专利名称：一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生产方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵生产技术，具体涉及一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶的发酵生产方法。
背景技术：
亚硝酸盐是我国近年来食物中毒的主要化学致病因子之一。亚硝酸盐被吸收进入血液后，可使正常的血红蛋白中狗2+氧化成狗3+，使血红蛋白失去携氧功能，出现组织缺氧， 甚至导致缺氧窒息。亚硝酸盐还是强致癌物亚硝胺的前体物质，潜在着致癌危害。它与胃癌、肝癌、食道癌发生有密切关系。根据流行病学调查发现，癌症高发区居民饮水中亚硝酸盐含量高于低发区。目前，一些地区由于大量使用氮肥、以及使用工业废水和生活污水灌溉，致使水中亚硝酸盐污染严重，致使这些地区蔬菜、粮食、饲料中亚硝酸盐超标也较普遍。此外，我国传统腌泡菜、各种肉灌肠中一直存在亚硝酸盐超标问题。鉴于食物中亚硝酸盐的危害严重，人们在努力寻找降低和去除食品亚硝酸盐的新途径。亚硝酸盐还原酶是催化亚硝酸盐还原的一类酶，可用于消除食品与饲料中亚硝酸盐。 从食品安全角度出发，开发乳酸菌亚硝酸盐还原酶用来降低和消除食品中亚硝酸盐的残留具有广阔前景和安全优势。MRS培养基是目前可用于发酵生产乳酸菌亚硝酸盐还原酶的培养基。MRS用胰蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，柠檬酸铵，葡萄糖，乙酸钠；硫酸镁，硫酸锰等多种成分组成。一般MRS种子液体培养基和液体发酵培养基配方是胰蛋白胨10g，牛肉膏10g， 酵母膏5g，柠檬酸铵2 g，葡萄糖20g，KH2PO4 2g，乙酸钠5g，吐温80 lmL，硫酸镁0.5 g，硫酸锰0.2g，水1000mL。该配方组分多、成本比较高，制备比较复杂。由此造成乳酸菌亚硝酸盐还原酶生产成本高，制备过程复杂等问题。
发明内容
本发明为了解决上述的技术问题而提供一种以较廉价农产品即白菜、西红柿汁作为种子及发酵培养基来生产乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生产方法，该生产方法具有原料易得，可大大节省生产成本，且生产过程简单。本发明技术方案
一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生产方法，包括下列步骤 (1)、菌种活化
将-20°c以下冰箱保存的乳酸菌用常规MRS液体培养基活化培养2 3代； 所述的乳酸菌包括植物乳杆菌{Lactobacillus plantarun)、短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)> 1 Il 片球菌(Pediococcus pentosaceus) > 明串球菌 (Leuconostoc)等乳酸菌；
所述的MRS液体培养基即乳酸细菌培养基，用来培养乳酸菌，使用发明者的名字来命名的，即发明者de Man, Rogosa and Sharp的第一个字母；(2)、将步骤(1)活化后的乳酸菌按接种量3 6% (V/V)接种于种子培养基中，在温度33 37°C下培养10 15 h，获得生产菌种；
所述种子培养基由白菜汁、西红柿汁和水组成，其中还含有0. 2 0. 3g/100mL KH2PO4 ； 其中白菜汁、西红柿汁和水按体积比即白菜汁西红柿汁水为0. 35 0. 50 0. 35 0. 40 0. 10 0. 30 ；
培养基于121°C灭菌15 min ； 所述的白菜汁通过如下方法制备
取新鲜白菜，加等量的水用高速组织打碎机中打碎，再用2层纱布过滤，所得的汁液即为白菜汁；
所述的番茄汁通过如下方法制备
取新鲜番茄清洗，于95°C水中热烫3 5 min，去皮，用组织捣碎机搅碎，再用2层纱布过滤，所得的汁液即为番茄汁；
