用于治疗癌症及其它新血管生成疾病的RNAi治疗剂的组合物和方法

专利名称：：用于治疗癌症及其它新血管生成疾病的RNAi治疗剂的组合物和方法用于治疗癌症及其它新血管生成疾病的RNAi治疗剂的组合物和方法本申请要求2005年4月12日提交的美国申请60/670，717的优先权，因此其内容全部引入作为参考。本申请还涉及下列申请它们的内容也全部引入作为参考PCT/US03/24587,通过导入干扰RM下调靶基因体内表达的方法；PCT/US2005/003857,用于治疗眼睛新血管生成疾病的；PCT/US2005/003858，组合RNAi治疗剂的组合物和方法。发明领域本发明提供了用于治疗具有有害新血管生成(NV)的疾病的组合物和方法，该疾病常伴血管的异常或过度增生和生长。NV本身的发展常常具有不利后果或它可以是疾病的早期病理阶段。尽管采用了新的治疗性血管生成拮抗剂，包括VEGF途径拮抗剂，但是控制NV的治疗选择还不充足且对于NV的有效治疗仍存在强烈的和增长的未满足的临床需要，无论是抑制疾病进展还是逆转有害的血管生成。由于NV也可以是正常的生物学过程，因此优选对病理组织选择性地完成有害NV的抑制，优选需要将治疗分子选择性递送至病理组织。本发明通过提供控制NV的治疗克服了这个障碍，所述的治疗是通过血管生成前生化途径的选择性抑制，包括VEGF途径基因表达的抑制和定位于病理NV組织的抑制实现的。本发明提供了组合物和使用组织乾向纳米颗粒组合物的方法，该组合物包含聚合物缀合物且进一步包含诱导RNA千扰(RNAi)的核酸分子。本发明提供了用于抑制在NV中，更优选在VEGF途径中起作用的各个基因或基因组合的组合物和方法。本发明的dsRM纳米颗粒组合物可以单独使用或与其它治疗剂联合使用，包括定向疗法，包括VEGF途径拮抗剂，如单克隆抗体和小分子抑制剂，和抑制EGF及其受体或PDGF及其受体或MEK或Bcr-Abl的定向疗法，以及免疫治疗和化疗。本发明还提供了用于治疗受治疗者NV疾病的组合物和方法，所述疾病包括癌症、眼病、关节炎和炎症性疾病。发明背景最近，美国FDA批准的治疗剂，包括Avastin和Macugen对NV疾病提供了一些益处。这些治疗剂中的一些通过结合和抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)的作用而起作用，但是这些治疗剂对于很多患者无效。临床研究中正在评估的其它治疗剂显示它们可以通过结合和抑制VEGF的受体，或用于信号转导的这些受体所使用的"下游"蛋白的作用而提供一些益处的迹象。出现的这种情景意味着控制该VEGF"途径"可以呈现出为一些患者提供益处的控制NV的水平。此外，对一系列小分子激酶抑制剂的研究发现一种具有抗多种激酶蛋白、VEGF受体、PDGF受体、FLT3和Kit活性的净皮称为"sunitinib"的抑制剂对NV疾病提供了更好的临床益处。然而，这些益处对于大多数患者来说仍然不够，仍需要控制VEGF途径的更好的治疗方法。迄今开发的治疗剂主要是VEGF或其受体-VEGFRl和VEGFR2的拮抗剂。使用拮抗剂发生的一个问题看来是病理组织所引起的增加VEGF产生的反应。因此，改善治疗性控制NV的有吸引力的方法是抑制VEGF途径蛋白的产生，即下调它们的基因表达，和通过体内递送小干扰dsRNA寡核苷酸(siRNA)诱导RNA干扰来完成之。RNA干扰(RNAi)是转录后过程，其中双链RNA以序列特异性方式抑制基因表达。RNAi过程至少以两步发生在第一步过程中，长dsRNA被内源核糖核酸酶切割成较短的，21-或23-核苷酸长的dsRNA。在另一个第二步骤中，较小的dsRNA介导具有匹配序列的mRNA分子的降解和结果选择性下调该基因的表达。这种RMi作用可以通过将较长的双链RNA(dsRNA)或者较短的小干扰RNA(siRNA)导入细胞内的靼序列来实现。最近，据证实RNAi还可以通过导入产生与靶基因互补的dsRNA的质粒来完成。RNAi方法已经成功用于果蝇(2°'22'23'25)/C.e/^a/7s(141516)和Zebrafish(2。)中的基因功能测定实验。在那些模型生物中，已报道了化学合成的较短siRNA或体外转录的较长dsRNA都可以有效抑制靼基因表达。已经报道该方法在非人哺乳动物和人细胞培养物中成功实现了RNAi作用(39—56)。然而，在成年动物模型中难以观察到RNAi作用""。这是由于几个原因，包括长双链RNA导入哺乳动物细胞可以触发抗病毒免疫反应，包括上调千扰素、引起细胞凋亡和死亡，这可能对期望的治疗效果有害或有益dsRNA进入靶细胞的效率低，特别是在动物中；短dsRNA分子迅速从血液分泌到尿中；和RNA分子可由核糖核酸酶活性所降解。尽管RMi在基因目标确认和核酸疗法中具有应用潜力，但是由于递送入动物疾病模型的RNAi分子的量少，这项技术的发展受到阻碍。因此显然改善RNAi分子递送到体内的方法很重要。诱导RNAi的核酸分子的组织靶向递送显然也是很重要的。递送诱导选择性针对VEGF途径基因的RNAi的核酸分子的方法将非常有益于NV疾病的治疗同样是明显的。本发明的组合物和方法可以满足这些需要。发明概述因此本发明的目的是利用RNAi调节血管生成过程以便通过下调NV致病中所涉及的基因表达，更具体地说是VEGF途径中的基因来逆转疾病过程。因此本发明的目的是提供用于抑制哺乳动物中一种或多种VEGF途径基因表达的組合物和方法。本发明的另一目的是提供用于治疗NV疾病的组合物和方法，其通过抑制一种或多种VEGF途径基因表达，单独或与包括相同VEGF途径的拮抗剂的其它药剂联合来实现。在达到这些目的过程中，提供了用于下调内源VEGF途径基因的组合物和方法，包括给哺乳动物组织施用包含双链RM分子的组合物，其中RM分子特异性降低或抑制内源VEGF途径基因表达。内源基因的这种下调可以用来治疗由VEGF途径的活性？1起或加剧的疾病。该疾病可以在人类中发生。也已经提供了用于治疗哺乳动物中与不需要的VEGF途径基因表达相关的疾病的方法，包括应用包含dsRNA寡核苷酸的核酸组合物作为活性药物成分(API)，与一种制剂结合，其中该制剂可以包含聚合物，所述的核酸组合物能够降低VEGF途径基因表达和抑制疾病中的NV。该疾病可以是癌症或癌前生长且组织可以是例如肾组织、乳房组织、结肠组织、前列腺组织、肺组织或卵巢组织。本文使用的"寡核普酸"和基于此的相似术语是指由天然存在核普酸组成的短寡聚物(oligos)以及由合成或修饰核苷酸组成的寡聚物。寡核苷酸的长度可以是10个或更多个核苷酸，或15、或16、或17、或18、或19、或20个或更多个核苷酸，或21、或22、或23、或24个或更多个核苷酸，或25、或26、或27、或28或29、或30个或更多个核苷酸，或35个或更多个、40个或更多个、45个或更多个，至多大约50个核普酸。是siRNA的寡核苷酸可以具有15至30个之间任何数量的核苷酸。在许多实施方案中，siRNA可以具有19至27个之间任何数量的核苷酸。在许多实施方案中，siRNA可以具有两个平端，或两个粘性末端，或一个平端一个粘性末端。粘性末端的外突核苷酸可以在一至四个核普酸或更多的范围内变化。在优选实施方案中，本发明提供了25个碱基对的具有平端的siRNA。术语"多核苷酸，，和"寡核苷酸，，在本文中可以同义使用。该组合物可以进一步包含聚合载体。该聚合栽体可以包括与RM分子结合并形成納米颗粒的阳离子聚合物。阳离子聚合物可以是氨基酸共聚物，含有例如组氨酸和赖氨酸残基。聚合物可以包括支化聚合物。组合物可以包含靶向合成载体。该合成载体可以包含阳离子聚合物作为核酸栽体，亲水聚合物作为立体保护材料和靶向配体作为靶细胞选择剂。该聚合物可以包括聚乙烯亚胺或聚组氨酸-赖氨酸共聚物或化学修饰的聚赖氨酸或可以用作核酸栽体模件的其它有效的聚阳离子载体，亲水聚合物可以包括聚乙二醇或聚缩醛或聚喁唑啉，而靶向配体可以包括含RGD序列的肽或糖或糖类似物或mAb或mAb片段，或任何其它有效的靶向部分。在这些方法的任何一种中，可以与组合物基本同时或在应用组合物之后施加电场。本发明的组合物和方法包括具有与内源VEGF途径基因或突变内源基因匹配的序列的dsRNA寡核苷酸，并且突变基因中至少一个突变可以在基因编码区或调节区中。在这些方法的任何一种中，内源基因可以选自VEGF途径基因，包括生长因子基因、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶基因、蛋白质酪氨酸激酶基因、蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶基因、蛋白质酪氨酸磷酸酶基因、受体基因和转录因子基因。所选择的基因可以包括下组的一种或多种基因VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2、VEGF-R3、VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、RAF-a、RAF-c、AKT、Ras、NF-Kb。所选择的基因可以包括来自与NV相关的其它生化途径的一种或多种基因，包括HIF、EGF、EGFr、bFGF、bFGFr、PDGF和PDGFr。所选择的基因可以包括来自与NV共同起作用的其它生化途径的一种或多种基因，包括Her-2、c-Met、c-Myc和HGF。本发明还提供了诱导RNAi以抑制多种基因的核酸试剂，包括siRNA的混合物(siRNA-OC)的组合物和方法。本发明的组合物和方法可以基本上同时抑制多种基因或它们可以顺序抑制多种基因。在优选实施方案中，siRNA-OC试剂抑制三种VEGF途径基因VEGF、VEGF受体1和VEGF受体2。在另一个优选实施方案中，基本上同时给予siRNA-OC。本发明提供了从siRNA的序列很大程度上与靶基因mRNA中的序列匹配获得的具有基因抑制选择性的试剂。它还提供了具有抑制VEGF途径中不同基因的基本上相似的生理化学特性的siRNA试剂。它还提供了多半与siRNA序列无关的纳米颗粒组合物。它还提供了用于治疗人类疾病，尤其是NV相关疾病的方法，所述疾病可以用多种内源基因的抑制剂来治疗。它还提供了通过在一些情况下基本上同时，而在另一些情况下顺序给予的治疗剂的组合来治疗人类疾病的方法。本发明的一个方面提供了治疗癌症、关节炎、失明、传染病和炎症性疾病的组合物和方法。在本发明的另一个方面，在同一治疗方案中诱导RNAi的核酸试剂与其它治疗剂，例如但不限于小分子和单克隆抗体(mAb)—起使用。根据下列详细说明，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而应该理解，详细说明和具体的实施例，在表明本发明的优选实施方案时，仅仅是以举例方式给出，因为根据本详细说明，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对本领域技术人员来说将变得显而易见。附图简述图1.显示了RGD肽配体靶向的VEGF途径siRM納米颗粒组合物单独或与Avastin治疗联合引起的DLD-1结肠异种移植肿瘤生长的抑制。在同一治疗方案中，使用VEGFR2-siRNA抑制剂和Avastin(Bevacizumab)联合癌症疗法已经在人结肠癌(DLD-1)异种移植肺瘤模型中观察到更强的抗肿瘤功效。图2.通过全身递送靼向新血管系统的VEGFR2-siRNA纳米颗粒，在每隔两天四次重复给药后，在结肠癌异种移植小鼠模型(DLD-1肿瘤)中证明有强力功效。RT-PCR结果说明VEGFR2基因表达在mRNA水平上被敲减。图3.通过全身递送靶向新血管系统的人VEGFR2-siRNA纳米颗粒，在每隔两天四次重复给药后，在结肠癌异种移植小鼠模型(DLD-1肿瘤)中证明有强力功效。免疫组织化学图像显示肿瘤组织中VEGFR2和CD31表达下调。图4.尽管通过全身递送靶向新血管系统的人VEGFR2-siRNA纳米颗粒在结肠癌异种移植小鼠模型(DLD-1肺瘤)中证明有强力功效，但是在第二次递送后24小时在小鼠血流中未观察到显著的IFN-oc诱导。图5.通过RT-PCR和ELISA评估的，人VEGF-siRNA(19个碱基对，具有3'突出端)对于沉默hVEGF体外和体内表达有效，在inRNA水平和蛋白水平上均如此。上面两个图证明在mRNA和蛋白水平都显著敲减了hVEGF。下图显示了siRNA介导的hVEGF敲减在MCF-7/VEGF165细胞诱导的异种移植模型中的抗肿瘤活性，其中hVEGF表达在肿瘤组织中显著下调。图6.人VEGF-siRNA(19个碱基对，具有3'突出端)对于引起肿瘤生长抑制(HNSCC1483细胞)的沉默hVEGF体内表达有效。用电穿孔五次重复肿瘤内递送，7天间隔加强。图7.人VEGF-siRNA(25个碱基对，平端)对于沉默hVEGF体外表达更有效且比19个碱基对的siRNA更强。图8.人VEGF-siRNA(25个碱基对，平端)对于沉默hVEGF体外表达有效且持续时间比19个碱基对的siRNA更长。图9.人VEGFRl-siRNA(25个碱基对，平端)在48小时后对于沉默hVEGFRl体外表达有效。图10.人VEGFRl-siRNA(25个碱基对，平端)在72小时后对于沉默hVEGFRl体外表达有效。图11.人VEGFR2-siRNA(25个碱基对，平端)在两个不同时间点对于沉默hVEGFR2体外表达有效。图12.使用MDA-MB-435乳腺癌细胞系，人VEGF-siRNA(25个碱基对，平端)对于引起肿瘤生长抑制的沉默hVEGF体内表达有效。图13.在相同治疗中4吏用耙向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA混合物阻断血管生成途径的概念基本结构。图14.在HSK鼠才莫型的眼组织中，VEGFsiRNA介导的VEGF表达抑制。图15.在HSK鼠模型的眼组织中，VEGF途径siRNA介导的VEGF途径基因单独或联合抑制。图16.在HSV诱导的眼血管生成小鼠模型中，以相同剂量测试，局部(左)或全身(右)递送，把向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA混合物比耙向单独基因的任何单个siRNA更有效。图17.通过局部和全身给予VEGF途径siRNA混合物实现的在HSK鼠模型的眼组织中的血管生成抑制的比较。图18.VEGF途径siRNA混合物介导的HSK鼠模型眼组织的病理抑制的药效作用。图19.诱导疾病后第17天或第14天，给予VEGF途径siRNA混合物，灌注/平面封固测定，在视网膜血管生成小鼠模型的眼组织中引起的血管生成抑制。图20.乾向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA混合物证明在缺氧诱导的早产儿视网膜病(ROP)小鼠模型中非常有效的抗血管生成活性。图21.乾向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA混合物证明在缺氧诱导的早产儿视网膜病(R0P)小鼠模型中具有非常有效的抗血管生成活性。图22.