专利名称：：具有不可磷酸化的乳糖透性酶的乳酸菌突变株的制作方法具有不可磷酸化的乳糖透性酶的乳酸菌突变株本发明涉及乳发酵领域。更具体而言，本发明涉及嗜热链球菌(&r印toco^^yAe，opMw)的新型突变体，其表达突变的乳糖透性酶，从而改善其乳糖的转运活性。这些菌株以及含有它们的发酵物可用于获得具有良好保藏性能的发酵乳制品。酸奶(yogurts)通常通过混合的多种乳酸菌乳而发酵获得，这些乳酸菌选自嗜热链球菌(&^tococc^Ae，o;/n7w)和保加利亚乳酸杆菌(Zflcto^c/〃wZw/g"Wc^)。在发酵期间，发酵温度为约4045。C，菌株主要利用乳糖作为能量底物，并产生能导致乳液凝结的乳酸；当pH值达到约4.8~4.5时，通过冷却产物终止发酵步骤(也称为酸化)。产物在随后的生产和包装过程需一直保持冷却状态，直至其食用。然而，冷却并不能完全终止乳酸的发酵；甚至当产品保藏在4。C下时，其酸度都会随着时间逐渐升高。这种现象被称作后酸化，其导致在贮存期间产品的感官品质下降。后酸化基本上是由于细菌对酸化控制步骤的末期存留在产品中的乳糖的使用。为了防止这种现象，已提议采用不发酵乳糖或基本上不发酵乳糖的乳酸菌菌株进行发酵。嗜热链球菌(5V/tococcwAwwop/n'/w)禾B保力卩禾U亚乳酸杆菌(i^cto^cz7/^^/gaWc^)中主要用于乳糖发酵的酶是由乳糖操纵子编码，该操纵子包含编码乳糖透性酶的基因和编码P-半乳糖苷酶的/^Z基因。这些蛋白分别负责乳糖的转运和水解。为了获得乳酸菌的非后酸化菌株，已建议生产人造突变株或选择天然突变株，这些菌株中的至少一种所述酶的活性会受到影响。专利EP1078074(GervaisDanone公司)涉及缺少(3-半乳糖苷酶活性的Z.^/gw/c^突变株，其包括至少一种乳糖操纵子基因的无义突变。该专利更具体地描述了一种突变株，通过对其序列的分析显示了两个点突变一个是将终止密码子引入p-半乳糖苷酶基因，其导致该突变株不能利用乳糖；另一个突变导致透性酶基因的氨基酸发生改变(122位点上的Lys变成Asn);EP1078074并没有报导该突变对突变株表型有何影响。WO01/88150描述了乳酸杆菌(丄a"okc///^)菌株的突变株。这些突变株虽不能利用乳糖，但仍具有表达(3-半乳糖苷酶的能力。WO01/88150没有具体描述所讨论的突变的性质和位置，只是简单指出突变可能位于乳糖操纵子的诸多结构基因之一中，例如透性酶中，或位于乳糖操纵子的调节性区域中，或位于参与控制乳糖操纵子表达的基因中。上述文献中描述的突变株具有的共性就是完全不能利用乳糖。当仅添加糖(通常为葡萄糖)而没有乳糖时，这些菌株仅在牛奶中生长。这些突变株的酸化和后酸化特性受到所添加的葡萄糖的控制。为了提供这些突变株的替代菌株，本发明人研究了是否能获得具有如下特性的乳酸菌株，首先其在生长期具有与野生型菌株相似的利用乳糖的能力，其次，在静止期其利用乳糖的能力又受到限制，从而减少或消除后酸化现象。出于此目的，本发明人将注意力放在了对将乳糖转运至乳酸菌尤其是嗜热链球菌(S.Awmop/H7w)细胞内的调节进行操作的可能性上。将细胞外的乳糖转运至嗜热链球菌细胞内是通过乳糖透性酶LacS进行的。该乳糖转运是通过与质子进行同向转运，或与细胞内乳糖降解产生的半乳糖进行反向转运而进行。乳糖转运依赖于两个方面第一是乳糖透性酶的磷酸化状况，第二是编码该乳糖透性酶的/^^基因的表达。以下将详细描述这两个方面。乳糖透性酶的磷酸化LacS蛋白由转位结构域和调节结构域(IIA)构成。这两个结构域含有多个组氨酸残基，其磷酸化与乳糖转运的调控有关。尤其是，IIA结构域可在组氨酸552处被磷酸化。该磷酸化是通过HPr蛋白(含组氨酸的磷载体蛋白)进行，HPr蛋白的磷酸化已提前完成。HPr可被磷酸化-由依赖ATP的蛋白激酶在丝氨酸处进行；逆反应Pr(Ser-P)的水解是通过磷酸酶活性(HPr(Ser-P)磷酸酶)催化的；-在组氨酸HPr(HisP)处用磷酸烯醇丙酮酸的磷酸基团，通过酶I(EI)的方法进行。。