenBank中nitrite Paenibacillus sp. HGF5来源的潜在亚硝酸盐还 原酶假定蛋白具有最高的一致性，为49%，说明亚硝酸盐还原酶XW4NIR是一种新的亚硝酸 盐还原酶。
[0011] 本发明还提供了包含上述亚硝酸盐还原酶基因 XW4N的重组载体，优选为 PET-XW4N。将本发明的亚硝酸盐还原酶基因 XW4N插入到表达载体的限制性酶切位点之间， 使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明 的亚硝酸盐还原酶基因插入到质粒pET-28a(+)上的Hind III和Xho I限制性酶切位点之 间，得到重组大肠杆菌表达质粒PET-XW4N。
[0012] 本发明还提供了包含上述亚硝酸盐还原酶基因 XW4N的重组菌株，优选所述菌株 为大肠杆菌、酵母菌、类芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21 (DE3) /XW4N。
[0013] 本发明制备亚硝酸盐还原酶XW4NIR的方法按以下步骤进行：
[0014] (1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0015] (2)培养重组菌株，诱导重组亚硝酸盐还原酶表达；
[0016] (3)回收并纯化所表达的亚硝酸盐还原酶XW4NIR。
[0017] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大 肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3) /XW4N。
[0018] 本发明提供了一个新的亚硝酸盐还原酶基因，其编码的亚硝酸盐还原酶最适 ρΗ5· 5 ;最适反应温度35°C;经0· 1M ρΗ5· 5缓冲液在30°C -50°C下处理lh，仍能保持90%以 上的活性；具有较好的水解亚硝酸盐的能力；可作为饲料或食品添加剂应用于饲料与食品 行业。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例提供的亚硝酸盐还原酶的SDS-PAGE分析图，其中，Μ :低分子 量蛋白质Marker ;1 :纯化的重组亚硝酸盐还原酶XW4NIR ;
[0020] 图2为本发明提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与pH值的曲线关系图；
[0021] 图3为本发明提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与pH值在不同时间的曲线关系 图；
[0022] 图4为本发明提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与温度的曲线关系图；
[0023] 图5为本发明提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与温度在不同时间的曲线关系 图；
[0024] 图6为本发明提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与金属离子的柱状图。
【具体实施方式】
[0025] 试验材料和试剂
[0026] 1、菌株及载体：类芽孢杆菌（Paenibacillus Ash)来源于实验室保存菌株。
[0027] 大肠杆菌 Escherichia coli BL21 (DE3)和表达载体 pET_28a(+)购于 Novagen 公 司。
[0028] 2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa 公司；其它均为国产试剂。
[0029] 3、培养基：
[0030] LB 培养基：PeptonelOg，Yeast extract5g，NaCllOg，加蒸馈水至 1000ml，pH 自然 (约为7)。固体培养基在此基础上加2. 0% (w/v)琼脂。
[0031] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0032] 实施例1 :亚硝酸盐还原酶基因 XW4N的克隆
[0033] 提取类芽孢杆菌基因组DNA :将类芽孢杆菌于平板划线培养单菌落，挑取单菌落 于20mL培养基过夜培养，收集菌体提取基因组DNA。
[0034] 从LB平板上刮取3-5个菌落，加入180 μ L溶菌酶37 °C条件下处理lh后加入 20μ L蛋白酶K，混匀后加入220μ L GB溶液，震荡，70°C放置lOmin ;加入220μ L无水乙 醇，混匀；将其转到吸附柱中，于12000rpm离心lmin，向吸附柱中加入500 μ L⑶溶液，离心 lmin，；向吸附柱中加600 μ L漂洗液PW，离心lmin，弃废液；重复一次后再离心2min，晾干 (37°C开盖lOmin);滴加50 μ L洗脱缓冲液TE，37°C放置5min ;离心2min ;于-20°C保存。
[0035] 根据前期测序得到的核甘酸序列，设计合成引物：