用不同载体以不同给药途径，乾向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA混合物显著抑制眼睛血管生成。配体定向納米颗粒介导IP递送。图23.用于siRNA递送的自动装配纳米颗粒。当预先制备的RGD-PEG-PEI缀合物水溶液与siRNA水溶液混合时，纳米颗粒会如前所述自动装配。纳米颗粒大小相对均匀，从50nm至100nm。图24.使用标记的siRNA有效载荷(左)和表达萤光素酶报道基因的质粒(右)有效载荷证明了靶向新血管系统的siRNA纳米颗粒的肿瘤靶向性能。图25.耙向新血管系统的VEGFR2-siRM纳米颗粒，在每隔两天四次重复给药后在神经母细胞瘤同基因小鼠模型(N2A肿瘤)中证明有强力功效。图26.乾向新血管系统的VEGFR2-siRNA纳米颗粒，在每隔两天五次重复给药后在肾癌异种移植小鼠模型(786-0肿瘤)中证明有强力功效。图27.靶向新血管系统的VEGFR2-siRNA纳米颗粒，在每隔两天四次重复给药后，在结肠癌异种移植小鼠模型(DLD-1肿瘤)中证明有强力功效。该研究中使用三种不同剂量。图28.耙向新血管系统的VEGFR2-siRNA纳米颗粒，在每隔两天四次重复给药后，在结肠癌异种移植小鼠模型(DLD-1肿瘤)中证明有强力功效。给予每公斤紐gVEGFR2的剂量产生与每公斤5mg相同的抗肿瘤功效。图29.从同双功能活化PEG、RGD-2C肽、含多胺的试剂和dsRNA混合物的原料开始生产RGD-聚合物缀合物和纳米颗粒-siRNA制剂的工艺流程图。图30.使用静态混合器从两种溶液-包括聚合物缀合物的聚合物溶液和包括三种dsRNA试剂的siRNA、溶液开始制备纳米颗粒-siRNA制剂。详细i兌明本发明提供了治疗NV疾病的组合物和方法，其典型的特征为多种蛋白和异常超表达的致病基因和致病蛋白的多种机能失常的属性。本发明提供了核酸试剂，如siRNA寡核苷酸，其激活RNA干扰(RNAi)并且是以序列特异性方式进行的基因表达的高度选择性抑制剂。本发明提供了通过调节蛋白活性，包括降低蛋白表达水平和蛋白的转录后修饰来抑制NV。在癌症中，肿瘤发生过程被认为是癌基因、血管生成因子、生长因子和突变的肿瘤抑制剂异常超表达的结果，即使其它蛋白的低表达也起关键作用。增加的证据支持siRNA分子能够在体内和体外"敲减"致癌基因，引起显著的抗肿瘤作用的观念。利用特异性靶向人VEGF途径基因序列的siRNA的肿瘤内递送，本发明的组合物和方法证明在MCF-7细胞、MDA-MB-435细胞和1483细胞诱导的异种移植肿瘤才莫型中基本上敲减了人VEGF，实现了40-80%的肿瘤生长抑制。认识到VEGF途径基因表达的抑制诱导改变肿瘤内微血管系统和激活肿瘤细胞凋亡的抗血管生成作用并可以提高细胞毒性化疗药物的功效。然而，为了实现抗血管生成剂和化疗药物的显著提高的抗肿瘤功效，高效递送方法是必要的，以便局部肿瘤组织中蓄积的药物浓度升高，且在很多情况下通过全身给药。本发明人描述了一种确认药物靶的方法，其确定哪些耙控制疾病途径，并因此验证药物开发成果(参见PCT/US02/31554)。本发明人还描述了适于将核酸递送入动物组织的技术。参见WO01/47496,因此其内容全部引入作为参考。这些方法能够给予核酸并达到与"金标准"核酸递送试剂相比显著(例如，七倍)的功效提高。因此，该方法提供了核酸在组织中的强活性，包括候选靶蛋白的活性。这个平台是确认组织中候选基因的有效工具。此外，本发明人使用这些方法实现了动物组织中的基因沉默，这是确认候选耙基因和作为治疗方式非常期望的。最近，已证明双链RM通过被称为RNA干扰(RNAi)的现象诱导基因特异性沉默。尽管仍未完全了解RNAi的机制，但是早期结果提示RNAi作用可以在体外在各种细胞类型，包括哺乳动物细胞中实现。以靶mRNA为目标的双链RNA引起靼的降解，由此引起相应基因的沉默。大的双链RNA被RM酶III样活性包括酶Dicer切割成21-23个核苷酸长的较小片段。这些较短的片段称为siRNA(小干扰RNA)，被认为介导mRNA的切割。尽管不久之前已在C,e/egs/2s和其它低等生物中研究了RMi机制引起的基因下调，但是仅仅最近才证明了它在培养的哺乳动物细胞中的有效性。最近使用萤火虫萤光素酶基因报道系统在小鼠中证明了RNAi作用。为了开发用于核酸疗法治疗人类疾病的研究和临床应用的体内基因抑制的RNAi技术平台，本发明人在小鼠疾病模型中进行了几项体内研究。在那些实验中，将靶向肿瘤相关配体(人VEGF)或受体(小鼠VEGFR2)的siRNA或dsRNA递送至带有异种移植的人MCF-7衍生肿瘤或人MDA-MB-435肺瘤的棵鼠中。我们首次能够证明RNAi可以有效地体内沉默肿瘤细胞中的靼基因，以及结果肿瘤生长受到抑制。本发明人使用抑制VEGF途径基因的dsRNA寡核苷酸首次获得了用于治疗各种NV疾病的治疗组合物和方法。这里详细对本发明进行描述，但是本领域技术人员可认识到本发明的最大范围。A.用于VEGF途径基因抑制的有效siRNA本发明提供了靶向和抑制VEGF途径基因序列的具有各种物理化学结构的核酸试剂。本发明的一个优选实施方案使用了被称为siRNA的核酸试剂，包括19个碱基对的dsRNA,具有3'突出端以及25个碱基对的dsRNA,具有平端。发现具有25个碱基对的dsRNA,平端的本发明的siRNA是一些最有效的抑制剂且其中的一些抑制持续时间最长。另外，非天然存在的化学类似物的掺入在本发明中有用，包括RNA的2'-0-甲基核糖类似物。DNA和RNA嵌合寡核苷酸，及核酸寡核普酸的其它化学类似物。siRNA有义链中有和没有2'-0-甲基核糖和靶向人VEGF序列的25个碱基对的siRNA提供了强烈和持久的抑制作用，在MCF-7/VEGF165细胞中和在生长于动物中的肿瘤内达到70-80%。MCF-7/VEGF165细胞培养物中的这种抑制作用持续了5天。本发明提供的一个方面是靶向人基因及其编码序列的siRNA也靶向其它哺乳动物物种，如其它的灵长类动物、小鼠和大鼠，但是不限于这些物种。siRNA。本发明提供了许多其它形式的靼向VEGF途径基因的siRNA,本领域技术人员会理解其它的形式。a.人VEGF特异性siRM:25个碱基对，平端hVEGF-25-si醒-a:有义链5'-r(CCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCA)-3'反义链5'-r(UGAAGAUGUACUCGAUCUCAUCAGG)-3'。hVEGF-25-siRNA-b:有义链-r(GAGAGAUGAGCUUCCUACAGCACAA)-3'反义链5'-r(UUGUGCUGUAGGAAGCUCAUCUCUC)-3'。固GF-25-siRNA-c.'有义链5'-r(CACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAA)"^反义链5'-r(UUGGUCUGCAUUCACAUUUGUUGUG)-3'19个碱基对，在3'具有两个核苷酸(TT)突出端hVEGF165-r(UCGAGACCCUGGUGGACAUTT)-3'b.人VEGF受体1特异性siRNA:25个碱基对，平端hVEGFRl-25-siRNA-a，有义链5'-r(GCCAACAUAUUCUACAGUGUUCUUA)-3'反义链-r(UAAGAACACUGUAGAAUAUGUUGGC)-3'hVEGFRl-25-siRNA-b，有义链-r(CCCUCGCCGGAAGUUGUAUGGUUAA)-3'反义链5'-r(UUAACCAUACAACUUCCGGCGAGGG)-3'19个碱基对，具有两个3'(TT)核普酸突出端VEGFRl(FLT)-GGAGAGGACCUGAAACUGUTTc.人VEGF受体2特异性siRNA:25个碱基对，平端hVEGFR2-25-siRM-a，有义链-r(CCUCUUCUGUAAGACACUCACAAUU)-3'反义链5'-r(AAUUGUGAGUGUCUUACAGAAGAGG)-3'固GFR2-25-siRNA-b，有义链-r(CCCUUGAGUCCAAUCACACAAUUAA)-3'反义链-r(UUAAU腦GUGAUUGGACUCAAGGG)-3'跳GFR2-25-siRNA-c，有义链5'-r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)-3'反义链5'-r(AAAGGCAUCUGCUUCAAUCACUUGG)-3'19个碱基对，具有两个3'(TT)核苷酸突出端hVEGFR2(KDR)5'-CAGUAAGCGAAAGAGCCGGTT-3'25个碱基对的寡siRNA可以靶向来自人和小鼠的相应基因。在另一个实施方案中，选择25个碱基对siRNA序列面向相应的raRNA序歹ij,包括人VEGF、VEGFR1、VEGFR2、PDGFR-a、PDGFR-J5和EGFR基因。选择的序列不仅对人基因是特异性的，而且对相应的小鼠基因也是特异性的，如面向人VEGFmRNA的序列也面向小鼠VEGFmRNA。25个碱基对的寡siRNA对小鼠异种移植肿瘤研究很有用，因为抗胂瘤功效依赖于肿瘤组织中人和小鼠基因的敲减。例如，用靶向人和小鼠VEGFmRNA序列的寡siRNA敲减肿瘤细胞(人来源)和内皮细胞(小鼠来源)的VEGF表达将提供更好的抗肿瘤功效。同时，用耙向来自试验动物(例如小鼠或猴子)和人基因这两种基因的寡siRNA的毒性研究将很有用，因为测试了实际药物的药剂毒理学和过大的药理学。下列序列是耙向人和小鼠基因的VEGF、VEGFR2、VEGFR1、PDGFR-a、PDGFR-P和EGFRmRNA的25个碱基对的寡siRNA序列，它们中的一些还可以耙向它们的猴子和狗对应序列。^/^7乂、V、處、义處、錄凝、游MCiz;A^序/i/W25个^差考W哪尸"'腿'mhVEGF25-1:有义，5'-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU-3,;反义，5'-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3'mhVEGF25-2:有义，5'-GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU-3,;反义，5'-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC-3'mhVEGF25-3:有义，5'-CAGCUUGAGUUAAACGAACGUACUU-3,;反义，5'-AAGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUG-3'mhVEGF25-4:有义，5'-CCAUGCCAAGUGGUCCCAGGCUGCA-3';反义，5'-TGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGG-3'mhVEGF25-4:有义，5'-CACAUAGGAGAGAUGAGCUUCCUCA-3,;反义，5'-UGAGGAAGCUCAUCUCUCCUAUGUG-3，乾力人;^V、葳M67^/Z7^^y^/i/种MCWs/^VJm跳GFR225.-l:有义，5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3反义-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3m固GFR225'-2:有义，5'-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA-3反义5'-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3mh雷FR225.-3:有义，-CUCAUGGUGA腦UGGAAUUCUGCA-3反义-UGCAGAAUUCCACAAUCACCAUGAG-3m跳GFR225.-4:有义，-GAGCAUGGAAGAGGAUUCUGGACUC-.3反义5'-GAGUCCAGAAUCCTC匿CAUGCTC-■3m固GFR225.-5:有义，-CAGAACAGUAAGCGAAAGAGCCGGC-.3反义-GCCGGCUC,CGCUUACUG匿UG-■3mhVEGFR225--6:有义，5'-GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA--3反义5'-UGAGAUGCUCCAAGGUCAGGAAGUC--3mhVEGFR225-7:有义，-CCUGACCUUGGAGCAUCUCAUCUGU--3反义-ACAGAUGAGAUGCUCCAAGGUCAGG-■3mhVEGFR225-8:有义，-GCUAAGGGCAUGGAG匿UUGGCAU--3反义5'一AUGCCAAGAACUCCAUGCCCUUAGC--3乾命乂和V、^^W^7zz^^^/y^^5"个喊JJ^^M6^Ws/AW一紧mhVEGFR125-l:有义，-CACGCUGUUUAUUGAAAGAGUCACA-3';反义5'-UGUGACUC丽CAAUAAACAGCGUG-■3'mhVEGFR125--2:有义，5'-CGCUG腦AUUGAAAGAGUCACAGA-'3';反义-UCUGUGACUC画CAAUAAACAGCG-mhVEGFR125--3:有义，-CAAGGAGGGCCUCUGAUGGUGAUGU-■3';反义-ACAUCACCAUCAGAGGCCCUCCUUG-■3'mhVEGFR125-■4:有义，-CCAACUACCUCAAGAGCAAACGUGA-3';反义-UCACGUUUGCUCUUGAGGUAGUUGG-.3'mhVEGFR125-■5:有义，-CUACCUCAAGAGCAAACGUGACUUA-■3。反义-UAAGUCACG画GCUCUUGAGGUAG-■3'mhVEGFR125-.6:有义，5'-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU-■3。反义5'-AGGUCCCGAUGAAUGCAC丽CUGG-■3'mhVEGFR125-'7:有义，-CAUUCAUCGGGACCUGGCAGCGAGA-■3。反义5'-UCUCGCUGCCAGGUCCCGAUGAAUG-3'mhVEGFR125-■8:有义，5'-CAUCGGGACCUGGCAGCGAGAAACA-■3';反义-UG画CUCGCUGCCAGGUCCCGAUG-.3'mhVEGFR125-,9:有义，5'-GAGCCUGGAAAGAAUCAAAACC丽-反义5'-AAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGCUC-■3'mhVEGFR125-■10:有义，-GCCUGGAAAGAAUCAAAACCUUUGA-■3。反义-UCAAAGG謂UGA匿UUUCCAGGC-■3'mhVEGFR125-.11:有义，5'-GCCUGGAAAGAAUCAAAACCUUUGA--3。