专利名称：棉花GhUXS3基因、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及棉花(ihUXS3基因、其编码蛋白及应用。
背景技术：
棉纤维品质由棉纤维发育决定。棉纤维发育历经纤维原始细胞分化突起、纤维细胞伸长(初生壁形成期)、次生壁加厚、脱水成熟4个阶段。初生壁形成期和次生壁加厚期是棉纤维品质形成的关键时期。其中初生壁形成期主要是木葡聚糖、木聚糖和果胶等非纤维素物质的合成，决定棉纤维长度。次生壁加厚期则是纤维素大量沉积过程，与纤维强力直接相关。因此，明确棉纤维发育过程中影响棉纤维强力品质形成的基因及其作用是利用生物技术方法提高棉纤维强力品质的关键所在。研究发现棉纤维强度除与纤维素结晶度相关外，还和非纤维素的交联相关。非纤维素成分主要包括木葡聚糖(Xyloglucan)、木聚糖(xylan)、果胶多糖等。木葡聚糖、木聚糖与纤维素微纤丝间以氢键相连，与纤维素微纤丝一起形成网状结构，深埋在果胶多糖基质中。据推测纤维素和非纤维素物质交联结构的形成，会导致初生壁形成期大约36%的高分子非纤维素聚合物含量下降。纤维素微纤丝和非纤维素交联加固了细胞壁结构，从而使得纤维强力明显增强。尿苷二磷酸-木糖(UDP-Xylose)是构成非纤维素多糖木葡聚糖、木聚糖、果胶等核苷糖形成所必须的底物。主要是通过尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖(Glucose) 形成尿苷二磷酸-葡糖醛酸(UDP-glucuronate)，进而由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶 (UDP-Glucuronate Decarboxylase，UXQ催化尿苷二磷酸-葡糖醛酸而形成。因此UXS作为一种不可逆酶，是实现己糖向戊糖的转化的关键酶，影响非纤维素多糖的合成。在植物上已有多篇有关UXS基因的克隆报道，其中在烟草上，该基因的反义基因成功表达导致葡萄糖/木糖比例增高，同时其转基因植株的维管组织结构发生变化，木聚糖含量在烟草次生壁中减少。在棉花上该基因尚无相关报道。但有研究表明其底物葡糖醛酸在棉纤维从初生壁到次生壁转换过程中，含量逐渐升高，在次生壁开始加厚时，含量最高，随后开始下降。而木糖在纤维次生壁形成期含量也有增高趋势。可见UXS的表达必将对木糖合成，以及细胞壁非纤维素多糖含量产生影响，并进而影响到纤维素微纤丝和非纤维素交联。综合以上研究结果表明，UXS基因对棉纤维品质形成的内在机理有重大意义，在纤维品质遗传改良中具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉花尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因((ihUXS； )及其编码蛋白。本发明的另一目的是提供棉花(ihUXS3基因在提高棉花棉纤维品质中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种棉花(ihUXS3基因编码的蛋白，其具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还提供编码上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本发明还提供含有上述基因的载体。本发明还提供含有上述载体的宿主细胞。本发明还提供含有上述基因的转化植物细胞。本发明进一步提供棉花(ihUXS3基因在改善棉纤维品质中的应用。具体地，本发明基于拟南芥四条尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶(AT3g6^30， AT5g59290, AT2g47650和AT3g46440)的编码序列，利用BLASTN在美国国立生物技术信息中心网站(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)棉花的表达序列标签数据库中搜索相似性较高的EST序列，结合电子拼接、RT-PCR以及RACE技术克隆得到棉花尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因，命名为(ihUXS3。利用半定量RT-PCR检测(ihUXS3基因在陆地棉“中棉所8号”和海岛棉 “Pima90-53”棉纤维不同发育时期的表达量。发现其在“中棉所8号”中的表达量要高于 “Pima90-53”，且在“Pima90-53”中表达量的变化较为平缓。在初生壁向次生壁合成转化时
