专利名称：检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明所涉及的一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用，属于病毒核酸检测领域，适用于临床及科研中对于牛病毒性腹泻病毒感染的快速定量检测，还涉及应用于疫苗生产用牛血清及牛睾丸细胞源猪瘟兔化弱毒疫苗等生物制品中 BVDV污染的检测。
背景技术：
牛病毒性腹泻是由黄病毒科瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒引起的一种在世界范围内广泛传播的牛羊传染病。BVDV是危害养牛业、养羊业和养猪业的重要病原之一，能引起感染动物产生一系列复杂的临床症状，包括病毒性腹泻、粘膜病、持续感染与免疫耐受、 繁殖障碍、血小板减少与出血综合征等[沈敏，王新华，钟友刚.牛病毒性腹泻病毒致病机理研究进展.动物医学进展，2002，23 ) 1-4] 0欧洲国家在20世纪60年代牛肉和奶牛中 BVDV的阳性率就已经达到了 53% -73%，90年代以来要找到BVDV阴性的牛已是难事了。而近年来，我国各地几乎都有该病的报道，并且患病动物包括猪、牛、牦牛、羔羊、山羊和鹿等多种动物。目前，疫病的早期特异性诊断及疫苗接种等是有效预防控制牛病毒性腹泻的重要手段。同时随着生物制品研究及生产过程中对牛血清的使用量日益加大，牛血清中BVDV 的检测也成为疫苗生产、质控过程中十分重要的一个环节。检测BVDV的方法很多，常采用的检测方法主要包括血清学中和试验、细胞分离培养、酶联免疫吸附试验、PCR技术等。血清学方法多存在费时、费力、准确率低等缺点。我国诊断BVDV国家标准技术采用培养细胞分离病毒的方法，但该方法费时费力，加之病毒分离率低，有些非致细胞病变型BVDV在细胞培养中不出现细胞病变，因而不利于大规模应用检测。而分子生物学的常规方法虽然在某些方面可以弥补，但假阳性、环境污染、重复性不高等不足限制了推广应用。近年来逐渐发展起来的实时荧光定量PCR技术是在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物和一个特异性的荧光探针或荧光染料， 利用能够实时监测的荧光PCR仪来检测病原体靶核苷酸序列的技术。它不但克服了传统 PCR技术的缺点，而且具有结果直观可靠、特异性强、灵敏度高、快速简单等优点，因而成为一种越来越重要的检测技术。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该PCR试剂盒不仅可适用于目前市场上所有类型的荧光定量PCR仪，更重要的是能够快速准确的对牛病毒性腹泻病毒进行定量检测。本发明的另一个目的是提供一种上述荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应用，包括临床及科研中对于牛病毒性腹泻病毒感染的快速定量检测和对牛血清及猪瘟兔化弱毒疫苗等生物制品中是否污染牛病毒性腹泻病毒进行监测。
基于上述目的，本发明采用的主要技术方案有1.引物探针设计通过分析牛病毒性腹泻病毒各基因片段保守性，并结合荧光PCR引物探针设计特点，确定牛病毒性腹泻病毒的5’UTR序列片段作为本方法中荧光PCR引物探针设计的模板。从GenBank数据库下载所有已知牛病毒性腹泻病毒的5，UTR序列，利用DNAMar 软件进行同源性排序分析比较，选出在牛病毒性腹泻病毒5’ UTR序列中种内保守种间特异的核苷酸片段，然后利用I^imer Express及DNAMar软件设计多对检测牛病毒性腹泻病毒的引物和探针，进一步实验筛选出最佳引物和探针组合，确定为本方法中所使用的引物和探针。其中引物探针序列如下上游引物PF :5，-GAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGG-3，(SEQ ID NO 1)下游引物PR :5，-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3，(SEQ ID NO 2)荧光探针PB :5，FAM-AGATGCCACGTGGACGAGGGC-BHQ 13，(SEQ ID NO 3)2.病毒RNA的提取2. 1组织样品RNA的提取取待检样本50 IOOmg于无菌1. 5ml离心管中，按1 5 比例加入PBS液，勻浆仪充分勻浆，4000rpm离心lOmin，取上清液200 μ L于新的无菌1. 5mL
离心管中，编号备用。取若干个1.5mL灭菌(因待检样品份数而定)无RNA酶污染的离心管，作好标记。各加入600yL RNA提取液，然后分别加入上述相应编号的样本以及试剂盒中的阴、 阳性对照各200 μ L，吸打混勻；加入200 μ L氯仿，振荡混勻，静置5min，12，OOOrpm离心 IOmin ；分别吸取各管中的上层液相(切勿吸入下层液体)转移至新的1. 5ml无RNA酶污染的离心管中，加入200 μ L-20°C预冷的异丙醇，作好标记，颠倒混勻。