反义5'-UCAAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGC--3'mhVEGFR125--12:有义，5'-CUGAACUGAG國AAAAGGCACCCA-画3。反义5'-UGGGUGCC画UAAACUGAG匿AG--3'mhVEGFR125-■13:有义，5'-GAACUGAG画AAAAGGCACCCAGC--3';反义5'-GCUGGGUGCC画UAAACUCAG画--3'乾/^7乂;^V、薦a^个础差^f^mhPDGFRa25-1:有义，5'-GAAGAUAAUGACUCACCUGGGGCCA-3';反义-UGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUCUUC-3,mhPDGFRa25'-2:有义，5'-GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU-'3';反义-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC-m固GFRa25.-3:有义，-CUCACCUGGGGCCACAUUUGAACAU-3';反义5'-AUG匿AAAUGUGGCCCCAGGUGAG-■3'mhPDGFRa25--4:有义，-CUUGCUGGGAGCCUGCACCAAGUCA-'3';反义5'-UGACUUGGUGCAGGCUCCCAGCAAG-mhPDGFRa25.-5:有义，5'-GA匿UAC画CUACAAUAAGAUCA-'3';反义-UGAUCUUAUUGUAGAAAGUAGAAUC-mhPDGFRa25--6:有义，5'-CAGAGACUGAGCGCUGACAGUGGCU-3、反义5'-AGCCACUGUCUGCGCUCAGUCUCUG-mhPDGFRa25--7:有义，-GACCUGGGCAAGAGGAACAGACACA-3';反义5'-UGUGUCUGUUCCUCUUGCCCAGGUC-3'mhPDGFRa25'-8:有义，-CCACCUUCAUCAAGAGAGAGGACGA-3';反义5'-UCGUCCUCUCUCUUGAUGAAGGUGG-3'mhPDGFRa25--9:有义，-UAUGGAUUAAGCCGGUCCCAACCUGU-3。反义5'-ACAGGUUGGGACCGGCUUAAUCCAUA-3'乾/^乂希小篇户"6T^-/^"个虞X^s/iWmhPDGFRB25'-1:有义，-CUGCAGAGACCUCAAAAGGUGUCCA-'3、反义-UGGACACCUUUUGAGGUCUCUGCAG-mhPDGFRB25.-2:有义，5'-CAGAGACCUCAAAAGGUGUCCACGU-3';反义5'-ACGUGGACACC画UGAGGUCUCUG國■3'mhPDGFRB25.-3:有义，-GUGGUGGUGAUCUCAGCCAUCCUGG-■3';反义5'-CCAGGAUGGCUGAGAUCACCACCAC-■3'mhPDGFRB25.-4:有义，5'-GGUGGUGAUCUCAGCCAUCCUGGCC-.3。反义-GGCCAGGAUGGCUGAGAUCACCACC-■3'mhPDGFRB25.-5:有义，-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU--3。反义5'-AGUCACAGAUC雨ACCAGCUUGCC--3'mhPDGFRB25--6:有义，-GCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACUU画.3';<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>mhEGFR-.7:有义，5'--CGAUGUCUACAUGAUCAUGGUCAAGU-3';反义:-ACUUGACCAUGAUCAUGUAGACAUCG-3'mhEGFR--8:有义，5'.-CUACAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGG-3'，反义:-CCAGCACUUGACCAUGAUCAUGUAG-3zmhEGFR画■9:有义，5'--CAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGA);反义:5'-UCAUCCAGCACUUGACCAUGAUCAUG-3'mhEGFR画-10:有义，5'.-GGAUGAAAGAAUGCAUUUGCCAAGU-3';反义-ACUUGGCAAAUGCA匿丽CAUCC-3,mhEGFR-11:有义，5'--GACAACCCUGACUACCAGCAGGACU-3';反义-AGUCCUGCUGGUAGUCAGGGUUGUdmhEGFR--12:有义，画CC匿雨AAGACCAUCCAGGAGGU-3';反义5'-ACCUCCUGGAUGGUC画AAGAAGG-3,另一个实施方案是以相同药物有效载荷使用这些寡聚物的组合。当靼向疾病过程中所涉及的三种或更多种基因的三种或更多种那些25个碱基对的siRM被包装在同一納米颗粒中并通过相同给药途径(或不同途径)递送时，治疗更有效，因为多种基因表达的敲减可以有效阻断特定的致肿瘤途径。可以利用这里应用的相同总原则进一步使用下列组命。25个碱基对的寡siRNA的组合可以获得更有效的治疗(多乾向)功效，它们中的每一种都可以靶向人和小鼠的相应基因人K^尸途径VEGF-VEGFR1-VEGFR2混合物A:mhVEGF25-l:有义，-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU-3。反义-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3,mhVEGFR125-3:有义，-CAAGGAGGGCCUCUGAUGGUGAUGU-3,;反义-ACAUCACCAUCAGAGGCCCUCC丽-3'mhVEGFR225-l:有义，-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3,;反义5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3'VEGF-VEGFR1-VEGFR2混合物B:mhVEGF25-l:有义，5'-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU-3';反义5'-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3'mhVEGFR125-6:有义，-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU-3,;反义-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-3,mhVEGFR225-2:有义，-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA"^;反义5'-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3,VEGF-VEGFR1-VEGFR2混合物C:mhVEGF25-2:有义，-GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACID;反义5'-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC-3'mhVEGFR125-6:有义，5'-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU-3/;反义-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-3,mhVEGFR225-2:有义，-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA-3';反义-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3'与分别靼向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的25个碱基对的寡siRNA的很多其它组合，每种组分以相同或不同的比例组成可以达到最好的抗血管生成功效。么和J^尸途径VEGF-VEGFR2-EGFR混合物A:mhVEGF25-1:有义，5'-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU-3,;反义5'-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3,mhVEGFR225-1:有义，5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3';反义5'-A腦GCCCGC,ACGGUCCGUAGG-3,mhEGFR-l:有义，-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3';反义5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGF-VEGFR2-EGFR混合物B:mhVEGF25-l:有义，-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU-■3'反义5'-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-■3'm固GFR225-2:有义，-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA--3'反义-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-.3'mhEGFR-5:有义，-CAAAGUGCCUAUCAAGUGGAUGGCA--3'反义5'一UGCCAUCCACUUGAUAGGCAC醫G--3'VEGF-VEGFR2-EGFR混合物C:mhVEGF25-2:有义，-GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU-3,;反义5'-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC-3'mhVEGFR225-2:有义，-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA-3';反义-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3,mhEGFR-9:有义，-CAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGA-3,;反义-UCAUCCAGCACUUGACCAUGAUCAUG-3'用耙向那三种基因的其它序列以不同组成和相同或不同比例的寡siRM可以产生很多其它组合。义乾々MC尸"C尸和^F途逸；VEGFR2-PDGFRa-EGFR混合物A:mhVEGFR225-l:有义，-CCUACGGACCGUIMAGCGGGCCAAU-S';反义-A腦GCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3,mhPDGFRa25-l:有义，-GAAGAUAAUGACUCACCUGGGGCCA-3,;反义5'-UGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUCUUC-3'mhEGFR-l:有义，5'-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAd;反义5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGFR1-VEGFR2--PDGFRa--EGFR混合物B:mhVEGFR125-6:有义，-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU-反义-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-mhVEGFR225-l:有义，-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-反义-AUUGGCCCGC陽ACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRa25-2:有义，5'-GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU-反义-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC-3'mhEGFR-l:有义，-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-反义-CUUUCUCACC匿UGGGAUCCAGAG-3'VEGFR2-PDGFRa-EGFR混合物C:mhVEGFR225-l:有义，-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3/反义5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRa25-2:有义，-GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU-3,反义-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAU訓C-3'mhEGFR-12:有义，-CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU-3'反义-ACCUCCUGGAUGGUC丽AAGAAGG-3'VEGFR2-PDGFRb-EGFR混合物A:mhVEGFR225-l:有义，-CCUACGGACCG■AGCGGGCCAAU-3,;反义5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRB25-5:有义，-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU-3,;反义-AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCdmhEGFR-1:有义，V-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3,;反义-CU匿UCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGFR2-PDGFRb-EGFR混合物B:m固GFR225-l:m訓GFRB25-10:mhEGFR-l:有义，5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3'反义5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3'有义，-CAUGCCUCCGACGAGAUCUAUGAGA-3'反义5'-UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG-3'有义，-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3'反义5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGFR2-PDGFRb-EGFR混合物C:mhVEGFR225-l:有义，5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3';反义-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3,mhPDGFRB25-5:有义，5'-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU-3';反义-AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCdmhEGFR-12:有义，5'-CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU-3,;反义-ACCUCCUGGAUGGUC画AAGAAGG-3'用耙向那三种基因的其它序列以不同组成和相同或不同比例的寡siRNA可以产生4艮多其它组合。