专利名称：：阿米巴病的植物疫苗的制作方法阿米巴病的植物疫苗相关申请本申请要求序列号为60/685,733，于2005年5月27日提交的美国专利申请的优先权，并以引证的方式全部并入本申请。有关美国政府权利的声明本研究部分由USDA3611-21000-017-OOD和NIHR01GM63879支持。美国政府在本申请中享有权利。
背景技术：
：腹泻疾病仍是发展中国家儿童发病与死亡的主要原因。在发达国家，那些引起腹泻疾病的微生物体，由于其可能被用作生物恐怖用途，仍然是主要关注的问题。阿米巴病是由溶组织内阿米巴(一种小肠内寄生原虫)弓i起，作为一种原虫起因的死亡，其在分类上仅次于疟疾。世界卫生组织估计，由于溶组织内阿米巴感染，每年约有5000万例结肠炎和肝脓肿病例以及10万例死亡病例(21'35''6)。这种溶组织内阿米巴感染，在整个世界范围均存在，但是主要发生于中南美、非洲及亚洲的发展中国家。溶组织内阿米巴是已知的细胞毒性最强的细胞之一，在1903年由于其能够破坏人类组织而由Schaudinn命名(32)。溶组织内阿米巴的生命周期简单，具有感染性孢囊和侵袭性营养体。当此寄生虫的孢囊形式与污染的食物或水一起被摄入时，感染过程即开始(35'39)。此寄生虫的这种感染性孢囊形式，在通过胃和小肠后，仍能存活。这种孢囊能够抵抗胃酸、氯化和脱水作用，而且能够在潮湿环境中存活数周。表面抗原的组成富含半胱氨酸，这对于阿米巴在这样恶劣环境中生存可能是重要的。当孢囊在肠腔中发生脱囊时，便形成活动的并具侵袭性的营养体。这种营养体通过使用半乳糖/N-乙酰-D-半乳糖胺(Gal/GalNAc)特异的凝集素粘附于结肠的粘蛋白，并由此定植于大肠。当这种营养体寄生于肠粘膜层(其通过抑制阿米巴粘附至表皮下以及减缓营养体的活动，而阻止阿米巴的侵染)时，便发生结肠炎。营养体分泌蛋白裂解酶，分解断裂肠粘膜和上皮屏障，顺利穿入组织。然后，营养体杀死宿主的上皮和免疫细胞，引起特征性烧瓶状溃疡。最终，该寄生虫抵抗宿主免疫系统而存活，引起长期的肠外感染，如阿米巴性肝脓肿(2')。溶组织内阿米巴通过多种特异与非特异方式逃避宿主的防御，并存活于肠内和肠外感染部位。在大多数感染当中，营养体在肠粘蛋白层发生聚集，形式新的孢囊，导致无症状性感染。孢囊分泌至粪便，并经粪口途径传播，开始新一轮生命周期过程。然后，在某些情形，一旦肠上皮被侵染，便可能从肠外传播至腹膜、肝脏或其它部位。阿米巴性结肠炎患者，典型地在数周内会出现腹部绞痛、体重下降以及水样腹泻或血性腹泻。有将近80%的阿米巴性肝脓肿患者，其症状出现相对迅速(通常在2至4周以内)，包括发烧、咳嗽以及右上腹部或上腹部持续性隐痛。有10-35%的患者伴发出现胃肠症状，包括恶心、呕吐、腹部绞痛、腹胀和腹泻。肝外阿米巴性脓肿有时候涉及肺、脑和皮肤，其可能是由于血流扩散引起。因为阿米巴仅感染人类和其它一些高等灵长类动物，因此在理论上，使用一种抗阿米巴疫苗可以根除这种疾病。阿米巴寄生虫识别宿主的结合糖，在阿米巴疾病的发病中起了重要作用。阿米巴粘附至靶细胞以及靶细胞发生接触依赖性裂解，均由阿米巴的半乳糖/N-乙酰-D-半乳糖胺可抑制性粘附素介导(31)。半乳糖/N-乙酰-D-半乳糖胺(Gal/GalNAc)凝集素在寄生虫的细胞裂解活性、侵染以及抵抗补体溶胞方面发挥了多种重要的作用。半乳糖/N-乙酰-D-半乳糖胺(Gal/GalNAc)凝集素是一种异二聚体，含有二硫键连接的重链(170kDa)和轻链(35/31kDa)亚基，两者与一种150kDa的中间体亚基非共价连接(21'35'31'29)。