静置5min，12，OOOrpm 离心IOmin ；轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600 μ L 75%乙醇，颠倒洗涤，12，OOOrpm离心5min ；轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体，4，OOOrpm离心 lOsec，用微量加样器尽量将残余液体吸干，室温干燥1 5min ；加入20 μ L DEPC水，轻弹混勻，溶解管壁上RNA，保存-18°C以下备用。2. 2液体样品RNA的提取(如全血，血清，鼻咽拭子，细胞培养上清等)直接取 200 μ L样本于无菌1. 5ml离心管中，作好标记，分别加入600 μ L RNA提取液，然后再按上述组织RNA的提取方法进行。3. RT-PCR反应体系的配制配制25 μ L 的反应体系BVDV RT-PCR Mix 21 μ L、AMV 反转录酶 0. 5 μ L、Taq DNA 聚合酶0. 5 μ L、RNA模板3 μ L。4. RT-PCR反应参数的设置第一步:42°C，20min,95°C，3min, Icycle ；第二步:95°C，5sec,60°C，40sec(收集荧光信号)，40cycles。5.结果判定结果分析条件设定点击分析界面，取3 10或3 15个循环的荧光信号确定基线(baseline)。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品及阴性样本的扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，不出现Ct值并且与阳性对照的指数期相交为准。
结果判定检测样本Ct值<30.0，且曲线有明显的指数增长期，测定结果有效，可直接报告样本阳性；检测样本30. 0 < Ct值< 40时，需重复一次，如果Ct值仍小于40，且曲线有明显的指数增长期，可报告样本阳性，否则报告样本阴性；检测不到样本Ct值或Ct 值为40，报告样本阴性。6.待检样本的定量通过比较待检样本和标准品的阈值循环数对待检标本的起始拷贝数进行定量。本发明的主要技术原理实时荧光定量PCR技术是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。Ct值(cycle threshold, Ct)是指PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光到达阈值的循环数越少，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。该技术包括染料法和探针法两种。染料法是利用能与双链DNA结合的染料(如STOR Green)结合到双链DNA产物内部从而根据检测到的荧光信号实现定量的目的，然而这种方法无法区分引物二聚体及非特异产物信号；探针法是在常规的PCR基础上加入一条特异性的荧光探针(如TaqMan探针)，根据探针两边标记的报告荧光基团和淬灭荧光基团之间产生的荧光共振能量转移原理，释放的荧光信号强度与扩增产物的量呈正比关系，从而达到定量的目的。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 感染的荧光定量RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于扩增BVDV5’UTR 的引物对。在其他实施方案中，ΜΒ 丨物对的上游弓丨物序列为5，-GAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGG-3，， 下游引物序列为 5’ -CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3，。在其他实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测扩增产物的TaqMan探针。 在其他实施方案中，所述探针的序列为5，-AGATGCCACGTGGACGAGGGC-3 ’，5 ’端标记荧光报告基团FAM，3，端标记荧光淬灭基团BHQ1。在其他实施方案中，所述引物对和TaqMan探针被包括在RT-PCR反应液中，所述 RT-PCR反应液包括以下组分1 X RT-PCR缓冲液、ImM dNTP混合物、0. 1 μ M TaqMan探针、 0. 2 μ M上游引物和0. 2 μ M下游引物。在其他实施方案中，所述试剂盒还包括如下组分RNA提取试剂、DEPC水、DNA聚合酶、反转录酶、阳性对照和阴性对照。在一些实施方案中，本发明还提供了上述荧光定量RT-PCR快速检测试剂盒的应用，其特征在于该试剂盒使用时包括如下步骤提取样品的RNA ；—步法RT-PCR，利用反转录过程将RNA反转录成cDNA，同时进行荧光定量PCR ；对数据进行处理和分析。在一个实施方案中，所述应用不用于诊断目的。在其他实施方案中，所述应用可用于临床及科研领域，包括对BVDV感染进行快速定量检测，以及对牛血清、牛血白蛋白、牛睾丸细胞源猪瘟兔化弱毒活疫苗等生物制品的 BVDV污染监测。本发明的优点
1.本发明使用一对特异性的引物和一条高特异性的Taqman荧光探针，具有很高的准确性，特异性良好，假阳性率极低。2.本试剂盒可检测低至103COpieS/mL的病毒量，说明检测灵敏度较高。3.本发明所用的TaqMan探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记了本身不发光的荧光淬灭基团BHQl，降低了背景荧光信号，提高信噪比，使得实验结果更加精确。4.整个扩增和检测过程均在同一个封闭管内进行，有效避免了气溶胶污染而造成的假阳性。同时反转录和PCR过程一步完成，操作简单、自动化，整个检测过程仅需1 2 个小时。与病毒分离和常规PCR方法相比，大大提高了检测时间和效率。