只有在组氨酸处进行磷酸化的HPr形式才使乳糖透性酶在组氨酸552处被磷酸化。已有评述，在由蛋白脂质体重建的LacS蛋白和通过HPr(HisP)进行磷酸化的膜环境的体外模型中，该磷酸化对通过与质子进行同向转运的乳糖转运并不产生作用(GunnewijkandPoolman,2000a)，但增加了乳糖/半乳糖的交换约2倍。/a"基因的转录乳糖操纵子的转录是通过在含乳糖的培养基中生长而被诱导。基因和Z基因的启动子含有"e(分解代谢物响应元件)位点，其允许通过CcpA的调控CcpA抑制了/acS禾n/acZ的表达。另外，CcpA对编码乳酸脱氢酶的基因的转录具有活化作用(vandenBogaard""/.，2000)。HPr(Ser-P)形式能与CcpA相互作用。这些蛋白可共同形成具有位点的复合物，由此抑制/acS基因的转录(Jones^a/.,1997)。己有评述(GunnewijkandPoolman,2000b)，HPr(Ser-P)形式在嗜热链球菌指数生长期的开始阶段占大多数，但随该生长期而减少；而HPr(HisP)形式是在指数生长期期间开始出现而在进入静止期时数量最大。从HPr(Ser-P)到HPr(HisP)的转变与培养基中乳糖的减少和半乳糖的增加并行，并伴有乳糖透性酶表达的大量增加。因此，HPr蛋白的磷酸化状况似乎通过补偿培养基中乳糖的减少而在乳糖转运的调控中发挥着作用，第一通过LacS蛋白表达的水平发挥作用，第二通过对活性的调控发挥作用。在上述观察的基础之上，Gunnewijk和Poolman提出以下模型当培养基中富含乳糖时，/acS基因的表达受到HPr(Ser-P)/CcpA复合物的抑制。在发酵期间，随着培养基中半乳糖的累积和可用乳糖的减少，导致细菌渗透乳糖的能力降低(因此培养基中的酸化减少)。这种降低导致糖分解活性减小和ATP浓度的降低以及无机磷酸盐浓度的增加，从而导致对HPr(Ser-P)磷酸酶活性有益的HPr(Ser-P)激酶活性的降低，因此具有使HPr(Ser-P)浓度减少的效果。HPr(Ser-P)浓度的减少使得lacS基因的分解代谢抑制得到增强，从而增加了乳糖透性酶的产生。并行地，HPr(HisP)的增加会增加乳糖透性酶在组氨酸552处的磷酸化，因此增加了通过半乳糖的反向转运乳糖的能力。该模型提示了乳糖透性酶通过HPr(HisP)在组氨酸552处的磷酸化在培养基中底物的量减少时会增加细胞内乳糖的流出，从而可以假设当该磷酸化受到抑制时，指数生长期末期的酸化会减缓。然而，这是部分地基于体外实验，相对于其表达的增加，乳糖透性酶磷酸化的增加对乳糖转入体内的真实作用并不能事先作出判断。此外，关于HPr(Ser-P)和HPr(HisP)的浓度对LacS表达和磷酸化增加的作用是在指数生长期或静止期开始阶段的细菌中观察到的，而对于这两种形式HPr的浓度在静止期之后阶段的情况并没有给出任何说明。关于缺少LacS在组氨酸552处磷酸化的效果的唯一信息可见Poolmanetal.发表的文章(Poolman"a/.,1992)，其中描述了多种含有编码嗜热链球菌LacS酶的序列的质粒，其多个组氨酸残基位点发生了突变。这些质粒用于转化内源性lacS基因已去除的大肠杆菌。通过与含有编码嗜热链球菌野生型LacS酶的质粒的大肠杆菌的观察结果的比较来评估该多种突变转化的菌株的乳糖转运。在天然组氨酸被精氨酸替代的H552R突变体中没有观察到显著区别。Poolman等将这个结果归因于或者是大肠杆菌HPr(HisP)对嗜热链球菌的野生型LacS酶的磷酸化的失效，或者是此磷酸化在乳糖转运过程中不发生作用。本发明人对阻止LacS组氨酸残基处磷酸化的突变是否对突变菌株的酸化和后酸化性能有影响进行了研究。在该研究中，发明人选择了一种嗜热链球菌的工业菌株。该菌株于2002年12月19日保藏在CNCM，保藏号为1-2967，该菌株可获得具有优秀品质的发酵乳制品；但，该菌株导致严重的后酸化。