还可以用三个以上序列进行组合VEGFR2-PDGFRab-EGFR混合物A:mhVEGFR225.-1:有义，-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3、反义-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-'3'mhPDGFRa25.-2:有义，5'-GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU-■3';反义5'-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC-■3'mhPDGFRb25--5:有义，5'-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU-■3。反义-AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC-mhEGFR-l:有义，-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-反义5'-C画CUCACCUUCUGGGAUCCAGAG--3'VEGFR1-VEGFR2-PDGFRb-EGFR-VEGF混合物A:mhVEGFR125--6:有义，-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU--3、反义-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-mhVEGFR225--1:有义，5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-反义5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG--3'mhPDGFRB25-.10:有义，5'--CAUGCCUCCGACGAGAUCUAUGAGA-3';反义5'-UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG--3'3'mhEGFR-l:有义，-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG--3。反义5'-C酬CUCACCUUCUGGGAUCCAGAG--3'mhVEGF25-2:有义，-GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU--3';反义，-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC--3'VEGFR卜VEGFR2--PDGFRb-EGFR-VEGF混合物C:m跳GFR125-6:有义，-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU--3';反义-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-画3'mhVEGFR225-1:有义，-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU--3';反义-AUUGGCCCGCU狙CGGUCCGUAGG--3'mhPDGFRa25-,2:有义，-GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU--3';反义-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAU訓C--3'mhPDGFRB25-.5:有义，-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU--3';反义-AGUCACAGA歸UGACCAG，GCC--3'mhEGFR-12:有义，-CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU--3';反义-ACCUCCUGGAUGGUC訓AAGAAGG.-3'mhVEGF25-2:有义，-GCAGC丽AGUUAAACGAACGUACU--3';反义，-AGUACGUUCG画AACUCAAGCUGC.画3'B.组合的VEGF途径基因抑制本发明的抑制NV的组合物和方法的开发过程中考虑了很多因素。首先，NV疾病是复杂的并且是多种蛋白和异常超表达的致病基因和致病蛋白的多种机能失常的结果。其次，激活RNA干涉(RNAi)的核酸试剂是以序列特异性方式进行的基因表达的高选择性抑制剂。第三，调节蛋白活性对NV的抑制可以通过很多方法实现，包括蛋白功能的抑制(拮抗剂)、蛋白功能的刺激(激动剂)、蛋白表达水平的降低和蛋白的转录后修饰。NV疾病的治疗理想地需要复杂的治疗作用以有效关闭对疾病进展关键性的特定生物学途径，包括同时阻断配体及其受体的功能，同时阻断受体活性和下游信号蛋白并且同时阻断途径的冗余元件。这就是NV疾病和和VEGF途径的情况。然而，对于两三种或更多种蛋白具有选择性的单一试剂的鉴定是困难的并且即使不是不可能，也经常不切实际。为了克服这个困难，在现代医学中使用药物的组合已经多少有点儿趋势。在肿瘤学应用中，联合化疗已经获得了显著的抗癌功效。一个实例是使用多西紫杉醇、异环磷酰胺和顺钿联合疗法来治疗伴有从前列腺癌的多发性骨转移的口咽癌(2)。在其它治疗方面，另一个实例是使用皮质类固醇、甲硝唑和万古霉素联合治疗溃疡性结肠炎(3)。对于控制不完全的2型糖尿病的治疗，评估了向格列美脲和二曱双胍联合治疗增加罗格列酮的功效和安全性(4)。尽管那些临床研究已经证明了显著的治疗功效，但是由于它们不同的起始来源、不同的制造方法和不同的化学性能，较高剂量的毒性和长期的安全性始终是主要关心的问题。为了克服这些问题，本发明的一个方面是使用siRNA寡核苷酸基因抑制剂提供独特的优点，用在同一治疗中靶向多种致病基因的siRNA的組合而获得联合作用。本发明提供的一个优点是全部siRNA寡核苷酸在化学和药理学上非常相似并且可以来自相同的起始来源和相同的制造方法的结果。本发明提供的另一个优点是多种siRNA寡核苷酸可以配制为单个制剂，如纳米颗粒制剂。因此，本发明的一个方面是组合siRNA试剂，以便获得多种VEGF途径基因的特异性和选择性抑制并且因此达到抑制NV疾病和更好的临床益处。本发明提供了^f艮多siRNA靶向组合，包括以下组合靶向VEGF本身连同其受体包括VEGFRl(Fltl)和VEGFR2(KDR)、平行生长因子包括PDGF和EGF及其受体、下游信号因子包括RAF和AKT、和转录因子包括NFKB，以及它们的组合。一个优选实施方案是抑制VEGF及其两个受体VEGFR1(Fltl)和VEGFR2(KDR)的siRNA的组合。另一个优选实施方案是抑制VEGF及其受体、PDGF及其受体和EGF及其受体的siRNA的組合。再一个优选实施方案是抑制VEGF及其受体和下游信号的siRNA的组合。dsRNA寡核苷酸可以联合作为治疗NV疾病的治疗剂。在本发明的一个实施方案中，它们可以混合在一起成为混合物，而在另一个实施方案中，它们可以通过相同途径或通过不同途径和制剂顺序地给予，和在又一个实施方案中，可以将一些作为混合物给予，一些顺序地给予。本领域技术人员将会获知实现治疗NV疾病的siRNA的其它组合和它们的组合方法。C.组合的VEGF途径拮抗剂和基因抑制疾病是复杂的并且常常涉及多种病理过程以及疾病症状严重程度的不同，且经常是一个患者与另一个患者之间的不同。很多疾病由致病或疾病控制基因的异常超表达，或由外来传染性生物所引起，或二者皆有。疾病进展、随时间推移产生对治疗的反应降低和耐药性也限制单一治疗或方式的临床益处。克服这类限制的一种方法是通过治疗和药物的联合使用。因此，本发明的一个方面是将siRNA试剂与其它药剂组合，以便达到强烈、持久和稳固抑制NV疾病和优异的临床益处。本发明提供了siRNA试剂连同其它药剂的多种组合，包括VEGF本身及其受体的治疗性siRNA与VEGF本身及其受体的拮抗剂(如Avastin)的组合。本发明还提供了治疗性siRNA试剂与口服有效的激酶抑制剂(如SU11248)的组合。本发明还提供了治疗性siRNA试剂与免疫疗法的联合。本发明的另一个实施方案是将siRM与抗增殖剂组合。本领域技术人员将会获知实现治疗NV疾病的siRNA试剂和其它药剂的其它组合。D.制剂和给药基于合成试剂开发可靼向组织的核酸递送系统方面的近来努力已经产生了有前景的结果。作为稳固、有效的递送系统应当具有多层次的选择性，即选择性定位于疾病组织和选择性抑制驱动病理学的生化途径。此外，当前最有效的疗法需要"多靶向"治疗剂，即具有多种活性机制、阻断多余病理学途径的由设计者设计的"dirty"药物。一确的亚细胞区室的"灵敏的(smart)"纳米颗粒。在一个实施方案中，本发明提供了包含可靶向組织的递送、具有三个附加性能的siRNAdsRM寡核苷酸的制剂。这些性能是核酸结合成可将siRM释放入细胞质的核心、保护核酸不受非特异性相互作用和提供细胞摄取的组织靶向。没有一种材料在一个分子中具有所有的这些所需性能。本发明提供了使用三种材料的模块式缀合物以组合和集合所需的多种性能的組合物和方法。它们可以被设计和合成以合并各种性能，然后与siRNA有效载荷混合形成纳米颗粒。根据这些实施方案，一种优选实施方案包括靶向新血管系统的模块式聚合物缀合物，其通过将对那些细胞具有特异性的肽配体与保护性聚合物的一端偶联，在其另一端与核酸的阳离子载体偶联而形成。这种聚合物缀合物具有三个功能域，有时称为三功能聚合物(TFP)。这种缀合物的模块式设计允许每种成分单独地替换和优化。一种可供选择的方法是在预先形成的納米颗粒上附着表面涂层。立体聚合物涂层吸附到聚合物上是自限性的；一旦立体层开始形成，它将阻止进一步添加聚合物。本发明的组合物和方法允许优化三种功能中的每一种，基本上与另外两种功能无关的有效方法。核酸核心颗净立的形成挥其生物活性的方式。应对具有合成材料的核酸治疗剂的这种挑战的努力包括使用开发作为体外DNA转染试剂的单纯阳离子脂质和聚合物复合物。很快发现使核酸进入细胞并且获得生物活性是极其困难的。例如，实现用于转运的稳定核酸包装是可能的，但并非总是容易与将核酸释放入细胞核，或在siRNA的情况下将其释放入细胞质的需要达成一致。而且，很多体外有效的阳离子脂质和聚合物当给予体内时不保持活性，不幸的是其原因大部分仍然未知，为开发在体内有活性的复合物提供的预测价值很少。对研究RNA的兴趣已经远远落在后头，直到现在对siRNA的兴趣才刚刚迸发。尽管如此，肺组织常常可以由于DNA复合物的静脉内给药而被转染。当将siRNA用作有效栽荷时，已观察到相似的生物活性。最近的研究已鉴定到一类阳离子聚合物，其由看来具有宽泛能力的确定多肽结构组成。可以合成具有包含线性和支化型的确定结构的表明它们具有与几种类型核酸，包括质粒和DNA或RNA寡核苷酸一致的活性。此类阳离子聚合物的成功看来起因于合并特异性结构包括分支，和使用强和弱碱的混合物以形成具有混合阳离子性能的聚合物的设计。这个特殊类别的另一个优点是它的可生物降解性质，其完全由天然氨基酸构建而成，即使是非天然分支。由于具有至少两种性能的聚合物可用于优化，因此用于与siRNA形成有效的核心复合物的材料的继续开发可以精化并集中于进一步改善平衡稳定性和胞质释放。优化的形成核心的聚合物可以用作其余功能的基础。保护性立体涂层具有类似细胞外膜的外脂双层的均匀脂质体可以被迅速识别并从血液中清除。然而，与病毒颗粒不同，纳米技术可以使用宽范围的合成聚合物化学。已证明亲水聚合物，如PEG和聚缩醛和聚噁唑啉可在胶体药物递送系统表面上有效形成"立体"保护层，无论是脂质体、聚合物还是静电纳米颗粒，从而减少从血液中的免疫清除。首先开发了使用该立体PEG层并最广泛地研究了立体稳定脂质体。除了立体聚合物涂层外，本发明还提供了可供选择的方法，如表面电荷的化学还原。空间障碍和生物学结果源自物理性能，而非化学性能的证据是强有力的。已经报道了几种其它的亲水聚合物作为PEG的替换物。对空间稳定脂质体的物理研究为聚合物层的物理性能提供了强大的机械论基础并可以用于在其它类型颗粒上完成相似涂层。然而，尽管物理研究已经显示在具有核酸的聚合物复合物表面上形成了相似聚合物层，并荻得了相似的生物学特性，但是现在我们仍缺乏足够的信息将这种物理性能用于精确预测期望的生物学特性，防止从血液中免疫清除。高深的研究是构建纳米颗粒复合物，它们的物理性能变化是可控的，随后确定它们的生物学特性。根据这许多的脂质体研究，很清楚对生物活性具有最大影响的物理性能可以通过合成两种聚合物和接枝密度规格不一的缀合物基质而获得。