(3)、将步骤(2)所得的生产菌种按接种量为5 10% (V/V)接种至发酵培养基中，在 33 37°C培养Mh，获得乳酸菌发酵液；
所述发酵培养基由白菜汁、西红柿汁和水组成，其中还含有0. 2 0. 6g/100mL KH2PO4 ； 白菜汁、西红柿汁和水按体积比即白菜汁西红柿汁水为0. 35 0. 50 0. 35 0. 40 0. 10 0. 30 ；
培养基于121°C灭菌15min ； 所述的白菜汁通过如下方法制备
取新鲜白菜，加等量的水用高速组织打碎机中打碎，再用2层纱布过滤，所得的汁液即为白菜汁；
所述的番茄汁通过如下方法制备
取新鲜番茄清洗，于95°C水中热烫3 5 min，去皮，用组织捣碎机搅碎，再用2层纱布过滤，所得的汁液即为番茄汁；
(4)、用氢氧化钠调节步骤(3)所得的乳酸菌发酵液的pH值为6.3 6. 5，再添加0. 4 0. 6mg/mL亚硝酸钠，在37°C培养32 48 h，获得乳酸菌亚硝酸盐还原酶发酵液；
(5)、通过常规的提取分离酶的方法从步骤(4)所得的乳酸菌亚硝酸盐还原酶发酵液提取亚硝酸盐还原酶，即离心收集菌体；
将菌体悬浮于浓度为20mM，pH为7. 0的磷酸缓冲液使用超声波细胞破碎法，其工作参数为功率600 w，超声时间lOmin，占空比为& :2s，然后离心收集上清液，向上清液加硫酸铵粉末使达到30%饱和度，离心收集上清液，再加硫酸铵粉末使达到60%饱和度使酶蛋白析出，用蒸馏水对酶蛋白沉淀透析得透析液；
(6)、将步骤(5)所得的透析液用聚乙二醇粉末浓缩5-6倍，冷冻干燥即得到亚硝酸盐还原酶。本发明生产的乳酸菌亚硝酸盐还原酶可用于除去食品、饲料和环境中的亚硝酸盐残留，提高食品安全质量。本发明的有益效果
本发明的一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生产方法，由于利用白菜和西红柿汁代替传统的原料组份多、成本比较高，制备比较复杂的MRS培养基进行乳酸菌亚硝酸盐还原酶的种子培养和发酵培养，因此，不仅能大大降低生产成本，而且本发明的生产方法也比传统的使用MRS培养基的生产方法具有生产工艺简单，操作更加简便等优点。
图1是亚硝酸钠含量标准曲线图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进一步详细描述，但并不限制本发明。本发明的实施例中所用的乳酸菌为植物乳杆菌{Lactobacillus plantarun), 短_1 杆菌(Lactobacillus brevis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) > BJ Φlif
洲COZ7O1SiOC人均从上海工业微生物所购买。本发明的实施例中所用的种子培养基及发酵培养基中所用的白菜汁、西红柿汁的制备方法如下
番茄汁
取新鲜番茄清洗，于95°C水中热烫3 5 min，去皮，用组织捣碎机搅碎，再用2层纱布过滤，取汁液，即为番茄汁； 白菜汁
取新鲜白菜，加等量的水用高速组织打碎机中打碎，再用2层纱布过滤，取汁液即为白菜汁。亚硝酸盐还原酶酶活测定方法(见Ldal S. Morita Y. phlant Cell physiol 1973.14:561)
测定过程所用的溶液为
(1)、0.1 mol / L Tris-HCl,ImL, pH7.5 ；
(2)、0.01 mol / L NaNO2,0. 3mL ；
(3)、0.02 mol / L C12H14C12N2,0. ImL ；
(4)、0.12mol / 1 NADPH，0. ImL ；
(5)、本发明所得的一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶，lmg/mL，0.5mL,