图1是显示了本发明方法特异性的动力学曲线。如图所示，牛病毒性腹泻病毒样品和试剂盒中的阳性对照品检测结果为阳性，而猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和试剂盒中的阴性对照品均为阴性。其中A是阳性对照品，B是牛病毒性腹泻病毒，C是猪瘟病毒，D是猪繁殖与呼吸综合征病毒，E是阴性对照品。图2是显示了本发明方法灵敏度的动力学曲线。如图所示，在IO1 IO7拷贝/μ L 的范围内可以得到良好的动力学曲线。其中A G分别为107、106、105、104、IO3UO2UO1拷贝数目的检测动力学曲线。图3是显示了本发明方法灵敏度的标准曲线。
具体实施例方式实施例1牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的组成与试剂配制1. RT-PCR 反应液每个反应包括 10XRT-PCR Buffer 2. 5μ L,25mM dNTP Mix 1 μ LUOy MTaqMan 探针 PB 0· 25 μ L、10 μ M 上游引物 PF 0. 5 μ L、10 μ M 下游引物 PR 0. 5 μ L、DEPC 水 16. 25 μ L，共 21 μ L。48 个反应共计 1008 μ L，分装至 1 管。2. RNA提取液30mL/瓶，分装至棕色瓶中，4°C保存。3. DEPC水在去离子水中加入终浓度0. 1 %的焦碳酸二乙酯，室温过夜，15磅高压 20min，分装至1. 5mL离心管中，ImL/管。4. DNA 聚合酶Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 25 μ L/ 管分装，_20°C保存。5.反转录酶AMV反转录酶(5U/ μ L) 25 μ L/管分装，-20°C保存。6.阳性对照品为含有牛病毒性腹泻病毒特异性目的片段的克隆质粒进行体外转录获得的RNA，300 μ 1/管分装，-20°C保存。7.阴性对照品为健康猪血清，PBS稀释后300 μ L/管分装，_20°C保存。实施例2牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR快速检测试剂盒的应用方法1样本的核酸提取1. 1取若干个1.5mL灭菌(因待检样品份数而定)无RNA酶污染的离心管，作好标记。各加入600μ L RNA提取液，然后分别加入样本以及试剂盒中的阴、阳性对照各200μ L， 吸打混勻；再加入200 μ L氯仿，振荡混勻。静置5min, 12，OOOrpm离心IOmin0
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1. 2分别吸取各管中的上层液相(切勿吸入下层液体)转移至新的1. 5ml无RNA 酶污染的离心管中，加入200 μ L-20°C预冷的异丙醇，作好标记，颠倒混勻。静置5min， 12，OOOrpm 离心 IOmin01. 3轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600 μ L 75%乙醇，颠倒洗涤。12，OOOrpm离心5min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。1. 44，OOOrpm离心lOsec，用微量加样器尽量将残余液体吸干，室温干燥1 5min。1. 5加入20 μ L DEPC水，轻弹混勻，溶解管壁上RNA，保存_18°C以下备用。2反应体系的配制从试剂盒中取出RT-PCR反应液，室温融化并颠倒混勻，2000rpm离心lOsec。取出Taq酶及反转录酶，第一次使用时2000rpm离心lOsec，以收集粘在管壁的酶贮液，每个测试反应体系配制如下牛病毒性腹泻病毒RT-PCR反应液21 μ L，Taq酶0. 5 μ L，反转录酶0. 5 μ L，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，完全颠倒混勻，2000rpm离心lOsec，向设定的PCR反应管中分别加入22 μ L。将步骤1中制备好的样本RNA以及阴、 阳性对照品各取3 μ L加入相应的反应管中，盖紧管盖，置于荧光PCR仪上，并记录好样本摆放孔位。3荧光PCR反应条件设置第一步:42°C:20min,95°C :3min，1 个循环；第二步95°C:5sec,60°C :40sec (收集荧光 FAM)，40 个循环。4特异性试验在相同的条件下，同时提取牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪瘟病毒(CSFV)以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的RNA。应用牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR快速检测试剂盒检测上述病毒，同时设立阴阳性对照，以验证本试剂盒的特异性。