注意尽管表面立体层作用归因于物理性能，但是最佳的缀合化学仍然取决于立体聚合物和与其偶联的栽体的特异性化学性质。形成具有表面立体聚合物层的纳米颗粒的方法也是关联参数。本发明的一个实施方案提供了使立体聚合物与栽体聚合物偶联以得到缀合物的方法，该缀合物与核酸自动装配形成具有立体聚合物表面层的纳米颗粒。另一个实施方案是在预先形成的纳米颗粒上附着表面涂层。表面立体层的自动装配形成依赖于所述栽体聚合物与有效载荷的相互作用，而不是依赖于穿透形成的立体层与颗粒表面反应。在这种情况下，立体聚合物对栽体聚合物结合核酸有效载荷的能力的作用可能对颗粒形成具有不良影响，并因此对表面立体层具有不良影响。如果这种情况发生的话，载体上的立体聚合物的接枝密度将会已超过它的最大限度，或接枝的结构性质还不够。靶向特定组织的表面暴露的配体纳米颗粒选择性到达乾细胞内部的能力在于它诱导特异性受体介导的摄取的能力。本发明通过具有结合特异性的暴露配体而提供。尽管已经广泛研究了靶向胶体递送系统的很多类型的配体，但是很多依赖于抗体。二十多年前，这种想法被扩展将抗体与脂质体，通常称为免疫脂质体的表面偶联。在配体密度的影响中出现了一个重要的参数。广泛的研究在体外获得了良好的成功，但是仅仅最近才开始在体内产生阳性结果，现在到达了递送小分子药物的临床开发阶段。抗体倾向于满足用作配体的很多要求，包括良好的结合选择性和用于几乎任何受体的近乎常规的制备方法和蛋白偶联方法的宽泛适用性，而不考虑纳米颗粒的类型。单克隆抗体甚至显示出穿过血脑屏障的效用迹象。另一方面，它们不理想。作为靶向配体，抗体是很大的蛋白，约150Kd。这使得缀合难以产生特定的取向，除非可以引入额外的Cys氨基酸残基，或可以鉴定用于化学偶联的其它独特位点。截短的形成可用于减小尺寸，但是可以发生亲和力丧失，如对于"scFV"构建而言。抗体的另一个麻烦的特性是它们的生物活性众多，很多在与抗原结合无关的结构域中传达，其是它们在哺乳动物免疫系统中作用的一部分。可以充分发挥这些免疫活性，而且它们还可以干扰纳米颗粒立体层避免免疫清除的作用。也已考虑是天然配体的其它蛋白靶向纳米颗粒，如针对转铁蛋白受体的转铁蛋白和因子VII以及因子VIIa蛋白以及它们的片段。这些活性剂可以是良好的候选者，但是它们的成功使用需要相当大的努力以鉴定特异性偶联化学，不丧失结合活性的偶联，和暴露于颗粒上，而不再引入免疫清除。一类优选的配体是对内在化受体具有强选择性结合亲和力的小分子量化合物。研究已经评估了天然代谢产物如维生素像叶酸和维生素Bl，多糖像小麦胚芽凝集素或e-选择蛋白的唾液酸Lewis51,和肽结合结构域像整联蛋白的RGD。肽提供了一类多用途的配体，因为噬菌体展示文库可用于筛选天然或非天然序列，甚至用体内淘选方法。这种噬菌体展示方法可以允许保留在一端未配对的Cys残基，以便于偶联而无论什么序列。最近使用RGD肽将纳米颗粒靶向递送至新血管系统的体内成功表明这种方法可以非常有效满足有效配体的主要要求不干扰配体结合或诱导免疫清除，而却使选择性受体介导的乾细胞的摄取成为可能的特异性化学。本发明的优选实施方案包括RGD-2C肽配体缀合物。RGD-2C配体提供了定位于新血管系统以及肿瘤新血管系统附近的肺瘤细胞，含有核酸的纳米颗粒的胞内内在化和给出核酸的有效生物活性的核酸的释放。本发明的另一个优选实施方案包括两种或多种配体的配体缀合物的混合物，或两种或多种配体的缀合物。本发明的优选实施方案包括RGD肽配体与因子VII蛋白或它们的肽片段或化学类似物的混合物。本发明的另一个优选实施方案包括RGD肽配体与配体结合e-选择蛋白的混合物。本发明的另一个优选实施方案包括RGD肽配体与apoE蛋白或它们的肽片段或化学类似物的混合物。本发明的另一个优选实施方案包括RGD肽配体与肿瘤细胞结合配体如叶酸、转铁蛋白、卟啉、bFGF和EGF的混合物。本发明的另一个优选实施方案包括三种或多种这些配体的混合物。本发明的一个优选实施方案包括载体的一个结构域中两种或多种配体和所述载体的第二个结构域中多胺试剂的缀合物。本发明的另一个优选实施方案包括配体缀合物的混合物。该配体缀合物的混合物可以包含与同一载体试剂，和任选与该载体的同一结构域缀合的配体，或配体缀合物的混合物可以包含与不同载体试剂，或任选与载体试剂的不同结构域缀合的配体。配体缀合物的混合物可以进一步包含保护剂、融合剂或栽体试剂，如PEG或聚缩醛或pH敏感性聚合物或多胺或组氨酸-赖氨酸共聚物。本发明的组合物和方法提供了RNAi的给药，包括聚合物、聚合物缀合物、脂质、胶束、自动装配胶体、纳米颗粒、空间稳定的纳米颗粒或配体定向的纳米颗粒。W001/49324中所述类型的靶向合成载体可以用于诱导RNAi的本发明核酸的全身递送，其特此全部引入作为参考。在一个实施方案中，可以制备和使用PEI-PEG-RGD(聚乙烯亚胺-聚乙二醇-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)合成栽体，例如在W001/49324的实施例53和56中的。该载体通过静脉注射用来全身递送RNAi,体分子。例如，该载体可能具有由核心复合物組成的内壳层，该复合物包含RNAi和至少一种形成复合物的试剂。该栽体还可能含有融合部分，其可以包含固定于核心复合物的壳层，或可以直接掺入核心复合物。该载体可以进一步具有稳定载体和降低与蛋白和细胞的非特异性结合的外壳部分。外壳部分可以包含亲水聚合物，和/或可以固定于融合部分。外壳部分可以固定于核心复合物。该栽体可以含有增强载体与耙组织和细胞群结合的靶向部分。合适的靶向部分是本领域已知的并且在W001/49324中有详细描迷。a,含有^Y7尸途逸"^VJ^i^/Hfe/^韵^^"在^刺备本发明的一个实施方案提供了抗VEGF途径siRNA短dsRNA分子的RGD介导的配体定向的纳米颗粒制剂的组合物和方法。图29和30显示了制备含有siRNA的RGD-2C介导的组织靼向纳米颗粒的方法。该靶向配体，含有肽(ACRGDMFGCA)的RGD与立体聚合物如聚乙二醇或具有相似特性的其它聚合物缀合。这种配体-立体聚合物缀合物进一步与聚阳离子如聚乙烯亚胺或其它有效材料如组氨酸-赖氨酸共聚物缀合。该缀合物可以是共价或非共价键，且共价键可以是不可切割的或它们可以是可切割的，如通过水解或通过还原剂。该缀合物可以用异双功能聚合物来制备，如市场上可买到的NHS-PEG-VS试剂(Nektar)或为制造而准备的异双功能试剂，或用同双功能聚合物，如市场上可买到的NHS-PEG-NHS试剂(RappPolymere)或为制造而准备的同双功能试剂。本发明的一个优选实施方案包括使用同双功能NHS-PEG-NHS试剂，如可从RAPPPolymere购得的试剂，首先与通过固相合成制备的RGD-2C肽偶联，和随后与含有多胺的聚合物，如市场上可买到的PEI或通过固相合成制备的组氨酸-赖氨酸共聚物偶联。本发明的另一个优选实施方案包括RGD-PEG-多胺缀合物与多胺聚合物，如PEI或组氨酸-赖氨酸共聚物的第一组合，和所述聚合物混合物与dsRNA寡核苷酸的第二混合物的第二组合。一种包含下列物质的溶液与一种包含核酸的溶液以期望比例混合以获得含有siRNA的納米颗粒所述物质是聚合物缀合物，或聚合物缀合物与其它聚合物、脂质或胶束的聚合物，如包含配体或立体聚合物或融合剂的材料，和在一个实施方案中所述核酸是靶向感兴趣的特异性基因的siRNA。在这个实施方案中，纳米颗粒由分层的纳米颗粒自动装配形成，包括聚合物缀合物和核酸混合。带负电荷的核酸和聚合物缀合物的带正电荷区段之间的非共价静电相互作用驱动导致纳米颗粒形成的自动装配过程。这个过程包括两种溶液的简单混合，其中含有核酸的一种溶液被添加至含有聚合物缀合物的另一种溶液中，随后或同时进行搅拌。在一个实施方案中，混合物中带正电荷的组分和带负电荷的组分积来确定。在另一个实施方案中，这两种溶液在使用混合器具如静态混合器(图30)的连续流动条件下混合。在这个实施方案中，两种或多种溶液以产生一定比例的溶液的速率和压力引入静态混合器，其中溶液流在静态混合器内部得到混合。混合器可能以平行或连续的方式排列布置。E.组合制剂和电场对于某些应用，可以在施加或者不施加电场的情况下给予RNAi。这可以用于例如，通过直接注射入例如肿瘤组织和直接注射进入血管生成组织或具有新血管系统的组织或其附近来递送本发明的RNAi分子。siMA可以存在于合适的药物载体，例如盐水溶液或緩沖盐水溶液中。通过参考下列实施例，由此一般描述的本发明将更容易被理解，这些实施例作为例证提供并且不意欲限制本发明。实施例实施例1:联合使用靼向VEGFR2的siRNA双链和抗VEGF的Bevacizumab(Avastin)抑制肿瘤生长。材料和方法试剂Avastin、抗VEGF的单克隆抗体(25mg/ml，Genetech);针对小鼠VEGFR2的siRNA，序列[(a)AAGCTCAGCACACAGAAAGAC;(b)AATGCGGCGGTGGTGACAGTA);针对萤光素酶的siRNA(Qiagen);由1.5克2，2，2，三溴乙醇和1.5ml叔戊醇(Cat#T4840-2，Cat#24048-6，Aldrich)于100ml蒸馆水，St.Louis,MO]中制成的Avertin。小鼠无胸腺雌性棵鼠，5至6周龄，购自TAC0NIC并常规笼养。所有研究均遵循国家研究委员会生命科学委员会实验动物资源管理委员会的方针。马里兰Rockville的生物医学研究所的动物设备由美国实验动物管理协会完全认可。细胞结肠癌细胞系DLD-1(CCL-221，ATCC)在含2mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、lOmMHEPES和1.0mM丙酮酸钠、10。/。胎牛血清的RPMI1640培养基中生长。步骤1)收荻接近融合的DLD-1细胞并重悬于无血清RPMI培养基中。2)用Avertin0.4ml/小鼠腹膜内注射麻醉小鼠。3)0.lml无血清RPMI培养基中的1亿个细胞左侧皮下注射到小鼠背部，建立异种移植肿瘤模型。4)接种肿瘤细胞后五天，用测径器测量生长肿瘤的大小。然后将小鼠随机分成6组，每組8只。5)实验设计和剂量方案如下。6)与RPP形成复合物后，通过尾静脉注射递送siRNA。表I.抗血管生成siRNA/mAb治疗DLD-1肿瘤模型的方案<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>结果与讨论1.携带VEGFR2特异性siRNAdsRNA的RGD配体定向的纳米颗粒本身在以仅仅2mg/kgsiRNA的量重复全身静脉内给药(图l)后能够实现肿瘤生长抑制。2.这种基于siRNA的抗血管生成活性(靶向VEGFR2)能够增强VEGF单克隆抗体(mAb)介导的抗血管生成，进一步导致肿瘤生长抑制(图1)。3.尽管许多生化途径对于恶性肿瘤形成可能独立或共同起决定性作用，但是大家公认，新血管生成是很多类型癌症生长的关键。因此新血管生成过程自然已经成为对于肿瘤药物开发最多的靶向范围之一。在参与新血管生成的许多因子当中，据信VEGF是重要的控制因子并且是能够获得如同Avastin所达到的临床益处的治疗效果的因子，Avastin是抗VEGF的单克隆抗体和被证明抑制结肠癌生长。NV靶向VEGFsiRM基因抑制的组合当以组合方案给予时，显示出对拮抗剂治疗是辅助性的迹象。4.该实施例显示了使用基因抑制剂和用拮抗剂如mAb抑制剂在同一治疗方案中改善治疗结果的巨大益处。5.RT-PCR结果直接证明用纳米颗粒递送的VEGFR2特异性siRNA治疗的肿瘤样品中的VEGFR2mRNA水平与未经治疗的肿瘤中的表达水平相比被显著下调(图2)。6.免疫组织化学(IHC分析)表明已经发生了是新血管系统标记的VEGFR2和CD31的蛋白水平敲减(图3)。7.对来自纳米颗粒/VEGFR2siRM单独治疗，和与Avastin组合治疗的血液样品中IFN-a活性的ELISA测定没有显示任何显著(可检测)的IFN活性上调或诱导(图4)，表明NV的抑制和肿瘤生长的抑制不是由于非特异性干扰素介导的作用。总结这个实施例说明了本发明，因为它提供了用小干扰dsRNA寡核苷酸基因抑制剂与单克隆抗体(mAb)组合在同一治疗方案中治疗癌症的组合物和方法，其中该抑制剂抑制致病基因的表达和致病蛋白的生物学功能，导致治疗功效增强。此外，该实施例提供了同时阻断配体(例如VEGF)及其受体(例如VEGFR2)以提供有效抑制特定生物学途径(例如血管生成途径)，由此提供抑制疾病进展的治疗的例证。因此，由两种有效的靼向生物抑制剂RNAi和mAb提供的抑制活性的联合应用是有效治疗NV疾病包括癌症的方法。实施例2:siRNA介导的体外和体内VEGF沉默人VEGF165特异性siRNA通过Lipofectamine转染进入MCF-7/VEGF165细胞(hVEGF超表达)，导致细胞中hVEGFmRNA的敲减(图2上图)。使用电穿孔法，hVEGF165特异性siRNA转染MCF-7/VEGF165细胞，导致如ELISA分析确定的hVEGF表达的下调。当hVEGF165特异性siRNA通过肿瘤内给药重复递送时，MCF-7/VEGF165细胞诱导的异种移植肿瘤的生长被显著抑制。当收集肿瘤组织用于测试hVEGFmRNA表达时，进一步确*〖人了这种抑制，其导致基于RT-PCR分析的显著下调。使用相同的hVEGF165特异性siRNA，我们用头和颈鳞状细胞癌(HNSCC，1483细胞)异种移植模型也能证明肿瘤生长抑制，通过以七天间隔肿瘤内5次重复给药。每次注射需要含10Pg特异性siRNA的15至30W无RNA酶的水溶液。实施例3:25个碱基对的平端双链siRNA比常规具有3'突出端的19个碱基对的siRNA在沉默靶基因表达方面更有效在一项体外siRM转染研究中，使用电穿孔介导的转染方法，用25个碱基对的平端双链siRNA(hVEGF-25-siRNA-a、hVEGF-25-siRNA-b、hVEGF-25-siRNA-c、Luc-25-siRNA)或具有3'突出端的19个碱基对的siRNA(hVEGF-siRNA-a、GFP-siRNA-a)转染超表达人VEGF(hVEGF)的MCF/165乳腺癌细胞。将4xl(T个MCF7/165细胞重悬于与5PgsiRNA混合的200WsiP0RTsiRNA电穿孔緩冲液(Ambion)中，然后4吏用ElectroSquarePoratorECM830(BTX，FisherScientific)进行电穿孔处理。电穿孔参数是电压500v;脉沖持续时间60脉冲数2;脉沖间隔1秒。将转染细胞以5xl04个细胞/孔的密度接种至24孔板中，并在含5%0)2的37X:培养箱中培养。转染后"小时，从每个孔收获培养基并使用商业hVEGFELISA试剂盒(R&DSystems)测定培养基中人VEGF蛋白的浓度。我们观察到在25个碱基对的hVEGF-siRNA处理的细胞中比在常规19个碱基对的hVEGFsiRM处理的细胞中显著更强的hVEGF靼基因抑制。在siRNA转染后24小时，与用常规19个碱基对的hVEGF-siRNA-a转染的细胞中观察到的大约60。/。hVEGF蛋白减少相比，用25个碱基对的平端双链hVEGF-25-siRNA分子转染的细胞的培养基中分泌的hVEGF蛋白减少75%以上。