表达量达到最高。将(ihUXS3基因与原核表达载体pET_3h连接，转入大肠杆菌DH5 α，在IPTG诱导条件下，表达融合蛋白。分离纯化该融合表达蛋白，并在适当条件下，作用于底物UDP-葡萄糖醛酸，反应完成后，经液相色谱分析，反应液中存在产物UDP-木糖。表明(ihUXS3基因表达的融合蛋白能够促进UDP-葡萄糖醛酸向UDP-木糖的转化，(ihUXS3基因编码尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶。采用农杆菌浸花法(floral dip)将反义的(ihUXS3基因转入Columbia型拟南芥中。转入反义(ihUXS3基因的拟南芥抽薹比野生型更长更粗，莲座叶长度增加，茎秆韧度增强；转基因拟南芥植株中的葡萄糖和木糖比下降，且纤维素含量下降。由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果(1)本发明提供了棉花(ihUXS3基因及其编码的蛋白，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示
(2)本发明提供的棉花(ihUXS3基因在纤维强力不同的棉种中，表达量不同。(3)本发明提供的棉花(ihUXS3基因与棉花纤维发育有重要关系，可以利用基因工程手段对棉纤维品质和性状进行改良。
图1为本发明棉花(ihUXS3基因的ORF RT-PCR扩增结果，其中，M为DL 2000Marker, 1 为 GhUXS30RF 扩增产物。图2为本发明棉花(ihUXS3基因与拟南芥UDP-葡糖醛酸脱羧酶基因编码的蛋白多重比较结果，其中下划线标注为该基因家族保守域focxGxxG，YxxxK和kr。图3为本发明棉花(ihUXS3基因5，RACE及3，RACE扩增产物，其中M为DL 2000Marker, 1为5，RACE扩增产物，2为3，RACE扩增产物。图4为本发明棉花(ihUXS3基因在棉纤维不同发育时期半定量RT-PCR结果。图5为转棉花(ihUXS3基因的E. coli BL21 (DE3)诱导前和诱导后目的融合蛋白
4表达的SDS-PAGE检测结果，箭头所示为目的融合蛋白；M:蛋白标准分子量，1 :BL21(DE3) Plys空菌株未经IPTG诱导取得的总蛋白，2-3 :pET-32a(+)空载体未经IPTG诱导取得的总蛋白；4-6 :GhUXS3-pET-32a(+)未经IPTG诱导取得的总蛋白；7 :BL21 (DE3)plys空菌株经 IPTG诱导3小时后取得的总蛋白；8-9 :PET-32a(+)空载体经IPTG诱导3小时后取得的总蛋白；10-12 :GhUXS3-pET-32a(+)经IPTG诱导3小时后取得的总蛋白。图6示例本发明棉花(ihUXS3基因反义cDNA转化拟南芥的幼苗。图7示例(ihUXS3反义cDNA转化拟南芥阳性植株。A为野生型对照，B为转基因植株。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1棉花(ihUXS3基因的克隆(1)首先利用拟南芥四条尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶(AT3g6^30，AT5g59290, AT2g47650和AT3g46440)的编码序列，利用tBLASTN在NCBI棉花表达序列标签数据库中搜索相似性较高的EST序列，利用DNASTAR软件对检索获得的EST序列(C0494958，DW504337 和DW515118)进行电子拼接，获得具有完整开放阅读框的拼接序列(ihUXS3。(2)依拼接序列设计特异性引物，同时在上、下游引物分别引入McI和MlI酶切位点(下划线部分)。(ihUXS3基因的上、下游引物分别为上游引物5，-CTAGAGCTCATGGCGACAGATTCATC-3，，下游引物5，-GCGGTCGACTCACTCTTTAGAGATTCC-3’；(3)利用设计的特异性引物分别以陆地棉“中棉所8号”和海岛棉“Pima90-53”开花后21天的棉纤维cDNA为模板进行PCR扩增，获得(ihUXS3基因目的条带(图1)；(4)将回收得到的(ihUXS3基因的PCR产物与pGM_T连接，采用天根生化科技(北京)有限公司的pGM-T克隆试剂盒克隆目的片段，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌 T0P10感受态细胞，并筛选阳性克隆，由上海生物工程有限公司进行测序，测序与预期结果一致，且两棉种基因序列无差异。(ihUXS3基因开放阅读框序列为SEQ ID NO. 1下划线部分 (长1038bp)，对应氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。