编码重链和轻链亚基的基因是多基因家族的成员，该家族有5至7个成员组成。重链亚基(170kDa)的基因序列，包含了氨基端15个氨基酸的疏水信号序列、一种1209个氨基酸的富含半胱氨酸的胞外结构域(包含N连接的糖基化位点)、以及分别含有26和41个氨基酸的跨膜与胞质结构域(35)。靶向富含半胱氨酸胞外结构域的抗凝集素单克隆抗体抑制了溶组织内阿米巴的体外粘附(21)。轻链亚基由多个编码不同翻译后修饰亚型的基因编码。35kDa亚型高度糖基化，而且缺乏以31kDa亚型存在的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点(33'37)。35kDa和31kDa亚基的功能仍然不清楚。在半乳糖/N-乙酰-D-半乳糖胺(Gal/GalNAc)凝集素的重链亚基中，鉴定出碳水化合物识别结构域(CRD)，而且研究已说明，在动物模型中，针对此结构域的抑制粘附的抗体应答防止了阿米巴性肝脓肿的发生('6)。因此，对于阻断阿米巴定植的疫苗和药物来说，半乳糖/N-乙酰-D-半乳糖胺(Gal/GalNAc)凝集素中的这种碳水化合物识别结构域(CRD)是一种潜在的靶标。初步研究显示，含有半乳糖/N-乙酰-D-半乳糖胺(Gal/GalNAc)凝集素CRD结构域的富含半胱氨酸区域的重组片段(称为"lecA"),能赋予宿主抵抗阿米巴疾病的能力(2°'3°'。理论上，可以通过清除食物和水的粪便污染，防止阿米巴疾病的发生。但是，在发展中国家，这需耗巨资去提供安全食用水和食物。相反，一种具疗效的疫苗，将使费用降低而且可行。这完全需要一种有效的表达系统，生产疫苗抗原，并提供干净低廉的疫苗。叶绿体基因工程提供了一些独具的优点，包括高水平表达、低费用生产、具翻译后修饰能力、以及所表达转基因的母体遗传"''8'8)。除了母体遗传以外，针对转基因约束，已开发了新的故障保护(或保险)机制。比如，通过叶绿体基因工程实现了酮硫解酶的表达，转基因植株发育正常而且均为雄性可育植株。除了经转基因叶绿体表达的转基因的母体遗传外，这说明了基因约束的优点(38)。同样，能够消除细胞核基因工程所面临的一些挑战，包括位点效应，其由转基因经同源重组的位点特异性整合消除('°''8)。在转基因叶绿体中，没有发现转录和翻译水平的基因沉默，甚至在以极高水平表达时，此时tsp"2'或转录达46.1%，比细胞核转基因植株高169倍(26)。对系列转基因叶绿体的转录本分析显示，工程化的多基因操纵子，主要以多顺反子形式转录，而且有效翻译，无需单顺反子进行翻译(36)。已证明，通过叶绿体基因组表达疫苗抗原是有优势的，因为亚单位疫苗甚至以高浓度表达时均不具毒性。细菌基因的AT含量高，这可使其在叶绿体中高表达，而且疫苗口服给药产生高滴度的粘膜IgA抗体而且全身具高滴度IgG抗体，使免疫系统能够在病菌进入时抵抗病原菌。已在叶绿体获得表达的那些疫苗包括霍乱毒素B亚基(CTB)，其不含CTA中的毒性组分，；血小板F1-V融合抗原("'；犬细小病毒(CPV)的2L21肽(34);炭疽保护性抗原(PA)"3';作为丙型肝炎疫苗抗原的NS3蛋白'2';破伤风梭菌C末端(TetC)"2'。巨噬细胞溶解试验中毒性测量结果显示，叶绿体生产的炭疽保护性抗原与在炭疽杆菌生产的PA抗原具相同的效价(43)。将部分纯化的叶绿体产或炭疽杆菌产PA抗原与佐剂一起在小鼠中进行皮下疫苗接种，产生的IgG抗体的滴度达1:320000，而且以毒素致死的剂量进行挑战时，两组小鼠均存活(100%)。