先将ImL的Tris-HCl、0. 3mL的NaN02、0. 3mL的C12HwC12N2 3种溶液加入试管，再加入本发明所得的一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶0. 5 mL，然后加入0. 1 mL的NADPH液在30. 0 下保温20min，取出摇动至无色时立即吸出0. ImL反应液，加入5. 9ml去离子水中，再加入1 mL对氨基苯磺酸和1 mL盐酸萘乙二胺显色，置半小时后在538 nm波长下比色测定亚硝酸盐的变化，将所得数据，根据标准曲线方程，求出亚硝酸钠的含量后，通过如下公式计算酶活。上述测定过程中以等量的蒸馏水代替本发明所得的一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶，按上述方法处理，做空白对照。酶活计算公式如下。
Y:酶活力(U)
U为酶的活力单位，IU=I μ g亚硝酸盐/mL. h即每小时降解1 μ g亚硝酸钠的酶量为一个酶活力单位；
Xl 亚硝酸钠初始值(ug/mL)； X2 亚硝酸钠剩余值(ug/mL)； t 酶催化时间(h)； 亚硝酸钠标准溶液的配制
准确称取0. IOOOg于干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混勻。此溶液每毫升相当于200ug的亚硝酸钠。标准曲线的制作
准确吸取0，0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0，1. 5，2. 0，2. 5mL亚硝酸钠标准使用液(相当于0,1, 2,3,4. 5,7. 5，10，12. 5ug亚硝酸钠)，分别置于50mL容量瓶中，加水40mL左右，摇勻，滴加 2mL对氨基苯磺酸溶液，混勻，避光静置3min，再加入ImL盐酸萘乙二胺溶液，定容至50mL， 混勻，避光静置15min，在波长538nm处测定吸光值，根据实验数据作亚硝酸钠含量标准曲线图。本发明除培养基外所使用的各种原料亚硝酸钠、NADPH、C12H14C12N2、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。实施例1
(1)、菌种活化
将植物乳杆菌按5%接种量接种于MRS培养基中，在30°C条件下培养24h得第一代菌种，再将第一代菌种以3% (V/V)接种量接到MRS培养基，在30°C培养24h得第二代菌种；
(2)、将步骤(1)所得的第二代菌种以5%(V/V)接种量接到种子培养基中，在温度33 37°C下培养10-15 h，获得生产菌种；
所述种子培养基由白菜汁、西红柿汁和水组成，白菜汁、西红柿汁和水按体积比计算， 即白菜汁西红柿汁水为0. 35 0. 35 0. 30，其中还含有0. 2 0. 3g/100mL KH2PO4,培养基于121°C灭菌15 min ；
(3)、将步骤(2)所得的生产菌种以5%(V/V)接种量接种到发酵培养基中，在33°C培养 Mh，获得乳酸菌发酵液；
所述发酵培养基由白菜汁、西红柿汁和水组成，白菜汁、西红柿汁和水按体积比计算， 即白菜汁西红柿汁水比例为0. 35 0. 35 0. 30，其中还含有0. 2 0. 6g/100mL KH2PO4 ； 培养基于121°C灭菌15min ；
(4)、用lmol/L的氢氧化钠调节步骤(3)所得的乳酸菌发酵液的pH值至6.3，再添加 0. 4mg/mL NaNO2，在37°C培养32 h，获得乳酸菌亚硝酸盐还原酶发酵液；
(5)、通过常规的提取分离酶的方法从步骤(4)所得的乳酸菌亚硝酸盐还原酶发酵液提取亚硝酸盐还原酶，即离心收集菌体；
将菌体悬浮于浓度为20mM，pH为7. 0的磷酸缓冲液中，在冰水浴中用常规超声波细胞破碎法进行细胞破碎，控制功率为600w，时间8min，然后离心收集上清液，向上清液加硫酸铵粉末使达到30%饱和度，离心收集上清液，再加硫酸铵粉末使达到60%饱和度使酶蛋白析出，用蒸馏水对酶蛋白沉淀透析得透析液；