实施例2棉花(ihUXS3基因与5个拟南芥UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因编码蛋白的氨基酸序列进行相似性分析利用BLAST (bl2seq)对棉花(ihUXS3基因以及5个拟南芥UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因编码蛋白的氨基酸序列进行相似性分析，结果显示棉花(ihUXS3基因与拟南芥UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因编码蛋白的氨基酸序列之间相似性分布在66% 91%之间。说明棉花(ihUXS3基因属于UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶家族。利用DNAMAN软件对以上蛋白序列进行多重序列比较分析，结果如图2所示。棉花GhUXS3基因编码的蛋白存在着UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶蛋白的保守域GxxfocxG，YxxxK和 Ser0同样说明棉花(ihUXS3基因属于UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶家族。实施例3棉花(ihUXS3基因5，和3，非翻译区(UTR)序列的克隆以棉花(ihUXS3基因开放阅读框序列为基础，按Clontech RACE试剂盒要求，分别设计5’ RACE及3’ RACE引物，具体引物序列如下
5，RACE 引物GSP 5' -TCGCTTGGCAAGTCCCAGCATGT-3‘NGSP 5' -ATTGGAGAAGCTGGACACGCAAGGT-3‘3，RACE 引物GSP 5' -CACTTCGCGGTGAACCACTAACGGT-3‘NGSP 5' -GCTAGGTTGGGAGCCGAAAGTCAAGT-3‘以陆地棉“中棉所8号”和海岛棉“Pima90-53”开花后21天的棉纤维cDNA为材料，按Clontech RACE试剂盒操作步骤完成5’端及3’端非翻译区序列扩增，获得目的条带，GhUXS35' RACE长45^p，3，RACE长488bp (图；3)。对PCR产物进行测序，最后分析得 GhUXS35' UTR长116bp，3，UTR长352bp。将测序结果与(ihUXS3基因开放阅读框拼接，获得全长cDNA序列，且两棉种基因序列无差异(SEQ ID NO. 1)。实施例4半定量RT-PCR使用天根生化科技(北京)有限公司的RNAplant提取试剂盒提取“中棉所8号 “和海岛棉“Pima90-53”开花当天胚珠以及开花后(day post anthesis，DPA) 3、5、10、15、 20、25、30、35 天的纤维 RNA0然后用TaKaRa公司PrimeScript 1st cDNA synthesis试剂盒合成以上9个时期单链cDNA。利用BECKMANDU800仪器测定各cDNA浓度后，对棉花(ihUXS3基因在棉纤维不同发育时期的表达进行半定量RT-PCR分析。内参选用EFl α，其引物序列如下 EFl α F 5' -GAGCCACCAAGTACTACTGCAC-3‘EFl α R 5' -CCACCAATCTTGTACACATCC-3‘半定量RT-PCR结果(图4)显示，棉花GhUXS3基因在10-25DPA表达量较高，25DPA 后表达量呈下降趋势。在棉纤维发育同一时期，“中棉所8号”表达量要高于“Pima90-53”， 而“Pima90-53”棉纤维不同时期表达量变换较“中棉所8号”平缓。实施例5(ihUXS3基因原核表达载体的构建及转化菌株的诱导表达(1)原核表达载体的构建和转化子的获得利用McI和MlI分别对实施例1中克隆得到的(ihUXS3基因的开放阅读框PCR 产物和原核表达载体pET-3h (+)的质粒进行双酶切并回收目的片段。将表达载体与目的基因片段进行连接，转入大肠杆菌DH5 α，经过PCR和酶切检测筛选含重组质粒的阳性克隆，并将含有阳性克隆的质粒利用热激法转入BL21 (DE3)菌株中，并进步挑取阳性克隆，经质粒提取、酶切检测获得含有重组质粒pET-32a(+)-(ihUXS3的大肠杆菌工程菌株。(2)重组蛋白的诱导表达与鉴定将含有以上各类型的重组质粒和含有空质粒(对照)的BL21 (DE3)菌株在， IPTG的终浓度为1. Ommol/L的条件下诱导2小时后，进行SDS-PAGE垂直式凝胶电泳，其中分离胶为12%，浓缩胶为5(%。结果如图5所示，经IPTG诱导的含有去掉跨膜区重组质粒pET-32a(+)_GhUXS3的大肠杆菌BL21(DE!3)与含空质粒对照相比，在60KDa出现一条表达量明显增高的差异带。生物信息学预测可表达的(^iUXS3目的融合蛋白包括(ihUXS3蛋白(约40KDa)和ρΕΤ_3^ι标签蛋白(约20. 7KDa)，分子量大约为60KDa。因此，该差异带是pET_32a (+) _GhUXS3基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的目的融合蛋白。