已报道，以每棵植株平均产生150mgPA抗原的产量计，一英亩陆地应该产生3.6亿份此种剂量的纯化疫苗(不含细菌毒素EF和LFV221。通过叶绿体转化，烟草已被用于疫苗抗原的过表达和有用治疗性蛋白的生产，如用于多种生物医学用途的人弹性蛋白衍生多聚体(19)。被表达的包括一些人治疗性蛋白(包括人血清白蛋白('7)、爪蟾抗菌肽、广谱局部药物、全身抗生素、伤口愈合刺激物及一种潜在的抗癌药"3))、干扰素m和胰岛素样生长因子(3)。其他一些实验室，在转基因叶绿体中表达了其他一些治疗性蛋白，包括人垂体生长激素"°'和干扰素-GUS融合蛋白(27)。最近也在非绿色组织质体如棉花、大豆和胡萝卜中实现了转化(24'25)。尤其是胡萝卜转化，打开了这类疫苗抗原经口服接种之门。图1.pLD-SC示意图。烟草转化载体pLD-SC含有用作同源重组侧翼序列的trnl和trnA基因。组成型16SrRNA启动子调节赋予大观霉素-链霉素抗性的aadA基因(氨基葡糖苷3'磷酸腺苷转移酶)以及溶组织内阿米巴凝集素抗原编码基因gene10-LecA的表达。在trnA的上游，载体包含3'UTR序列，其为一种转录本稳定子，来源于叶绿体psbA基因。图2.野生型pLD-genelO-LecA及其假定转化子的PCR分析。A)天然叶绿体基因组(3P)或aadA基因(3M)内引物，产生1,65kb扩增产物；5P/2M引物产生3.3kb扩增产物。B)泳道l:lkbplusladderDNA分子量标记；泳道2:阳性对照(干扰素克隆)；泳道3-7:转基因株系pLD-gene10-LecA(2，6，8*，14，17);泳道8:阴性对照(野生型)。C)泳道l:lkbplusDNAladder分子量标记；泳道2:阳性对照(pLD-gene10-LecA质粒)；泳道3-7:转基因株系pLD-genelO-LecA(2,6，8*，14，17);泳道8:阴性对照(野生型)。图3.pLD-genelO-LecA的SouthernBlot分析。野生型未转化植株A)与pLD-SC转化植株B)消化期望产物的示意图。C)pLD-gene10-LecA转基因植株的侧翼序列探针SouthernBlot分析显示异型同源性。泳道1:lkbplusDNAladder分子量标记；泳道2:野生型；泳道3-6:pLD-SC转基因株系(8*，17)。D)LecA基因特异性探针显示，在转基因植株中存在LecA。泳道1:lkbplusDNAladder分子量标记；泳道2:野生型；泳道3-6:pLD-SC转基因株系(8*,17)。图4.表达LecA的植株粗提取物的免疫印迹分析。泳道hTl代转基因植株；泳道2和4:T。代转基因植株(上样28微克植株粗提取物)；泳道6:野生型；泳道7:蛋白标准品(l微克)；泳道9:分子量标记；泳道3，5，8，10:空泳道。图5.转基因植株中LecA表达水平的定量(T。代)。A)在规律的光照条件(一个周期包括16小时光照时间和8小时黑暗时间)下，LecA在幼叶、成熟叶和老叶中的表达水平，以TSP百分比表示。B)根据鲜重，从每片幼叶、成熟叶和老叶中获得的LecA的量(毫克)。C)从每毫克叶中获得的LecA的量(微克)。图6.小鼠血清样品中免疫应答的比较1)表达凝集素的植株叶粗提取物，加佐剂经皮下给药，产生的平均滴度为1:9600;2)表达凝集素的植株叶粗提取物，不加佐剂经皮下给药，产生的平均滴度为1:3600;3)野生型植株叶粗提取物，经皮下给药不产生免疫滴度。图7.显示编码Gal/GalNAc凝集素重链亚基的多聚核苷酸(SEQIDNO.1)和LecA的包含CRD结构域的多肽序列(SEQIDNO.2)。