[0036] XW4F 如 SEQ ID No. 3 所示，为 5, -ATGCAGGCCATTCTGTCTGACGGA-3,；
[0037] XW4R 如 SEQ ID No. 4 所示，为 5, -TCATCCAAGCACCTTCGCCTCATAA-3,；
[0038] 以类芽孢杆菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94°C预热5分钟， 94°C变性45秒，50°C复性30秒，72°C延伸1分30秒，30个循环，72°C保温5分钟。
[0039] 实施例2 :重组亚硝酸盐还原酶XW4NIR的制备
[0040] 以XW4NIR F和XW4NIR R为引物对，类芽孢杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。 PCR反应参数为：94°C预热5分钟，94°C变性45秒，52 °C复性30秒，72 °C延伸1分30秒，30 个循环，72°C保温5分钟。PCR结果得到亚硝酸盐还原酶的基因 XW4N，并在该基因5'和3' 端分别引入了 Hind III和Xho I酶切位点。将编码亚硝酸盐还原酶的基因 XW4N进行双酶 切（Hind III和Xho I)，同时将表达载体ET-28a(+)进行双酶切（Hind III和Xho I)。将 上述酶切的亚硝酸盐还原酶XW4NIR与表达载体pET-28a(+)相连接，获得含有亚硝酸盐还 原酶基因 XW4N的重组质粒pET-XW4N并转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得重组大肠杆菌菌株 BL21(DE3)/XW4N〇
[0041] 取含有重组质粒pET-XW4N的E. coli BL21 (DE3)菌株和只含有pET-28a(+)空质 粒的E. coli BL21(DE3)菌株，以0. 1%的接种量接种于LB(含50yg/mLAmp)培养液中， 37°C培养16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB(含50μ g/mL Amp)培 养液中，振荡培养约2 - 3h(0D538达到0. 6 - 1. 0)后，加入终浓度0. 7mM的IPTG进行诱导， 于20°C继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用pH7. 0的Tris-HCl缓冲 液悬浮菌体后，于冰浴下超声波破碎菌体。以上浓缩的初酶液离心lOmin后，吸取上清并用 Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果参见图1，图1为本发明实施例提供的 亚硝酸盐还原酶的SDS-PAGE分析图，图1中，Marker从上到下依次为116. OkDa，66. 2kDa， 45. OkDa，35. OkDa，25. OkDa，18. 4kDa，14. 4kDa。图1表明，重组亚硝酸盐还原酶在大肠杆菌 中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。
[0042] 实施例3 :纯化的重组亚硝酸盐还原酶XW4NIR的性质测定
[0043] 1、重组亚硝酸盐还原酶XW4NIR的活性分析
[0044] 酶活的大小是根据亚硝酸钠在反应体系中的降解量多少来计量的，即反应体系中 亚硝酸钠的初始含量减去反应一段时间后剩余的亚硝酸钠量。同一时间内，亚硝酸钠降解 的越多，NiRs的活性就越大。取2mL的酶液，将其加入到含有亚硝酸钠200μ g/mL的反应 体系中，37°C反应5h后，测定反应前后体系中亚硝酸钠的含量变化，计算亚硝酸盐还原酶 的活性。酶活力单位定义为：在温度为35°C，pH5. 5条件下，每分钟还原1 μ g亚硝酸盐的酶 量定义为一个酶活力单位U。
[0045] 结果表明，在pH5. 5及37 °C下，该酶对0. 5 % (w/v)亚硝酸钠的比活力为 1548. 12±66. 81U/mg。
[0046] 2、重组亚硝酸盐还原酶XW4NIR的最适pH和pH稳定性测定：
[0047] 酶的最适pH测定：将亚硝酸盐还原酶XW4NIR在37°C下和0. 1M pH3. 0 - 9. 0的缓 冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于0. 1M ρΗ3. Ο - 9. 0的缓冲液 中，在37°C下处理lh、3h和5h，然后在ρΗ5. 5及37°C下进行酶促反应，以未处理的酶液作为 对照。结果参见图2和图3,图2为本发明提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与pH值的曲 线关系图，图3为本发明提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与pH值在不同时间的曲线关系 图。图2和图3表明：亚硝酸盐还原酶XW4NIR的最适pH为5. 5,在pH4. 0 - 7. 5的范围内 维持50%以上的酶活性；经pH5. 5的缓冲液在30°C -50°C下处理lh，仍能保持90%以上的 活性。