检测结果显示，牛病毒性腹泻病毒样品和试剂盒中的阳性对照品检测结果为阳性(结果见附图1)，而猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和试剂盒中的阴性对照品均为阴性。证明该试剂盒能特异性的检测出牛病毒性腹泻病毒。5灵敏度试验以十倍系列稀释的标准品(3. IX IO1 3. IX IO7拷贝/μ L)作为模板，应用牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR快速检测试剂盒进行检测，结果显示，在IO1 IO7拷贝/ μ L 的范围内可以得到良好的动力学曲线(见附图2)且标准曲线较为理想(见附图3)。标准曲线的线性相关系数(R2)在0.99以上，提示误差较小，可信度较高。说明本试剂盒可检测低至103copies/mL的病毒量。6重复性试验用该试剂盒对3组不同病毒含量的样品进行重复性测定，所得检测结果经统计学处理后，计算组内的变异系数(C. V)，结果显示C. V值均小于3%，说明差异不显著，该检测方法重复性较好(见表1)。表1样品组间重复性检测
权利要求
1.检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于扩增BVDV 5，UTR的引物对。
2.如权利要求1的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述引物对的上游引物序列为 5，-GAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGG-3，，下游引物序列为 5，-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3，。
3.如权利要求2的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括用于检测扩增产物的iTaqMan探针。
4.如权利要求3的荧光定量RT-PC检测试剂盒，其中所述探针的序列为 5，-AGATGCCACGTGGACGAGGGC-3 ’，5 ’端标记荧光报告基团FAM，3，端标记荧光淬灭基团 BHQl。
5.如权利要求4的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述引物对和TaqMan 探针被包括在RT-PCR反应液中，所述RT-PCR反应液包括以下组分1 XRT-PCR缓冲液、 ImMdNTP混合物、0. 1 μ M TaqMan探针、0. 2 μ M上游引物和0. 2 μ M下游引物。
6.如权利要求5的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其中所述试剂盒还包括如下组分 RNA提取试剂、DEPC水、DNA聚合酶、反转录酶、阳性对照和阴性对照。
7.如权利要求1-6任一项的荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应用，其特征在于该试剂盒使用时包括如下步骤提取样品的RNA ；—步法PCR，利用反转录过程将RNA反转录成cDNA， 同时进行荧光定量PCR ；对数据进行处理和分析；其中所述应用不用于诊断目的。
8.如权利要求7的应用，其特征在于用于临床及科研领域，包括对BVDV感染进行快速定量检测，以及对牛血清、牛血白蛋白、牛睾丸细胞源猪瘟兔化弱毒活疫苗等生物制品的 BVDV污染监测。
9.不用于诊断目的的用于检测BVDV的方法，其特征在于包括应用荧光定量RT-PCR 方法检测待测样本中是否存在BVDV的RNA的步骤，其中所述RT-PCR方法应用了以下引物对和TaqMan探针序列为5 ’ -GAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGG-3 ’的上游引物，序列为 5，-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3，的下游引物，以及序列为 5，-AGATGCCACGTGGACGAGGGC-3，的 TaqMan 探针。
10.不用于诊断目的的用于检测BVDV的方法，其特征在于包括应用权利要求1-6任一项的荧光定量RT-PCR快速检测试剂盒检测待测样本中是否存在BVDV的RNA的步骤。
全文摘要
本发明提供了一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用，该试剂盒用于临床及科研领域，包括对BVDV感染进行快速定量检测，以及对牛血清、牛血白蛋白、牛睾丸细胞源猪瘟兔化弱毒活疫苗等生物制品的BVDV污染监测。本发明还提供了不用于诊断目的的用于检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染的荧光定量RT-PCR方法。
文档编号C12Q1/68GK102268488SQ201110207848
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月25日 优先权日2011年7月25日
发明者刘汉平, 孙庆歌, 张萍, 温文生, 漆世华, 薛霜, 谢红玲, 陈其兵 申请人:武汉中博生物股份有限公司