在相同的siRNA转染条件下，非特异性序列对照25个碱基对的平端双链siRNA(Luc-25-siRNA)或具有3'突出端的常规GFP-siRNA都不影响VEGF表达(图7)。实施例4:25个碱基对的平端双链siRNA介导延长的靶基因沉默在另一项体外siRNA转染研究中，使用电穿孔介导的转染方法，用25个碱基对的平端双链siRNA(hVEGF-25-siRNA-a、hVEGF-25-siRNA-b、hVEGF-25-siRM-c、Luc-25-siRNA)或具有3'突出端的19个碱基对的siRNA(hVEGF-siRNA-a、GFP-siRNA-a)转染超表达人VEGF(hVEGF)的MCF/165乳腺癌细胞。将4xl(T个MCF7/165细胞重悬于与2Pg或5jugsiRNA混合的200WsiPORTsiRNA电穿孔緩冲液(Ambion)中，然后使用ElectroSquarePoratorECM830(BTX，FisherScientific)进行电穿孔处理。电穿孔参数是电压500v;脉冲持续时间60脉冲数2;脉沖间隔1秒。将转染细胞以5xl04个细胞/孔的密度接种至24孔板中，并在含5%0)2的37'C培养箱中培养。在转染后24、48、72、96和120小时，从每孔收获培养基并用新鲜培养基替换。使用商业hVEGFELISA试剂盒(R&D)测定在各个时间点收获的培养基中人VEGF蛋白的浓度。用在各个非特异性对照siRM处理的细胞中测定的hVEGF蛋白水平来标准化siRNA介导的hVEGF敲减。我们观察到在测试的每个时间点，在25个碱基对的hVEGF-siRM处理的细胞中比在常规19个碱基对的hVEGFsiRNA处理的细胞中显著更强和延长的hVEGF靶基因抑制。在siRNA处理后120小时，与用5Pg常规19个碱基对的hVEGF-siRM-a转染的细胞中观察到的低于20%hVEGF蛋白减少相比，用5的25个碱基对的平端双链hVEGF-25-siRNA分子转染的细胞的培养基中分泌的hVEGF蛋白仍减少60%以上。我们还观察到25个碱基对的平端双链hVEGF-25-siRNA分子产生的剂量依赖性siRNA介导的hVEGF基因抑制。基于我们的观察，25个碱基对的平端双链hVEGF-25-siRNA分子不仅给出更强的靶VEGF基因抑制，而且还引起显著更长持续时间的有效靶VEGF基因抑制。例如，与使用5Pg常规19个碱基对的hVEGFsiRNA实现的仅48小时的60%以上hVEGF蛋白减少相比，使用25个碱基对的平端双链hVEGFsiRNA实现了至少120小时的60%以上蛋白减少。因此，25个碱基对的平端双链siRNA是可以导致更显著治疗功效的更有效的乾基因抑制剂。附加信息包括(1)Luc-25-siRNA具有(有义链5'-rGGAACCGCUGGAGAGCAACUGCAUA-3'和反义链5'-rCCUUGGCGACCUCUCGUUGACGUAU-3，)的序列；(2)hVEGF-siRNA-a具有(有义链5'_rUCGAGACCCUGGUGGACAUdTT-3'和反义链5'-rAUGUCCACCAGGGUCUCGAdTT-30的序列；(3)GFP-siRNA具有(有义链5,-^GCUGACCCUGAAGUUCAUCdTT-3,和反义链5'-rGAUGAACUUCAGGGUCAGCdTT-30的序列；(4)hVEGFR2-25-siRNA-c:5'-r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)-3'。实施例5:25个碱基对的平端双链siRNA有效敲减人VEGFRl和VEGFR2体外表达三种特异性靶向人VEGFR1的25个碱基对的平端双链siMA通过电穿孔法转染HUVEC细胞。转染后96小时通过ELISA试验测定膜结合VEGFR1和VEGFR1的游离胞外片段。与两种其它siRNA相比，VEGFRl-siRNA双螺旋a表现最强的VEGFR1沉默活性，这是对于细胞培养上清液中的细胞裂解物蛋白和游离片段二者而言(图9和10)。当使用相同方法评估三种靶向人VEGFR2基因的25个碱基对的平端双链siRNA时，我们发现全部三个双螺旋在转染后24小时和72小时两个时间点显示有效的沉默活性(图11)。实施例6:25个碱基对的平端双链siRNA在MDA-MB-435异种移植肿瘤中介导强的抗胂瘤功效使用已知具有VEGF和bFGF蛋白高表达的MDA-MB-435乳腺癌细胞系，耙向人VEGF165基因序列的25个碱基对长的siRNA双螺旋在每5天三次重复肿瘤内给予lOpg(图12)后，显示强烈的肿瘤生长抑制活性。实施例7:靶向VEGF、VEGFR1和VEGFR1基因的siRM混合物比仅仅靶向那些基因之一的siRNA单独任何一个在HSV诱导的眼新血管生成模型中更有效最近，我们证明了在动物疾病模型中以相同剂量，含有靶向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA的siRNA混合物可以达到比仅仅靼向那些基因之一的siRNA更有效的抗血管生成功效。4吏用这种方法，我们能够有效阻断对病理性血管生成起关键作用的VEGF途径(图13)。含有大量具潜在生物活性的含CpG基序的HSVDNA可以诱导有效的血管生成因子血管内皮细胞生长因子(VEGF)并且用抗体中和VEGF使HSV诱导的血管生成减到最少。也建立了便利的模型，其中具生物活性的含CpG寡核苷酸(ODN)也显示通过诱导VEGF来诱导新血管生成。在本研究中使用这个模型以评估RNA干扰(RNAi)抑制VEGF表达和应答性的治疗潜力。试浙硫代磷酸0DN由DennisM.Klinman(生物制剂的评估和研究(BiologiesEvaluationandResearch)，食品与药品管理局，Washington,DC)友情提供。此研究中使用的刺激性ODN的序列是1466TCAACGTTGA和1555，GCTAGACGTTAGCGT。使用ODN1466和1555的等摩尔混合物进行了随后的研究。^为、f设#RNAi耙向三种mVEGF途径因子-mVEGFA和两种mVEGF受体(mVEGFRl和mVEGFR2)。对于每个基因靼，两个耙序列分配于相同mRNA上的不同位置。设计与上述乾序列对应的siRNA。根据Tuschl提出的指导方针设计这些siRNA14，15。由Qiagen(巴伦西亚，CA)合成设计的siRM(有义链和反义链的双螺旋)。所有的siRM是3'端具有两个核苷酸(TT)突出端的21个核苷酸长的双链寡RNA。mVEGFA的靶序列是(a)AAGCCGTCCTGTGTGCCGCTG和(b)AACGATGAAGCCCTGGAGTGC。mVEGFRl的耙序列是(a)AAGTTAAAAGTGCCTGAACTG和(b)AAGCAGGCCAGACTCTCTTTC。mVEGFR2的靭^序列是(a)AAGCTCAGCACACAGAAAGAC和(b)ATGCGGCGGTGGTGACAGTA。无关siRM对照的合成，^使用各自针对LacZ和萤火虫萤光素酶的两个靶序列。它们是LacZ(a)AACAGTTGCGCAGCCTGAATG和(b)AACTTAATCGCCTTGCAGCAC，LUC(a)AAGCTATGAAACGATATGGGC和(b)AACCGCTGGAGAGCAACTGCA.4吏用针对各个siRNA的a和b的等摩尔混合物进行了随后的研究。V、處5至6周龄雌性BALB/c小鼠(H-2d)购自HarlanSprague-Dawley(Indianapolis,IN)并常规笼养。所有研究均遵循国家研究委员会生命科学委员会的实验动物资源管理委员会的方针。田纳西州大学(Knoxville，TN)的动物设备被美国实验动物管理协会完全认可。病善所有步骤中均使用HSV-1毒林RE(由亚拉巴马大学(Mobile,AL)的RobertLausch博士友情提供)。病毒生长在Vero细胞单层(目录号CCL81;美国典型培养物保藏中心，Manassas,VA)中，滴定并以等份保存在-80X:直至使用。为了测试RNAi的体外功效，使用下列细胞系。使用RAW264.7yNO细胞(CRL-2278，ATCC)测试了siVEGFA特异性敲减在这些细胞中自发表达的VEGFA基因的效率。将细胞铺在六孔平板上含有10%胎牛血清的RPMI中，在5%C02、37*€下培养过夜。细胞植板后一天，使用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad,CA)用不同浓度的siVEGFA或siLuc(分别以O、0，1、0.5、1.0或2.0ml/孔)转染细胞。二十四小时后，从这些细胞中提取RNA用于逆转录酶-聚合酶RNA提取和RT-PCR。使用SVR细胞(CRL-2280，ATCC)测试了siVEGFRl特异性敲减在这些细胞中组成型表达的VEGFR1基因的效率。将细胞铺在六孔平板上含有5%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中，在5%C02、37。C下培养过夜。细胞植板后一天，使用Lipofectamine2000，用不同浓度的siVEGFRl或siLuc(分别以0、0.1、0.5或1.0ml/孔)转染细胞。四十八小时后，从这些细胞中提取RM用于RSPCR以检测VEGFR1(参见RNA提取和DNA模板特异性PCR)(RS-PCR)。用表达mVEGFR2的质粒转染293细胞(CRL-l573，ATCC)，用于检测外源mVEGFR2的敲减。将细胞铺在六孔平板上含有5%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中，在5%C02、37'C下培养过夜。细胞植板后一天，使用Lipofectamine2000，用质粒pCI-VEGFR2(0.2ml/孔)和siVEGFR2(a、b、a—b)或siLuc(分别0、0.1、0.5或1.0Pg/孔)共转染细胞。四十八小时后，从这些细胞中提取RNA用于RS-PCR以检测VEGFR2。>#應微炎试验这项研究中使用的角膜微袋试验遵守Kenyon及其同事的实验方案。插入角膜的小丸通过以下方法制备混合已知量的CpG0DN、硫糖铝(10mg,BulchMeditec，Vaerlose，丹麦)和在乙醇中的7jC分子(hydron)聚合物(120mg/1ml乙醇；InterferonSciences,NewBrunswick,NJ)，并将混合物涂在15mm2合成网格片(SefarAmerica,Inc.,KansasCity,M0)上。令混合物风干并将网格的纤维拉断，产生含CpG0DN的小丸。在立体显微镜(LeicaMicrosyte迈s，Wetzlar，德国)下制造微袋(每组四眼)并将含CpGODN的小丸插入微袋中。在小丸移植后第4天和第7天使用带有立体显微镜的测径器(BiomedicalResearchInstruments,Rockville，MD)评估血管生成。领情源自朝向角膜中心的角膜缘血管环的新血管的长度和以时钟小时计呈现的新血管的宽度。在这种情况下，每时钟小时等于30°。根据用于椭圆的公式计算血管生成面积。的沐力迷送小丸移植后第4天和第7天都监测角膜缘。在小丸移植后第4天，与对照siLacZ得到的结果相比全部三种测试siRNA导致角膜新血管生成的显著抑制(p<0.05)。三种测试的siRNA的组合是最有效的抑制剂，提供新血管生成减少大约60%(p<0.01)。全1迷送乾/^F^,途逸差萄^s/iW//趟^C/^谬爭^新j6會^4树为了测试乾向各个siRNA的抗血管生成作用和全身siRNA递送效率，在小丸移植后6和24小时，给具有含CpGODN的微袋的小鼠静脉注射单剂量的40[ig含有siVEGFA、siVEGFRl、siVEGFR2或三者混合物的siRNA，或对照siLacZ。在这些实验中，使用聚合物("Targetran，，)，其在对肿瘤血管生成的早先研究显示促进siRNA的血管外递送。在小丸移植后第4天和第7天，测定血管生成的程度。在小丸移植后第4天，各个使用的试剂与siLacZ治疗组相比诱导显著的新血管生成抑制(p<0.05)。如局部给药观察到的，三种测试试剂的混合物提供了最有效的抑制(平均抑制40%,p<0.01)。在另外的实验中，通过比较悬浮于聚合物或在PBS中给出的测试混合物的抗新血管生成活性来评估聚合物载体的作用。这些实验揭示了聚合物载体的使用比使用PBS栽体时显然导致更有效的抗新血管生成，尽管结果仅在试验早期是显著的(p<0.05)。结果证明通过静脉注射给予耙向VEGF系统基因的siRNA可以控制眼新血管生成并且使用RGD介导的dsRNA纳米颗粒递送增强了治疗作用的功效。为了确定全身递送siRNA的有效抗血管生成剂量，在小丸移植后6和24小时，给具有含CpGODN的微袋的小鼠静脉注射单剂量的10、20、40、8tmg含有siVEGFA、siVEGFRl和siVEGFR2混合物的siRNA，或具有TargeTran载体的对照siLuc。给予siRNA以剂量依赖性方式抑制了CpG诱导的血管生成。奸对P^尸途径差厨的s/及W在^^模f^村浴^^^早先的研究已经表明VEGF是诱导HSK模型中HSV特异性血管生成的关键血管生成因子。为了评估给予靶向VEGF途径基因的siRNA是否抑制HSK的发展，划破小鼠的角膜并用1.105HSV-1RE感染。然后在病毒感染后第l和3天，给予小鼠具有聚合物载体的单剂量的10Pg(结膜下注射进行局部递送)或4Qjxg(尾静脉注射进行全身递送)siRNA的混合物(siVEGFA、siVEGFRl和siVEGFR2的等摩尔混合物)。如图4所示，用靶向VEGF途径基因的siRNA局部或全身处理的小鼠与用siLuc对照处理的动物相比，血管生成和HSK的严重性显著降低(p<0.05)。虽然80%siLuc对照处理的眼睛产生了临床上明显的损害(在腹膜内注射第10天，得分2或更高)，但是用靶向VEGF途径基因的siRNA处理的眼睛仅有42%(局部递送)或50%(全身递送)产生了这样的损害。此外，到腹膜内注射第10天，12只对照眼睛有9只的血管生成得分大于6，但是用针对VEGF途径基因的siRNA经局部或全身递送处理的小鼠的12只眼睛中仅有5只如此。这些结果综合在一起表明给予针对VEGF途径基因的siRNA通过抑制血管生成减轻了HSK的发展。实施例8:在ROP眼新血管生成模型中非常有效的抗血管生成剂-耙向VEGF、VEGFR1和VEGFR1基因的siRNA混合物眼睛中的新血管生成与各种病症有关，常常引起视力严重丧失并最终失明。在这些病症当中，糖尿病视网膜病(DR)、年龄相关黄斑变性(AMD)、视网膜静脉闭塞(RVO)和早产儿视网膜病(ROP)是普遍的。刺激因子和抑制因子的不平衡导致新血管生成(NV)并且血管内皮细胞生长因子(VEGF)是引起血管通透、扩张和内皮细胞迁移、增殖的刺激因子的最重要的因子"'。RNA干扰(RNAi)是宽范围生物中序列特异性转录后基因沉默的过程，由序列与靶基因同源的双链RNA(dsRNA)启动。在这个实施例中，乾向VEGF途径的小干扰dsRNA寡核苷酸(siRNA)用于抑制由氧诱导的视网膜病所诱导的NV。