[0048] 3、重组亚硝酸盐还原酶XW4NIR的最适温度及热稳定性测定：
[0049] 酶的最适温度测定：在pH5. 5的缓冲液中，于10 - 80°C下进行酶促反应。酶的热 稳定性测定：将同样酶量的酶液置于30°C - 90°C中，处理0 - 5h后，在pH5. 5及37°C下进 行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。结果参见图4和图5,图4为本发明提供的亚硝酸 盐还原酶的相对酶活与温度的曲线关系图，图5为本发明提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶 活与温度在不同时间的曲线关系图。图4和图5表明：亚硝酸盐还原酶XW4NIR的最适温度 为351：，此酶在301：-501：时比较稳定，保温511后相对酶活力仍达到60%以上 ；在371： 下亚硝酸盐还原酶XW4NIR很稳定。
[0050] 4、不同金属离子及EDTA对重组XW4N活力的影响
[0051] 在酶促反应体系中加入10mM的金属离子及EDTA，研究其对酶活性的影响。在 37°C、pH5. 5条件下，以亚硝酸钠为底物测定酶活性。结果参见图6,图6为本发明提供的亚 硝酸盐还原酶的相对酶活与金属离子的柱状图，图6表明，10mM的Ag 2+、Fe3+、Mn2+、Pb2+、C〇 2+、 Ni2+、EDTA等对XW4NIR有不同程度的抑制作用，Cu2+、Mg2+、Na+和Al 3+对XW4NIR有激活作 用，其余金属离子对亚硝酸盐还原酶XW4NIR的影响较小。
[0052] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
[0001] _序歹丨J 表_ <110>云南师范大学 <120>亚硝酸盐还原酶及其编码基囚 <160> 4 <170> Patent In version 3. 3 <210) 1 <211> 313 <212> PRT <2U>人工序列 <400/ 1 Met Gin Ala lie Leu Ser Asp Gly Leu Glu Thr Val Ala Glu Val Lys 15 10 15 Ala Scr Thr Lys Ala Scr Gly Ser Cys Gly Gly Cys Ala Pro Ala Val 20 25 30 Ala Ala Leu Val Lys Leu Ala Lys Ala Gly Gly Gin Arg Ser Gin Lys 35 40 45 Scr Arg Pro Asn Thr Ala Asp Arg Thr Pro Ala Arg Ala Val Cys Scr 50 55 60 Cys Thr Asp Met Ser His Ala Ala Leu Arg Gin Ala lie Asp Glu Ala 65 70 75 BO Met Leu Gin Ala Pro Ala Scr lie Scr Gly Leu Met Glu Ala Lcii Gly 85 90 95 Phe Val Asn Arg Ala Gly Cys Gly lie Cys Arg Pro Ala Val Arg Tyr loo 105 no
[0002] Tyr Ala Glu Leu Ala Ala Ala Asp Ser Val Gly Asn Pro Gly Asn Val 115 120 125 Gin Ser Val Gb Ala Ser Asp Ser Ala Pro Glu Asp Arg Ser Tyr Arg 130 135 140 Gly Val His lie Arg Thr Gly Asp His. Ala Glu Arg Thr Asp Ala Asp 145 150 155 160 Val Glu Arg Gly Met Arg Trp lie Glu Glu Gin Leu Met Arg Asp Trp 165 170 175 Ala Asn Leu Ser Leu Pro Tyr Pro Val Thr Ala Gly lie Ala Glu Ser 180 185 190 Thr His Gly Asp Val Ser Val Leu Val Gin Gly lie Gly lie Ala Ala 195 200 205 Ser Pro Ala Gly Trp Glu Val Tyr Leu Gly Gly His Ala Gin His Pro 210 215 220 Val Arg Glu Ala Gin Leu Val Gly Leu Ala Glu Glu Ala Gly Glu Ala 225 230 235 240 Val Arg Leu Ala Ser Ala Cys Leu Gin Trp Tyr Arg Gin Lys Ser Arg 245 250 255 Phe Gly Glu Pro Leu Trp Gin Trp Val Asp Arg Glu Gly He Val Pro 260 265 270 He Arg Glu His Val Leu Asp Ala Cys Leu Gin Gin Glu Leu Ala Asp 275 280 285 Lys Leu lie Gly Asn Ser Lys Trp Tyr Asp Ala Asn Leu Ala Ser Gly 290 295 300 His Arg Tyr Glu Ala Lys Val Leu Gly 305 310