本发明人构建并表征了该菌株的一种突变体。该突变菌株表达突变的乳糖透性酶，其组氨酸552不能磷酸化，而不是表达野生型乳糖透性酶。他们注意到该突变菌株与其亲本菌株的酸化曲线不同。与亲本菌株相比，突变菌株的酸化开始得更慢，其最大酸化程度也较低。然而，发酵6个小时后这两个菌株都达到了相等的pH值。这两个菌株的后酸化是完全不同的。在相同的贮存条件U0。C下，贮存28天)下，亲本菌株的ApH(D0时的pH值与D28时的pH值之差)的级别(order)是0.6，而突变株的ApH的级别为0.4。后酸化中的差别并不是由于细菌存活的差别而导致。事实上这两个菌株的存活相等。而且，用突变株发酵的产品与亲本菌株发酵的产品质地相同。因此，本发明首先涉及一种获得其后酸化低于其亲本菌株的乳酸菌突变株，其特征在于亲本菌株的基因组DNA，尤其是染色体DNA中导入了编码乳糖透性酶IIA结构域的可由HPr(HisP)磷酸化的组氨酸的突变密码子，所述突变密码子导致所述组氨酸被不能磷酸化的氨基酸所替代。根据本发明的优选实施方案，所述菌株是嗜热链球菌菌株，所述突变导致乳糖透性酶的552位点处的组氨酸被不能磷酸化的氨基酸所替代。所述不能磷酸化的氨基酸可以是除丝氨酸、酪氨酸、组氨酸和苏氨酸之外的任意氨基酸。丙氨酸是优选的氨基酸。有利地，编码乳糖透性酶552位点的组氨酸的密码子被编码丙氨酸的密码子所替代。该替代产生&rtJI限制性位点从而便于所获突变株的筛选。本发明的方法可利用本领域熟知的定点诱变尤其是PCR诱变的常规技术进行。然后将由此获得的DNA突变体插入到载体内，用于将基因整合到细菌染色体中。所述整合优选通过载体承载的插入体与细菌染色体的同源区域进行重组而进行。通常，突变的DNA被插入到带有选择标记(例如抗生素抗性基因)的整合载体中，该载体再被导入到需要进行突变的细菌内。随后，在选择培养基(例如，如果选择标记是抗生素抗性基因，则培养基中需含有相应的抗生素)中培养所述细菌，能够生长在此条件下的细菌复苏，这些细菌是插入体和细菌染色体同源区域经过同源重组而整合载体的细菌。整合到染色体内的结构体是由两侧首先为插入体的突变序列和其次为宿主细菌的同源序列的载体序列构成。将如此选择的细菌培养在非选择性培养基中，以切除源自载体的序列，该切除是通过这些序列的两侧区域之间的同源重组进行的。其中发生这种重组的细菌有半数含有源自宿主细菌的"野生型"序列，另一半含有源自插入体的突变序列。然后通过任何适宜的方法选择带有突变序列的细菌。例如，如果突变产生限制性位点，可根据突变区的PCR扩增产物中该限制性位点的存在进行选择。可获得多种乳酸菌的整合载体。通常，对于一种给定菌种，整合载体是可导入该菌种的菌株内，但不能在菌株内进行复制的载体。可用作嗜热链球菌内的整合载体的例子可以由Pgem5、Pucl9(Mollet^a/.,1993)和Pnd324(Duan1999)组成。有利地，出于增加转化效率的目的，在所选细菌体内有条件地进行复制的载体可用作整合载体。此时，导入载体的所述细菌首先在允许其复制的条件下进行培养，从而使载体在所转化的细菌内确立。然后，在不能使载体进行复制的条件下培养该细菌，并与常规整合载体的情况相同，选择载体已经整合入染色体的细菌。通过可在大量乳酸菌体内用作整合载体的条件性复制载体的例子，由Biswas等和Maguin等(Biswas"a/.，1993;Maguinef1996)和PCT申请(W093/18164)中描述的热敏载体或载体pwv01(Law"a/.，1995)禾卩Pucl22(F認1998)组成。本发明的另一个主题是由本发明的方法所获得的乳酸菌菌株。该菌株的特征在于其染色体组DNA包含编码乳糖透性酶IIA结构域的可由HPr(HisP)磷酸化的组氨酸的突变密码子的突变，所述突变导致所述组氨酸被不能磷酸化的氨基酸所替代。根据本发明的优选实施方案，所述菌株是嗜热链球菌菌株，其中乳糖透性酶基因包含导致该蛋白552位点处的组氨酸被不能磷酸化的氨基酸所替代的突变。