材料和方法siRNA的i殳计和合成siRNA由Intradigm公司友情提供。三种mVEGF途径因子-mVEGFA和两种mVEGF受体(mVEGFRl和mVEGFR2);故RNAi靶向并被称为siMix。靶向萤光素酶的siRNA被称为siLuc作为对照。氣诱导的视网膜新血管生成的小鼠模型我们使用的模型(Smith等[2])模仿早产儿视网膜病。在出生后第七天(P7)，将小鼠和它们的养育母亲置于密封培养箱(自己的产品)，以氧和空气的混合物通风至75口t2%的最终氧部分。每天至少三次检查氧含量。在P12，将小鼠放回室内空气中。在P17处死动物。小鼠C57BL/6小鼠购自广州医学院和广州中医药大学的实验动物中心。所有研究均遵循国家研究委员会生命科学委员会的实验动物资源管理委员会的方针。siRNA的体内递送对于局部递送，在P12和P13将siMix(每只眼4^g/2W)结膜下或脉络膜内递送入左眼并(每只眼4^g/2m)在深度麻醉下用32-规格Hamilton注射器(HamiltonCo，Revo，NV)将siLuc注入右目艮。对于全身给药，将siRNA(每只小鼠15Pg/5(mi)与RGD-PEG-PEI聚合物缀合物制剂(TargeTran)混合并在P12和P13通过腹膜内递送。视网膜血管造影术w在P17如以前描述的通过用含50mg/ml荧光素标记的右旋糖酐的氯化钠溶液进行心脏灌注处死动物。摘出两只眼睛并在10%緩冲甲醛中室温下固定0.5-1小时。切开前段并小心取出感觉神经视网膜。放射状切割视网膜并平放于甘油中，光感受器朝向下。在视网膜上放置盖玻片并用指甲油密封。用荧光显微术检查视网膜的完整标本。用softImage-ProPlus(MediaCybernetics,USA)测量视网膜NV的面积。冷冻切片[5]取出眼睛并在最佳切割温度埋封胶(MilesDiagnostics)中冷冻。用生物素化GSA对眼睛冷冻切片(lOMffl)进行组织化学染色。将栽玻片在曱醇/11202中在4"C下孵育IO分钟，用0.05MTris緩冲盐水(TBS)，pH7.6洗涤，并在10°/。正常牛血清中孵育30分钟。将载玻片与生物素化GSA在37X:孵育1小时，用0.05MTBS漂洗后，将它们用与碱性磷酸酶偶联的抗生物素蛋白(VectorLaboratories)在室温下孵育45分钟。用0.05MTBS洗涤10分钟后，将载玻片用二氨基联苯胺孵育得到褐色反应产物并用曙红复染色，用Cytoseal封固。为了进行定量评定，贯穿全眼切10貤连续切片，并从含有虹膜的第一个切片开始，延伸至含虹膜的另一侧眼睛的最后一个切片，每十个切片用GSA染色并将共15个切片染色。用显微镜检查GSA染色的切片，使用数字彩色摄像机将图像数字化。使用Image-ProPlus软件(MediaCybernetics,SilverSpring,MD，USA)描绘视网膜表面上GSA染色的细胞并测量它们的面积。对于局部注射，将每只眼的总测量值用作单个实验值。对于全身注射，将小鼠两只眼的平均测量值用作单个实验值。RT-PCR在P14和P17，处死小鼠并用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)从4见网膜中提取总RNA。以260与280nm之比定量总RNA并通过cDNA合成试剂盒(Fermentas，美国)将2^gRNA转变为cDNA。用RT-PCR扩增RT产生的编码VEGF、VEGFR1、VEGFR2和卩-肌动蛋白(作为RNA完整性的对照和内标)的cDNA。用im有义和反义序列和2.5UTaq聚合酶实施1.5WcDNA的扩增。寡核苷酸引物序列是mVEGF(430bp)□正向5'-GATGTCTACCAGCGAAGCTACTGCCGTCCG-3'□反向5'-GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAcaagetgectegccttg-3'口mVEGFRl(404bp)□正向5'-GTCAGCTGCTGGGACACCGCGGTCTTGCCT-37□反向-GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAtagattgaagattecgc-3'□mVEGFR2(485bp)□正向5'-TGGCTGGTCAAACAGCTCATC-3'□反向5'-CTCATCCAAGGGCAATTCATC-3'-口口p-肌动蛋白(232bp)□正向5'-CATTGTGATGGACTCCGGAGACGG-3'□反向5'-CATCTCCTGCTGAAGTCTAGAGC—。VEGF和VEGF1、VEGF2的ELISA在P14和P17，处死小鼠并迅速在水上摘取^L网膜。将样品在细胞溶解緩冲液(哺乳动物细胞裂解试剂盒，BiotechnologyDepartmentBioBasidInc，加拿大)中混匀并随后以12，000rpm离心SO分钟。通过BCA蛋白质定量分析试剂盒(SheneryBiocolorBioscience&TechnolgyCompany,中国)分析上清液中的蛋白质浓度。将样品稀释至1mg/ml的终浓度。分别使用Q廳UkineM小鼠VEGF、sVEGFRl和sVEGFR2免疫测定试剂盒(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN)测定VEGF、VEGFR1和VEGFR2的水平。分析每组和每个时间点的6至12个组织样品。结果与讨论炎^:^j6营造參^定"A^考说/^處^T^^V^正常P17小鼠的视网膜既有浅血管层又有从视神经延伸到外周的深血管层(通过连通血管相连)。暴露于氧过多的P17对照小鼠的视网膜在灌注和未灌注视网膜之间接合处含有从视网膜表面伸出的许多新血管丛(高荧光素)。结膜下注射siLuc或siMix后，视网膜也具有许多NV，但面积没有明显差异。然而，脉络膜内和腹膜内注射siMix后，NV面积明显小于对照。遞迎视河應^邀欢#定#对si^^生成)来进行组织学评定。P17含氧量正常的小鼠的视网膜具有浅表、中间、深层血管并且在ILM之前不含内皮细胞。经历了氧过多的P17小鼠的视网膜在表面上含有多重新血管丛，一些延伸到玻璃体中。经结膜下注射siLuc或siMix治疗的小鼠的^L网膜的NV面积没有差异。与注射siluc相比，脉络膜内和腹膜内注射siMix后NV的面积明显减小。脉络膜内和腹膜内注射siRNA后VEGF、VEGFR1、VEGFR2mRNA的水平降低为了确定针对VEGF途径基因的siRNA治疗是否可降低VEGF、VEGFR1、VEGFR2mRNA的水平，在P14和P17在脉络膜内和腹膜内注射siRNA后，收集视网膜。通过RT-PCR测定了mRNA水平。与用siLuc治疗的对照视网膜相比，在用针对VEGF途径基因的siMix治疗的视网膜中VEGF、VEGFR1、VEGFR2mRNA的表达降低(p<0.05)。脉络膜内和腹膜内施用siRNA后，VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白质表达水平降低为了评估靶向VEGF途径基因的siRNA治疗是否减少VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白质的产生，在P14和P17使用ELISA测定了siRNA治疗的视网膜中的VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白质。如表1和2所示，与给予siLuc的对照相比，在接受了siMix的小鼠中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白质水平降低。氧和营养素供需不平衡是诱导VEGF上调的新血管生成的启动因素。VEGF不仅是内皮细胞的有效的促细胞分裂因子；它还可诱导血管通透和扩张。这些生物活性通过使VEGF与高亲和力跨膜自动磷酸化酪氨酸激酶受体结合来介导[5]。已经鉴定了三种不同的VEGF受体，即VEGFR1(fms样酪氨酸激酶-1或Flt-l)、VEGFR2(含激酶插入结构域的受体或KDR)和VEGFR3(fms样酪氨酸激酶-4或Flt-4)。VEGFR1和VEGFR2主要在血管上表达，VEGFR3在淋巴内皮上表达[6]。与视网膜新血管生成相关的VEGF脉络膜内和视网膜内水平增加不仅存在于动物模型中，而且存在于缺血性视网膜病患者中。这些数据表明VEGF信号是治疗视网膜新血管生成的良好目标[5]。氧诱导的小鼠视网膜病在世界上被普遍认可。EricAP等[7]报道了缺氧后6至12小时之间VEGF的mRNA水平显著提高并保持升高数日，然后随视网膜病逆转向基线降低。因此为了在上调前干扰VEGF的合成，我们在P12和P13递送了siRNA。完整标本和冷冻切片的结果证明了脉络膜内和腹膜内注射siMix治疗的视网膜的NV面积小于注射siLuc。即，siMix显然可以抑制^L网膜的NV。为了系统地研究其机理，检查了在P14和P17-见网膜的VEGF、VEGFR1和VEGFR2表达，mRNA和蛋白质水平比siLuc对照低。这些提示了siMix是通过抑制VEGF途径基因来抑制视网膜的NV。然而结膜下注射后没有明显差异，因此结论是它在局部尚未达到有效浓度。脉络膜内注射后玻璃体中有高浓度的siRNA存在和siRNA被转染到视网膜新血管内皮细胞中。但是这种注射可引起眼内出血和眼内炎等。腹膜内注射相对安全和siRNA可通过丰富的腹腔毛细血管被吸收入血液。但是siRM容易在非特异性器官，包括肝、肺和脾中被捕集。因此如何提高siRNA转染效率是非常重要的。载体TargeTran由聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽序列(RGD)组成。PEI与siRNA磷酸酯中的负电荷结合。RGD基序已经被鉴定为活化内皮细胞的整联蛋白配体。内皮细胞表达许多不同的整联蛋白，整联蛋白ctvl33和ct5P1已被证明在血管生成过程中是重要的。这两种整联蛋白都是具有暴露的RDG三肽部分的基质蛋白的受体并且在血管生成过程中在活化内皮细胞上最为突出。因此Targetran的应用可以提高siRNA的转染效率。KimB等w报道了结膜下和静脉注射siMix可以抑制小鼠中CPG诱导的角膜新血管生成。它还可以应用于其它的新血管疾病。实施例9:配体定向的纳米颗粒siRNA可以通过全身给药特异性递送入肿瘤这种自我装配siRNA纳米颗粒当通过静脉内注射全身给药时，表现出新血管靶向性能。已经用萤光素酶报道基因系统揭示了这种siRNA纳米颗粒系统的肿瘤特异性靶向能力。实施例10:配体定向的纳米颗粒siRNA是在小鼠同基因模型(神经胶质细胞瘤)中证实的有效的抗肿瘤剂使用静脉给药的靶向纳米颗粒系统进行siRNA的肿瘤靶向递送是使用包装于RGD-PEG-PEI纳米颗粒中的荧光标记siRNA证明的。V、處^9t模型雌性棵鼠(6-8周龄)得自Taconic(Germantown,NY)，关在具有可随意利用的标准啮齿类动物食物和水的顶部有滤光器的笼子中，和12小时光照/黑暗周期。实验根据国家法规进行并且得到当地动物实验伦理委员会批准。在小鼠肋腹部接种1x1(^个N2A细胞诱导皮下N2A肿瘤。在肿瘤体积大约0.5-1cn^时，小鼠通过尾静脉静脉内注射0.2ml溶液而接受纳米丛或游离siRNA。以游离形式或作为PEI-或RGD-PEG-PEI纳米颗粒注射40pg荧光标记的siRNA。注射后一个小时，解剖组织并用适于荧光的解剖显微镜检查。用配备有数码相机并与PC运行的MagnaFire2.0照相机软件(Optronics,Goleta，CA)连接的OlympusSZX12荧光显微镜进行组织的显微镜检查。对每种組织以相同的膝光时间拍摄照片。结果通过尾静脉静脉内注射游离的荧光标记siRNA在肺、肝或肿瘤组织中没显示任何显著的蓄积。使用PEI-纳米颗粒递送的SiRNA显示在肺组织中蓄积最多，随后是在肝脏和肿瘤中。使用RGD-PEG-PEI纳米颗粒递送的siRNA显示在肿瘤组织中蓄积水平最高。与PEI-纳米颗粒相比，在肺中蓄积大大降低且在肝脏中蓄积甚微。这个实验证明了使用RGD-PEG-PEI纳米颗粒对siRNA的肿瘤靶向递送。4吏用含有以VEGFR2为目标的siRNA的肿瘤靶向纳米颗粒制剂研究了RNAi介导的肿瘤血管生成和肿瘤生长的抑制。通过静脉注射纳米颗粒制剂治疗带有皮下肿瘤的小鼠，每次注射的剂量为""gsiRNA。每隔两天重复注射并评估肿瘤的生长和与用对照制剂治疗的动物相比较。在实验结束时，评估血管生成的抑制。雌性棵鼠(6-8周龄)得自Taconic(Germantown，NY)，关在具有可随意利用的标准啮齿类动物食物和水的顶部有滤光器的笼子中，和12小时光照/黑暗周期。试验根据国家法规进行并且得到当地动物实验伦理委员会批准。在小鼠肋腹部接种1x10e个N2A细胞诱导皮下MA肿瘤。在肿瘤体积大约0.5-1cm3时，小鼠通过尾静脉静脉内注射0.2ml溶液而接受纳米丛或游离siRNA。含有siRNA的纳米颗粒制剂通过siRNA溶液与聚合物溶液以给定的N/P比例简单混合来制备。对于肿瘤生长抑制研究，在接种肿瘤细胞后7天，当肿瘤变得可触知时开始实验。治疗包括通过尾静脉静脉内给予每只小鼠含有4(mgsiRNA的RPP-纳米丛，每3天一次。由不知晓治疗分配的观察者使用数字测径器每隔一定时间测量肺瘤生长。每个测量结果由以大约相隔90度的两个方向角度的肿瘤直径组成。以0.52x最长直径x最短直径2计算肿瘤体积。在实验结束时，处死动物，切除肿瘤组织和周围的皮肤并置于显微术载玻片上。使用上面对于荧光组织测量所述的Olympus显微镜和照相机设备，通过显微术进行血管形成和血管生成的组织检查。透射组织以显现皮肤中的血管且如上所述拍摄数字图像并保存。此后立即进行组织的快速冷冻用于Western印迹分析。结果对于用含有VEGFR2siRNA的纳米颗粒制剂治疗的动物观察到显著的肿瘤生长抑制。用非特异性siRNA治疗的动物与未经治疗的动物相比没有显示出任何实质上的肿瘤生长抑制。在肿瘤组织周围观察到显著的血管生长抑制，表明了在VEGFR2-siRNA治疗的小鼠中发生血管生成抑制。用对照siRNA治疗的小鼠显示出与未经治疗的动物相似的血管生长。从不同治疗组的动物收集的肿瘤裂解物的Western印迹分析显示出在VEGFR2-siRNA治疗的动物中VEGFR2大幅度减少，而在对照siRNA治疗的动物中没有观察到VEGFR2减少。这些实验清楚地证明静脉内给予的siRNA递送入肿瘤组织。使用786-0异种移植肿瘤模型研究了包装于RGD-PEG-PEI纳米颗粒中的VEGFR2siRNA抑制肾细胞癌模型中的肿瘤生长的有效性。这个研究使用了类似于实施例7的实验步骤。简言之，雌性棵鼠(6-8周龄)得自Taconic(Germantown，NY)。通过在小鼠肋腹部接种5x106个786-0细胞诱导皮下786-0肿瘤。在肿瘤体积达到大约100mm3时，经由尾静脉静脉内注射含有VEGFR2-siRNA的RGD-PEG-PEI納米颗粒的溶液而开始治疗。