[0003] <210> 2 <211> 942 <212〉 DNA <2]3> 人工序列 <400> 2 atgcaggcca ttctgtctga cggacttgag acggtcgccg aggtgaaagc gagcacgaag t>0 gcttccggct cttgcggagg ctgcgcacca gcggtcgcag cgctagtgaa gctggcgaag 120 gcggggggac agcggagcca gaagtcgagg ccgaacactg cagaccgcac gccagctaga 180 gctgtatgca gctgcacaga catgagccat gcggccttgc gtcaagctat tgacgaagcg 240 atgctgcagg caccggottc catatccggc ctgatggaag cgttggggtt tgtgaatcgt 300 gctggctgcg gcatalgccg tccggctgtg cgctactatg ctgaactggc tgctgcggac 360 agcgttggga atccggggaa tgttcagtct gttggggctt ccgactcggc acccgaggat 420 aggagttatc gcggtgtgca. cattcggacc ggggaccacg cggagcgaac ggacgccgat 480 gttgaaaggg ggatgcgctg gatcgaggaa cagctgatga gggactgggc gaatctgtca 540 ttgccctatc cggtgacggc gggcatagcg gagagcacgc atggcgacgt cagcgtcctc 600 gtgcagggga tcggcatcgc agcttctccc gctggctggg aggtgtatct gggcggacat 660 gcgcagcatc ctgtacgaga agcccagctt gtcggattgg cagaagaggc gggggaggcg 720 gtgcggctcg cctcggcttg tctgcagtgg tatcgccaga agagccggtt tggcgagccg 780 ctgtggcaat gggtggatcg cgaaggcatc gtaccgatcc gggaacatgt gctggatgca 840 tgcc tgcagc aagagcttgc cgacaagctg atcggaaaca gcaagtggta tgatgcgaac 900 ctggcgtcag gccatcgtta tgaggcgaag gtgcttggat. ga 942 <210> 3 〈211〉 24 <212> DNA <213〉人工序列
[0004] <400> 3 Atgcaggcca ttctgtctga cgga 24 <210> 4 <211> 25 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 4 tcatccaagc accltcgcct cataa
【权利要求】
1. 一种亚硝酸盐还原酶，其特征在于，其具有⑴或（II)所示的氨基酸序列中任意一 个： (I)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； (Π )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸 获得的氨基酸序列。
2. -种编码如权利要求1所述的亚硝酸盐还原酶的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示或者由 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个碱基获得。
4. 包含权利要求2或3所述基因的重组载体。
5. 含有权利要求4或5所述载体的宿主细胞。
6. 包含权利要求2或3所述基因的菌株。
7. 根据权利要求6所述的菌株，其特征在于，所述菌株为重组菌株。
8. 根据权利要求7所述的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、类芽孢杆 菌或乳酸杆菌。
【文档编号】C12R1/19GK104046598SQ201410292553
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】黄遵锡, 刘凌云, 谢振荣 申请人:云南师范大学