根据布达佩斯条约，本发明的乳酸菌菌株于2004年5月10日保藏在CNCM(法国微生物保藏中心，NationaledeCulturedeMicroorganismes:25meduDocteurRoux，Paris),保藏号为1-3213。该菌株为嗜热链球菌的突变株，其源自CNCM菌株I-2967(2002年12月19日保藏在CNCM)，通过导入由定位诱变使组氨酸552密码被丙氨酸密码替代的突变而获得该突变株。本发明的乳酸菌菌株在其生长期具有亲本菌株相似的乳糖透性酶活性。因此，突变株和与其来源的亲本株的乳糖同化和酸化能力相似。另一方面，与亲本株相比，突变株在静止期的乳糖透性酶活性降低，从而导致后酸化减小。有利地，本发明的乳酸菌菌株源自具有(3-半乳糖活性的乳酸菌，且这些菌株保留了该活性。本发明的菌株可正常生长在仅添加糖而没有添加乳糖的奶中。优选地，本发明的菌株是适用于食品业的突变株(食品级突变株)。该突变株有利地源自具有优质乳制品发酵性能的菌株。本发明还涉及包括至少一种如上所述的菌株的乳酸酵素。根据本发明的一个具体实施方案，本发明的乳酸酵素包括至少一种表达乳糖透性酶(其中组氨酸552被不能磷酸化的残基替代)的嗜热链球菌的突变株和至少一种其它的乳酸菌菌株(例如保加利亚乳酸杆菌)，其任选具有减小了的后酸化性(例如，根据本发明，后酸化性的减小是由乳糖透性酶的突变导致或由l3-半乳糖失活的突变导致)。本发明还涉及制备发酵乳制品的方法，其包括利用如上所述的乳酸酵素进行奶发酵的步骤，该方法还可制备任意一种乳制品，如酸奶、发酵奶、发酵饮料、酸奶酒(kefir)、奶酪或发酵婴儿用奶。以下的实施例通过更详细地说明了本发明，但并不是对本发明进行任何限制。图1:1-3213突变株的/a"基因序列与1-2967亲本株的/ac5"基因序列的比较。图2:1-3213突变株与1-2967亲本株的后酸化曲线的比较。图3:1-3213突变株与1-2967亲本株后酸化比率的比较。图4:产品贮存期间道尔尼克酸度的监测。1-3213突变株与1-2967亲本株的比较。图5:产品的粘度n的测量原理。实施例实施例1:突变株的生产原始菌株为2002年12月19日保藏在CNCM的1-2967嗜热链球菌株。在/acS基因的序列中，通过双重组(doublerecombination)使组氨酸552(该组氨酸是可以磷酸化的)的密码子被丙氨酸密码子替代。此外，该突变(密码子552的第二个核苷酸被胞嘧啶替代，而不是腺嘧啶)在基因中产生BWU1限制性位点。这样可能选择到所需突变整合到基因的克隆体。使用所得克隆中的一个(2004年5月10日保藏在CNCM的1-3213)验证突变的稳定性，通过对连续6代的传代培养，再通过对Z^7S基因进行测序来验证突变体的稳定性。图1示出1-3213突变株的/ad基因序列(SEQIDNO:2)与1-2967亲本株的/acS基因序列(SEQIDNO:l)的比较。突变清晰存在组氨酸552的密码子目前编码丙氨酸。Z^"基因中没有其他不需要的突变。由于1-3213突变株不包含用于整合基因突变的质粒的任何残留序列，因而1-3213突变株适于农业食品的用途。实施例2:对1-3213突变株的生理学測试为了验证1-3213突变株的后酸化性能低于1-2967亲本株，在纯菌株中获得产品，并进行监测直至D+28:酸化、后酸化、存活、品质。2.A方案-由两代传代培养再生菌株。-在添加了酵母提取物的灭菌奶上制备酵素，温育条件为44°C，直到酸度达到85。D(相当于108109CFU/ml)。-将1%(v/v)的酵素接种到混合物(120g脱脂奶粉+930ml水+lgN3明胶蛋白胨(Organotechnie))中，95。C下巴氏消毒IO分钟。-于44。C的培养箱内，罐中温育，直至pH达到4.65。-将罐置于冰水中30分钟从而使发酵停止。-在10°C的冷藏条件下贮存产品28天。