对照治疗组接受有含非特异性siRNA的纳米颗粒或盐水。重复治疗数日，每隔两天注射一次。如实施例7所述每隔两天测量一次肿瘤体积。结果对于用VEGFR2siRNA纳米颗粒制剂治疗的动物观察到显著的肿瘤生长抑制。对于用对照siRNA纳米颗粒治疗的动物没有观察到显著的肿瘤生长抑制。这个实验证明由肺瘤靶向纳米颗粒制剂递送的VEGFR2siRNA可以实现肿瘤生长抑制。将配体定向的siRNA纳米颗粒全身给予皮下接种N2A胶质母细胞瘤细胞的C57小鼠模型，用于评价VEGF敲减对肿瘤血管生成活性的影响。雌性棵鼠(6-8周龄)得自Taconic(Germantown，NY),关在具有可随意利用的标准啮齿类动物食物和水的顶部有滤光器的笼子中，和12小时光照/黑暗周期。实验根据国家法规进行并且得到当地动物实验伦理委员会批准。在小鼠肋腹部接种1x1(r个N2A细胞诱导皮下N2A胂瘤。在肿瘤体积大约0.5-1cm3时，小鼠通过尾静脉静脉内注射0.2ml溶液而接受纳米丛或游离siRNA。以N/P比为2如上制备纳米丛溶液。对于组织分布实验，以游离形式或作为P-或RPP-纳米丛注射40mg荧光标记的siRNA。注射后一个小时，解剖组织并用适于荧光的解剖显微镜检查。用配备有数码相机并与PC运行的MagnaFire2.0照相机软件(Optronics,Goleta，CA)连接的OlympusSZX12荧光显微镜进行组织的显微镜检查。对每种組织以相同的曝光时间拍摄照片。在共同递送实验中，将质粒和siRNA以1:IOO摩尔比混合，分别(40mgpLuc与13mgsiRNA)，和在顺序递送实验中，首先递送40mg质粒，2小时后继之以40mgsiRNA(1:300摩尔比)。注射纳米丛后24小时，解剖组织、称重并放入含磁珠的2ml管(Q-Biogene，Carlsbad,CA)的水冷报道裂解緩沖液(Promega)。用FastprepFP120磁性匀浆器(Q-Biogene)均化组织并4吏用萤光素酶测定系统(Promega)在Monolight2010光度计(AnalyticalLuminescenceLaboratory)上测定样品的报道酶活性。在肿瘤生长抑制研究中，在接种肿瘤细胞后7天，当肿瘤变得可触知时开始实验。治疗包括通过尾静脉静脉内给予每只小鼠含有40mgsiRNA的RPP-纳米丛，每3天一次。由不知晓治疗分配的观察者使用数字测径器每隔一定时间测量肿瘤生长。每个测量结果由以相隔90度的两个方向角度的肿瘤直径组成。以O.52x最长直径x最短直径2计算肿瘤体积。在实验结束时，处死动物，切除肿瘤组织和周围的皮肤并置于显微术载玻片上。使用上面对于荧光组织测定所述的Olympus显微镜和照相机设备，通过显微术进行血管形成和血管生成的组织检查。透射组织以显现皮肤中的血管且如上所述拍摄数字图像并保存。此后立即进行组织的快速冷冻用于Western印迹分析。siRNARPP-纳米丛引起的肿瘤生长抑制。给小鼠接种N2A肿瘤细胞，不进行治疗或以每只小鼠40mg的剂量，每3天通过尾静脉注射含有siLacZ或siVEGFR2的RPP-纳米丛进行。在肿瘤变得可触知(20mm"的时间点开始治疗。只有VEGFR2序列特异性siRNA抑制了肿瘤生长，而与未经治疗的对照(n-5)相比，用LacZsiRNA治疗没有影响肿瘤生长速率。实施例11:配体定向的纳米颗粒siRNA是在异种移植肿瘤模型(肾癌)中证实的有效的抗肿瘤剂还在肾癌小鼠异种移植模型中测试了配体定向的siRNA納米颗粒。用与实施例10相同的原料和相同的方法制备siRNA纳米颗粒，使用相同递送途径递送siRNA纳米颗粒。每组六只动物，使用2mg/kg剂量以三天间隔重复递送五次。观察到显著的肿瘤生长抑制。实施例12:配体定向的纳米颗粒siRNA是在异种移植肿瘤模型(结肠癌)中证实的有效的抗肿瘤剂使用靶向VEGFR2基因的siRNA纳米颗粒，我们进一步测试了在人结肠癌细胞系DLD-1的小鼠异种移植模型中的抗肿瘤功效。材料和方法试剂Avastin、抗VEGF的单克隆抗体(25mg/ml，Genetech);针对VEGFR2的siRNA，序列(附录l);针对萤光素酶的siRNA(Qiagen);由1.5g2，2，2-三溴乙醇和1.5ml叔戊醇(Cat并T4840-2，Cat#24048-6，Aldricli)溶于100ml蒸馏水，St.Louis，M0〗中制成的Avertin。小鼠无胸腺雌性棵鼠，5至6周龄购自TAC0NIC0和按照常规笼养。所有研究均遵循国家研究委员会生命科学委员会的实验动物资源管理委员会的方针。马里兰Rockville的生物医学研究所的动物设备由美国实验动物管理协会充分认可。细胞结肠癌细胞系，DLD-1(CCL-221，ATCC)在含2mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄雄、10mMHEPES和1.0mM丙酮酸钠、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中生长。试剂Avastin、抗VEGF的单克隆抗体(25mg/ml，Genetech);针对VEGFR2的siRNA，序列(附录l);针对萤光素酶的siRNA(Qiagen);由1.5g2，2，2-三溴乙醇和1.5ni1叔戊醇(Cat#T4840-2，Cat#24048-6Aldrich)溶于100ml蒸馏水，St.Louis,M0]中制成的Avertin。小鼠无胸腺雌性棵鼠，5至6周龄购自TACONIC()和按照常规笼养。所有研究均遵循国家研究委员会生命科学委员会的实验动物资源管理委员会的方针。马里兰Rockville的生物医学研究所的动物设备由美国实验动物管理协会充分认可。细胞结肠癌细胞系，DLD-1(CCL-221,ATCC)在含2mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mMHEPES和1.0mM丙酮酸钠、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中生长。步骤1)收获接近融合的DLD-1细胞并重悬于无血清RPMI培养基中。2)用Avertin0.4ml/小鼠腹膜内注射麻醉小鼠。3)0.lml无血清RPMI培养基中的1亿个细胞左侧皮下注射到小鼠背部，建立异种移植肿瘤模型。4)接种肿瘤细胞后5天，用测径器测量生长肿瘤的大小。然后对小鼠随机分组，每组7只。应用三种不同的剂量方案分别为1mg/kg、2mg/kg和4mg/kg。尽管4mg/kg的高剂量表现出最强的抗肺瘤活性，但是三个治疗組之间没有显著差异。使用不同的比较，发现4mg/kg高剂量的siRNA纳米颗粒显示出比5mg/kgAvastin治疗更强的抗胂瘤功效。参考文献1.PeterA，Campochiaro.Retinalandchoroidalneovascularization.JCellPhysiol,2000,184:301-10.2.SmithLE，WesolowskiE，MclellanA，etal.Oxygen-inducedretinopathyinthemouse.InvestOphthalmolVisSci,1994,35:101-11.3.3D'AmatoRWesolowskiE，SmithLE.Microscopicvisualizationoftheretinabyangiographywithhigh-molecular-weightfluorescein-labeleddextransinthemouse.MicrovascRes1993;46:135~42.4.Jikuishen,Rebeccasamul，JoelleZimmer,etal.DeficiencyofNeuropilin2SuppressesVEGF-InducedRetinalNV.Molecularmedicine,2004,10:12-18.5.UnsoeldAS,JunkerB，Mazitschek民etal.LocalinjectionofreceptortyrosinekinaseinhibitorMAE87reducesretinalneovascularizationinmice.MolVis,2004,10:468-75.6.ClaussM.MolecularbiologyoftheVEGFandVEGFreceptorfamily.SeminThrombHemost,2000，26:561-9.7.EricAP，RobertLA，EliotDF,etal.Vascularendothelialgrowthfactor/vascularpermeabilityfactorexpressioninamousemodelofretinalneovascularization.Proc.Natl.Acad.Sci,1995,92:905-9.8.LuP.Y.etal.，KeystoneSymposia^MolecularTargetsforCancerTherapy,(2003,p219.XuJ.etal.，GeneSuppression.(2003).9.Lu,Patricketal.，(2002),CancerGe"e77era;乂Vol.10，Supplement1,Oil.10.Li^PatrickYetal."(2003),Cw/re/(9/^"/o/"Mo/ecw/"/*7Terapewrfcj,5(3):225-234.11.CogoniC.etal"(2000),GewesZ)ev10:638-643.12.GuruT.，(2000),iVo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合物，其中所述核酸试剂是平端双链RNA分子，其中每条RNA链具有25个核苷酸的长度，其中所述RNA分子(25个碱基对的siRNA)能够靶向特异性抑制哺乳动物细胞或组织中人VEGFR2基因的表达。13.根据权利要求12的组合物，其中一条RNA链(有义链)具有序列-r(CCUCUUCUGUAAGACACUCACAAUU)-3'和另一条RNA链(反义链)具有序列5'-r(AAUUGUGAGUGUCmJACAGAAGAGG)-3,。14.根据权利要求12的组合物，其中一条RNA链(有义链)具有序列-r(CCCUUGAGUCCAAUCACACAAUUAA)-3'和另一条RNA链(反义链)具有序列5'-r(UUAAUUGUGUGAUUGGACUCAAGGG)-3'。15.根据权利要求12的组合物，其中一条RNA链(有义链)具有序列5'-r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)-3'和另一条RNA链(反义链)具有序列5'-r(AAAGGCAUCUGCUUCAAUCACUUGG)-3'。16.根据权利要求12的组合物，其中在siRM治疗24小时后，该RNA干扰导致siRNA转染细胞中人VEGFR2蛋白水平降低75°/。以上。17.根据权利要求12的组合物，其中在siRNA治疗120小时后，该RNA干扰导致siRM转染细胞中人VEGFR2蛋白水平降低60%以上。18.根据权利要求1的组合物，其中所迷核酸试剂是平端双链RNA分子，其中每条RNA链具有25个核苷酸的长度，其中所述RNA分子(25个碱基对的siRNA)能够靼向特异性抑制哺乳动物细胞中人VEGFR1基因的表达。19.根据权利要求18的组合物，其中一条RNA链(有义链)具有序列-r(GCCAACAUAUUCUACAGUGUUC飄)-3'和另一条RM链(反义链)具有序列5'-r(UAAGAACACUGUAGAAUAUGUUGGC)-。20.根据权利要求18的组合物，其中一条RNA链(有义链)具有序列5'-r(CCCUCGCCGGAAGUUGUAUGGUUAA)-3'和另一条RNA链(反义链)具有序列5'-r(UUAACCAUACAACUUCCGGCGAGGG)-3'。21.根据权利要求18的组合物，其中一条RNA链(有义链)具有序列5'-r(CCUCAAGAGCAAACGUGACUUAUUU)-3'和另一条RNA链(反义链)具有序列5'-r(AAAUAAGUCACGUUUGCUCUUGAGG)-。22.根据权利要求18-20的组合物，其中在siRNA治疗24小时后，该RNA干扰导致siRNA转染细胞中VEGFR1蛋白水平降低75%以上。23.根据权利要求18-20的组合物，其中在siRNA治疗120小时后，该RM干扰导致siRNA转染细胞中VEGFR1蛋白水平降低60%以上。23.根据权利要求2的组合物，包含至少三个25聚体的寡siRNA，且其中所述寡siRNA抑制hVEGF、hVEGFRl和hVEGFR2的表达。24.根据权利要求2的组合物，包含至少三个寡siRNA，且其中所述寡siRNA抑制选自hVEGF、hEGF和hPDGF及其受体的三种基因的表达。25.根据权利要求l的组合物，其中所述核酸试剂是靶向合成载体。26.根据权利要求25的组合物，其中所述载体靶向肿瘤新血管结构。27.根据权利要求25的组合物，其中所述载体包含靶向肽，同双功能活化PEG接头和含多胺的试剂。28.根据权利要求27的组合物，其中所述靶向肽是RGD肽。29.根据权利要求28的组合物，其中所述载体是由同双功能活化PEG、RGD-2C肽、含多胺的试剂和siRNA分子的混合物制备的自动装配载体。30.根据任一在前权利要求的组合物，进一步包含抑制与有害或不当新血管生成相关的基因途径的功能的非核酸治疗剂。31.根据权利要求30的组合物，其中所述治疗剂是单克隆抗体。32.根据权利要求31的组合物，其中所述抗体与VEGF结合。33.—种治疗受治疗者中与有害或不当新血管生成相关的疾病的方法，包括给所述受治疗者施用根据任一在前权利要求的组合物。34.—种治疗受治疗者中与有害或不当新血管生成相关的疾病的方法，包括给所述受治疗者联合施用根据权利要求l-29任一项的组合物和抑制与有害或不当新血管生成相关的基因途径的功能的非核酸治疗剂。35.根据权利要求34的方法，其中所述治疗剂是单克隆抗体。36.根据权利要求35的方法，其中所述抗体与VEGF结合。37.根据权利要求33或34的方法，其中所述新血管生成处于肿瘤组织、眼隔室或关节组织中。全文摘要提供了治疗疾病的组合物和方法，所述疾病涉及有害的新血管生成(NV)。本发明提供了通过选择性抑制血管生成前生化途径来控制NV的治疗，包括VEGF途径基因表达的抑制和定位于病理NV组织的抑制。提供了靶向组织的纳米颗粒组合物，其包含聚合物缀合物和诱导RNA干扰(RNAi)的核酸分子。本发明的纳米颗粒组合物可以单独使用或与其它治疗剂如VEGF途径拮抗剂联合使用。该组合物和方法可以用于治疗NV疾病，如癌症、眼病、关节炎和炎症性疾病。文档编号C12N15/113GK101277704SQ200680019011公开日2008年10月1日申请日期2006年4月12日优先权日2005年4月12日发明者F·Y·谢,J·许,M·C·伍德,P·V·斯加里亚,P·杨路,Q·Q·唐,Q·周,R·施弗勒斯,Y·刘申请人:因特拉迪格姆公司