7(6)、将步骤(5)所得的透析液用聚乙二醇粉末浓缩5倍，冷冻干燥即得到亚硝酸盐还原酶，经测定酶活为2. IXlO3U /g。实施例2
(1)、菌种活化
将短乳杆菌按5%接种量接种于MRS培养基中，在30°C条件下培养24h得第一代菌种， 再将一代菌种以5% (V/V)接种量接到MRS培养基，在30°C培养24h得第二代菌种；
(2)、将步骤(1)所得的第二代菌种以5%(V/V)接种量接到种子培养基中，在温度37°C 下培养15 h，获得生产菌种；
所述种子培养基由白菜汁、西红柿汁和水组成，其中还含有0. 3g/100mL KH2PO4 ； 白菜汁、西红柿汁和水的比例为0. 50 0. 40 0. 10 ； 培养基于121°C灭菌15 min ；
(3)、将步骤(2)所得的生产菌种以10%(V/V)接种量接种到发酵培养基中，在35°C培养Mh，获得乳酸菌发酵液；
所述发酵培养基由白菜汁、西红柿汁和水组成，其中还含有0. 6g/100mLKH2P04 ； 白菜汁、西红柿汁和水的比例为0. 50 0. 35 0. 15 培养基于121°C灭菌15min ；
(4)、用lmol/L的氢氧化钠调节步骤(3)所得的乳酸菌发酵液的pH值至6.5，再添加 0. 6mg/mL NaNO2，在37°C培养48 h，获得乳酸菌亚硝酸盐还原酶发酵液；
(5)、通过常规的提取分离酶的方法从步骤(4)所得的乳酸菌亚硝酸盐还原酶发酵液提取亚硝酸盐还原酶，即离心收集菌体；
将菌体悬浮于浓度为20mM，pH为7. 0的磷酸缓冲液中，在冰水浴中用常规超声波细胞破碎法进行细胞破碎，控制功率为600w，时间8min，然后离心收集上清液，向上清液加硫酸铵粉末使达到30%饱和度，离心收集上清液，再加硫酸铵粉末使达到60%饱和度使酶蛋白析出，用蒸馏水对酶蛋白沉淀透析得透析液；
(6)、将步骤(5)所得的透析液用聚乙二醇粉末浓缩6倍，冷冻干燥即得到亚硝酸盐还原酶，经测定酶活为2. 5 X IO3U /g。应用实施例1
选取经室温保持半年的市售腌制腊肉，称取5g的倒入高速组织勻浆捣碎机中，加入 IOOml去离子水，12，000r/min运行;3min，然后将勻浆液全部倒入三角瓶中，密封静置lh， 取10 ml 3，000离心lOmin，吸取5ml上清采用国标法(中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009. 33 — 2003,食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定·北京，2003年·)测定亚硝酸钠含量。结果，腊肉中的亚硝酸钠含量最高到达42. 8 mg/kg(比1996国家标准高出42. 6%)； 我国1996年颁布的《食品添加剂使用卫生标准》规定肉制品不得超过30mg/kg。称取40g腊肉倒入高速组织勻浆捣碎机中，加入IOOml去离子水，12，000r/min运行3min，然后将勻浆液全部倒入三角瓶中，加入实施例2所得的亚硝酸盐还原酶5mg，摇勻， 密封30°C培养12h。吸取5ml测定亚硝酸钠剩余量，结果是5. 2 mg/kg。结果表明本发明所得的亚硝酸盐还原酶能有效去除腊肉中亚硝酸钠。以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生产方法，其特征在于包括如下步骤(1)、菌种活化将-20°c以下冰箱保存的乳酸菌用常规MRS液体培养基活化培养2 3代；所述的乳酸菌包括植物乳杆菌{Lactobacillus plantarun)、短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)> 戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)或明串球菌 (Leuconostoc)；(2)、将步骤(1)活化后的乳酸菌按接种量3 6% (V/V)接种于种子培养基中，在温度33 37°C下培养10-15 h，获得生产菌种；所述种子培养基由白菜汁、西红柿汁和水组成，其中还含有0. 