2.B-监测-突变株与1-2967株的酸化比较2忍丄麽众虑遂利用CINAC系统(酸化动力学(AcidificationKinetics),AllianceInstruments),随时间连续测定。由此获得-各菌株的酸化曲线，-一阶时间导数给出酸度比率。pi/游淑定利用MP220pH计(MettlerToledo)测量产品贮存期间的pH值变化。2.幻.遣众yg克麽度0)謹.函7/,游撒定测量道尔尼克酸度(D。)可对H30+离子的摩尔浓度进行滴定。道尔尼克数值相当于中和10.32g奶的0.1N氢氧化钠溶液的毫升数的十分之一。通过显色指示剂，酚酞指示达到中性。在其变化颜色的区域(pH为8.2)周围，酚酞的颜色由无色变为粉色。一度道尔尼克表示每升奶中有100mg的乳酸。奶培养基是由120g脱脂奶粉(Milex240,AriaFoodIngredients)+930ml去离子水+lgN3肽(VitalArmor950,ArmorProteins)构成。混合该混合物直至完全均匀。然后在环境温度下，使培养基再水化30分钟，然后在95。C下进行巴氏消毒10分钟。丄g.5.蘑嫌存薪存活测试是在含蔗糖的M17琼脂培养基中进行的。通过螺旋菌落接种仪(自AES的WASP)进行表面分离。在37。C、112(302下进行温育。温育72小时后读数。纯菌株酸化曲线都绘制两次。2』.6.>^弊与说敏图2和图3的结果示出1-3213突变株比亲本株的酸化曲线更慢，尿素作用(ureaeffect)更显著，最大酸化比率更低。但，两种菌株在6个小时内都达到4.50的pH值。2.C-监测-1-3213突变株和1-2967亲本株的后酸化比较图4示出了比较1-3213突变株和1-2967亲本株进行发酵获得的产品，在贮存期间道尔尼克酸度的监测结果。发酵停止后立刻测量的pH值和在10°C下贮存28天后测量的pH值的结果示于表l中。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表l所有结果确定了突变株的后酸化性低于其亲本菌株。2.D-监测小3213突变株和1-2967亲本株存活的比较表2示出10°C下忙存28天后的lml产品的细菌菌落数<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2上述结果显示在ie存28天后突变株的菌株存活与亲本株一样好。2.E-监测-用1-3213突变株和1-2967亲本株发酵获得的产品的品质比较对一次性生产的产品的品质进行检测。所有检测都进行三次(每次检在D+7下对产品进行品质检测的三个方法-用质构仪TAXT2(10。C)进行穿透力(Penetrometry)检测-手动搅拌后，用流变仪Rheomat260(4。C)进行流动检测-用离心机MCR300(20。C)离心后对乳清进行粘度检测以下将对上述各检测品质的技术进行详细描述。历-产^离微度纖浙该方法的优点在于通过对所选产品(setproducts)的乳清进行分析以确定菌株发酵乳的流变特性。该分析方法首先需从产品中收集乳清。将约50g的产品在环境温度下在631g下离心IO分钟，从而收集菌株发酵乳的胶体内存在的乳清。然后取出乳清，并进行同样的离心以去除大部分产品残余物。剩余颗粒沉积形成易碎的小块。然后在20。C，于固定的切变梯度(sheargradient)100s"下测量乳清的粘度达一分钟。还可在相同条件下，对由相同菌株在相同条件下发酵的三罐发酵乳进行上述三次测量。用于该分析的仪器为装有具两个空腔的同轴几何形DG26.7/TEZ150p-c型的AntonPaarPhysicaMCR300流变仪，以及珀尔帖效应(Peltier-effect)温控系统。该旋转系统可在一个恒定的切变速度下评价乳清的粘度，每秒获得一个点。通常，最初测量的两个数值是不一致的，由于旋转系统的初始化而失真。因此，乳清的粘度[Vs]是由这两个数值以外的仪器获得的其余数值的平均值而确定的。