发明内容本专利的发明人成功例证说明了LecA(—种溶组织内阿米巴表面抗原)在转基因叶绿体中的表达以及此种疫苗抗原的免疫原性评价。本专利首次报道了LecA在转基因植株任何细胞区室中表达。除非另有说明，如分子生物学领域常规技能所通常理解那样，本发明中所用的所有技术与科学术语具有相同含义。在本发明的实际应用或测试过程，虽然可以使用与本发明所述的类似或等同的方法与材料，但是最合适的为本发明所述的方法与材料。所有本发明提及的发行物、专利申请、专利及其它参考文献均以引证的方式全部并入本申请。万一出现冲突，本说明书(包括定义)将进行控制。此外，此申请中材料、方法以及实例仅做说明使用，无限定意图。本发明参考了分子生物学的标准教科书，其包含了基本技术操作的定义、方法和方式，如《分子克隆实验室手册》(Maniatis等人编著)、《冷泉港实验室期刊》(纽约，1982年版)、《分子克隆实验室手册》(Sambrook等人编著)、《冷泉港实验室期刊》(纽约，1989年版)、《植物分子生物学方法》(Maliga等人编著)、《冷泉港实验室期刊》(纽约，1995年版)、《拟南芥属》(Meyerowitz等人编著)、《冷泉港实验室期刊》(纽约，1994年版)、以及本申请引用的各种参考文献。植物和植物细胞转化所用的方法、载体与组合物均在W001/72959、W003/057834和W004/005467中说明。W001/64023论述了标记游离基因的使用。在本发明中依据具体说明表达的蛋白，可以通过多种途径在受试者(人或动物)中给药用于体内。此药物组合物可以经口服或胃肠外(即皮下、肌内或静脉)给药。因此，对于胃肠外给药，本发明使用药物组合物，其包括融合蛋白(或其衍生物)溶液或其溶于可接受载体(优选为含水载体)的混合剂。有多种含水载体可用，如水、缓冲水、0.4%生理盐水、0.3%甘氨酸及类似物。这些溶液均为无菌，通常不含颗粒物质。这些药物组合物通过常规的人们所熟知的灭菌技术进行灭菌。这些药物组合物可能含有一些药学上可接受的辅助性物质(要求接近生理条件)，如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂以及类似物(如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等)。在这些剂型中，融合蛋白的浓度(或其比例)可能不同，这很大程度上依赖于受试蛋白的特异氨基酸序列和期望的生物学活性，如依据重量从不到0.5%至15%或20%，通常为1%或至少为1%，而且其主要根据液体体积与粘度等并依据所选的特殊给药方式进行选择。通过本发明实施方案生产的口服疫苗，可以通过食用产生抗原类颗粒的转基因植物生产的食品给药。此种转基因植物的可食用部分用作日常饮食成分，同时此疫苗经此食用过程给药。因此，在一个实施方案中，一种疫苗属于一种可给药的疫苗组合物，其包括一种由植物或植物残留物表达的抗原。一种植物残留物可以包括来自于抗原表达植物的一个或多个分子(如蛋白及其片段、无机物、核苷酸或其片段、植物结构组分等，但不限于这些成分)。因此，属于整个植物材料(如植物整个或部分叶、茎、果实等)或植物粗提取物的一种疫苗将肯定包含一种高浓度的植物残留物以及一种由纯化抗原和一种或多种可检测植物残留物组成的组合物。为了评价所表达抗原的抗原性，在实验动物中将本发明的实施方案抗原通过口服或腹膜注射免疫接种后，分别测量粪便中免疫球蛋白A的和血清中G的水平。经酶联免疫吸附测定法，测量诱发抗体生成的能力。此外，直接食用产生抗原的转基因植物，引起该特异抗原的抗体形成。