2 0. 3g/100mL KH2PO4, 于 121°C 灭菌 15min ；其中白菜汁、西红柿汁和水按体积比即白菜汁西红柿汁水为0. 35 0. 50 0. 35 0. 40 0. 10 0. 30 ；(3)、将步骤(2)所得的生产菌种按接种量为5 10% (V/V)接种至发酵培养基中，在 33 37°C培养Mh，获得乳酸菌发酵液；所述发酵培养基由白菜汁、西红柿汁和水组成，其中还含有0. 2 0. 6g/100mL KH2PO4, 于 121°C 灭菌 15min ；白菜汁、西红柿汁和水按体积比即白菜汁西红柿汁水为0. 35 0. 50 0. 35 0. 40 0. 10 0. 30 ；(4)、用氢氧化钠调节步骤(3)所得的乳酸菌发酵液的pH值为6.3-6. 5，再添加0. 4 0. 6mg/mL亚硝酸钠，在37°C培养32 48h，获得乳酸菌亚硝酸盐还原酶发酵液；(5)、通过常规的提取分离酶的方法从步骤(4)所得的乳酸菌亚硝酸盐还原酶发酵液提取亚硝酸盐还原酶，即离心收集菌体；将菌体悬浮于浓度为20mM，pH为7. 0的磷酸缓冲液中，在冰水浴中用常规超声波细胞破碎法进行细胞破碎，超声过程控制功率600w，时间8 min，然后离心收集上清液，向上清液加硫酸铵粉末使达到30%饱和度，离心收集上清液，再加硫酸铵粉末使达到60%饱和度使酶蛋白析出，用蒸馏水对酶蛋白沉淀透析得透析液；(6)、将步骤(5)所得的透析液用聚乙二醇粉末浓缩5-6倍，冷冻干燥即得到亚硝酸盐还原酶。
2.如权利要求1所述的一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生产方法，其特征在于步骤(2)中所述的种子培养基中所述的白菜汁的制备方法为取新鲜白菜，加等量的水用高速组织打碎机中打碎，再用2层纱布过滤，所得的汁液即为白菜汁；所述的番茄汁的制备方法为取新鲜番茄清洗，于95°C水中热烫3 5min，去皮，用组织捣碎机搅碎，再用2层纱布过滤，所得的汁液即为番茄汁。
3.如权利要求1或2所述的一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生产方法，其特征在于步骤 (3)中所述的发酵培养基中所述的白菜汁的制备方法为取新鲜白菜，加等量的水用高速组织打碎机中打碎，再用2层纱布过滤，所得的汁液即为白菜汁；所述的番茄汁的制备方法为取新鲜番茄清洗，于95°C水中热烫3 5 min，去皮，用组织捣碎机搅碎，再用2层纱布过滤，所得的汁液即为番茄汁。
全文摘要
本发明公开了一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生产方法，即将乳酸菌用MRS液体培养基活化培养2～3代后所得的活化菌种用白菜汁与西红柿汁等组成的种子培养基及发酵培养基培养后获得乳酸菌发酵液，将乳酸菌发酵液用氢氧化钠调pH值至6.3-6.5，再添加0.4～0.6mg/mL亚硝酸钠，37℃培养32～48h后得到的乳酸菌亚硝酸盐还原酶发酵液离心分离收集菌体，再进一步破碎菌体细胞，收上清液，再经沉淀、透析、冷冻干燥等步骤最终得到亚硝酸盐还原酶。本发明的一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生产方法，不仅生产成本低，而且具有生产工艺简单，操作更加简便等优点。
文档编号C12R1/24GK102286438SQ20111020797
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月25日 优先权日2011年7月25日
发明者丁少南, 何婷婷, 吕玉涛, 管世敏, 龚钢明 申请人:上海应用技术学院