用于本测量的仪器是热流变TAXT2穿透力测量仪(ThermoRheoTAXT2penetrometer(AntonPaarPhysica,奥地禾U))。在恒定速度下，将直径约为1cm的圆柱匀速插入胶体中(温度为10°C)，插入深度为15mm。当柱体沉入产品中时，胶体产生抵抗力，并在破裂(break)之前发生变形，测量由此产生的力。所涉及参数如下所示Fgd-胶体强度(g)，相当于胶体破裂时柱体施加的力,其值为曲线的第一个峰值。M^在此胶体强度时的距离(mm)，相当于在胶体破裂时柱体穿入的深度。m=15mm时的力(g)，相当于柱体在其路程末端时测得的力。蘑动綠-魔动教度本方法包括手动搅拌以及在4°C下温育30分钟后测定产品的粘度。在4。C下，对相同条件下用相同菌株发酵的三罐发酵乳进行三次测量。用于该分析的仪器为装有具同轴系统的DIN145型的MettlerRM260冷冻粘度仪。该旋转系统用于观察产品变性，其为线性切变梯度(即给定梯度下的应力(stress))的函数。所获得结果的形式为连续的流动曲线，上升和下降斜率为020s"。该产品经受020s"的渐增切变梯度达1分钟，其相当于上升斜率。然后经受经受200s—1的渐减切变梯度达1分钟，其相当于下降斜率。然后根据卡森模式(Cassonmodel)将各下降曲线模式化t:应力(Pa)To:产品的流动阈值(flowthreshold)(Pa)[阈值4]r|:产品粘度(Pa.s)[V4]D:切变梯度(s—"卡森模式化之后，对曲线的下降部分进行线性回归处理，以选出重要参数产品粘度ri，其相当于回归线的斜率。图5示出了根据该模式计算粘度的方法。翁f用各测量技术获得的结果示于表3中。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表3对品质测量的结果进行差异分析(PO.05)(通过student检验比较每种参数的数值)-参数胶体强度、胶体强度的距离和15mm时的力都显示出这两种菌株没有显著差异。-流动测量得到的粘度参数也显示着两种菌株没有显著差异。-可重复的乳清粘度显示两种菌株具有显著差异，突变株的粘度高于1-2967株，证明产品品质没有任何损失。2卫5-说欲与鄉对突变株和亲本株发酵的产品品质进行检测，可以说明突变没有导致产品品质的任何损失。2.F-结论通过双重组获得其中乳糖透性酶不能磷酸化的1-2967的突变株。该突变株(1-3213)具有-酸化曲线不同于其亲本菌株(酸化比率变缓)，-在D28时后酸化减小，-产品品质与亲本菌株发酵相似，以及-在D28存活性良好。参考文献Biswas,L,Gruss，A.,Ehrlich,S.D.andMaguin，E.(1993)High-efficiencygeneinactivationandreplacementSystemforgram-positivebacteria.JBacteriol,175,3628-3635.D腿,K.,Liu,C.Q.,Liu，Y.J.,Ren,J.andDunn，N.W.(1999)NucleotidesequenceandthermostabilityofpND324,a3.6-kbplasmidfromLactococcuslactis.ApplMicrobiolBiotechnol，53,36-42.Frere,J.,Benachour,A.，Giard,J.C.,Laplace,J.M.，Flahaut,S.andAuffray,Y.(1998)Anewtheta-typethermosensitiverepliconfromLactococcuslactisasanintegrationvectorforEnterococcusfaecalis.FEMSMicrobiolLett,161,107-114.Gun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