实施例6(ihUXS3反义cDNA转化拟南芥(1)反义表达载体的构建设计用于构建反义表达载体的引物。在(ihUXS3基因的开放阅读框两端添加酶切位点Mc I和)(ba I (下划线部分)，序列如下A-UXS3F 5' -GAGCTCGATGGCGACAGATTCATC-3’A-UXS3R 5' -GCTCTAGACTCTTCAGAGATTCCAAGCCTC-3‘以该引物进行PCR反应，并回收目的片段，与pGM-T载体连接，热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取阳性克隆提取质粒进行酶切检测并测序，得到中间载体 PGEM-UXS3。将中间载体pGM-UXS3和真核表达载体ρΒΙ121分别用I和XbaI双酶切，电泳酶切产物，回收目的片段，然后进行连接，热击法转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取阳性克隆，进行质粒提取，酶切检测和测序，获得反义的真核表达载体PBI121-UXS3。(2)转化拟南芥将质粒pBI121-UXS3转化农杆菌株GV3101，采用农杆菌浸花法(floral dip)将反义的(ihUXS3基因转入Columbia型拟南芥。待拟南芥种子成熟，收取种子(转基因T1代) 进行干燥并春化后，种植于MS筛选培养基上(卡那霉素100mg/L)，筛选得到转基因阳性苗 (图6)，移栽于蛭石中培养，并进行PCR检测进一步确定转基因阳性植株。获取T3代阳性拟南芥转基因植株，进行表型和细胞壁多糖含量分析。转入反义(ihUXS3基因的拟南芥与野生型拟南芥相比，表型发生显著变化，特别是叶片长度明显增大，抽薹较长、较粗，茎秆韧度增强(图7)。抽薹长度(茎长)和粗细(茎粗)都表现出极显著差异，抽薹比野生型长约8-12cm，薹的粗细(茎粗)也均显著大于野生型，增粗9-20%，莲座叶长较野生型分别增加3-4mm，茎秆韧度增强程度大于30%。为进一步确定(ihUXS3基因在细胞壁多糖转化中的功能，分别利用蒽酮比色法以及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生的方法测定拟南芥中纤维素和非纤维素多糖的含量。转入反义(ihUXS3基因的拟南芥细胞壁中纤维素含量极显著下降，比野生型低16. 35% -30. 50%。PMP方法测定转基因拟南芥细胞壁中非纤维素葡萄糖(Glc)和木糖 (Xyl)含量有所减少，葡萄糖和木糖比(Glc/Xyl)有所下降，下降幅度达23. 58% -40. 57%。 表明抑制(ihUXS3基因的表达，影响了 Glc和Xyl的合成，从而影响细胞壁纤维素和非纤维素多糖的形成和含量，影响细胞壁结构，导致叶片更宽大，薹更长、更粗，茎秆韧度增强，营养生长旺盛，生殖生长状况也得到大幅度提高。综合上述分析结果，(ihUXS3基因可能会影响棉纤维品质。(ihUXS3基因的低量表达，可能导致棉纤维细胞壁中纤维素含量大幅下降，非纤维素多糖物质即木葡聚糖、木聚糖或果胶多糖含量的增多，形成类似于拟南芥的表型特征变化，进而影响到棉纤维长度和强度。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.棉花(ihUXS3基因编码的蛋白，其特征在于，其具有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.含有权利要求2或3所述基因的转化植物细胞。
7.权利要求2或3所述的基因在改善棉纤维品质中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种棉花尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因(GhUXS3)及其编码的蛋白，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明提供的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶是棉纤维发育过程中非纤维素物质形成的一个关键酶，影响棉纤维品质，因此本发明为棉纤维品质改良基因工程提供了新的候选基因，利用本发明获得的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧基因(GhUXS3)可为进一步转化棉花从而提高棉纤维品质奠定基础，具有较大的经济效益和应用价值。
文档编号C12N9/88GK102260661SQ20111020754
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月22日 优先权日2010年8月5日
发明者张冬梅, 张桂寅, 潘玉欣, 王省芬, 马峙英 申请人:河北农业大学