本发明确定实施方案的疫苗，可以使用药物赋形剂或稀释剂配制剂型，用于口服、静脉、皮下、鼻内、支气管内或直肠给药。通过经典方法，使用适于预期给药方式的固态或液态赋形剂、稀释剂和添加物，配制此种药物组合物。对于口服，此种组合物可以片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂和类似剂型的形式给药，至少配合使用一种赋形剂，如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等。也可将此种制剂乳化。这种活性致免疫组分通常与药学上可接受的及与此活性组分兼容的赋形剂混和。合适的赋形剂为例如水、生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇或类似赋形剂以及它们的组合物。此外，如需要，疫苗可以含有少量辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂或佐剂，这些均增强了疫苗的效力。胃肠外给药制剂包括无菌水、悬浮液、乳液和栓剂。关于乳化剂，可以使用的有丙二醇、聚乙二醇、橄榄油、油酸乙酯等。对于栓剂，传统使用的粘合剂与载体可包括聚烯烃二醇、甘油三酯、半合成脂肪酸酯(wit印SOl)、聚乙二醇、吐温61、可可豆脂、甘油明胶等。另外，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸钠及类似物可以用作赋形剂。抗原可以通过食用转基因植物生产的食品给药，而且，表达此种抗原的转基因植物的可食用部分直接用作日常饮食成分，同时此疫苗经此食用过程给药。为了方便给药，此种疫苗可以转基因植物汁液形式提供。对于此所述目的，待转化植物优选自可食用植物，包括番茄、胡萝卜和苹果，它们通常以其果汁形式食用。疫苗接种通常以2至12周的间隔进行，更通常以3至5周的间隔进行。以1-5年的间隔(通常为3年)周期性增加剂量，预期可以维持抗体的保护性浓度。可预期以大约100-500ug/kg(优选200-400iig/kg)活性组分的剂量范围进行疫苗接种。阿米巴有关的疫苗相关的信息引用自《寄生虫免疫学》(2003年，25巻，55-58页)。那些本领域熟练的技术人员会理解，特别是在本发明所公开的那些基因的活性变异体可以用于生产植物疫苗。《实验医学杂志》(JExpMed.)(1997年5月19日；185(10)巻，1793-1801页)提供了一些有关已知抗原蛋白及其编码基因的片段的特殊实例。根据一种实施方案，本发明涉及一种植物生产的疫苗。该植物经转化后表达能在受试者(人或非人类动物)中引起免疫应答的抗原蛋白。根据另一实施方案，本发明涉及一种载体转化的叶绿体基因组，该载体包含一种表达溶组织内阿米巴抗原肽的异源基因。在一个相关实施方案中，本发明涉及一种至少由一种表达溶组织内阿米巴抗原肽的细胞组成的植物。根据本发明，LecA多肽至少包括12、15、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250或265个选自SEQIDN0:2所示的氨基酸序列(图7)或其生物学上有活性变异序列的毗连氨基酸(如下说明)。因此，本发明的一种LecA多肽可能是LecA蛋白的一部分、或是全长的LecA蛋白、抑或是包括全长LecA蛋白或其部分序列的一种融合蛋白。那些具生物学活性的LecA多肽变异体，即那些能够诱发防止溶组织内阿米巴感染的血清抗体产生的变异体，也认为是用于此种应用的LecA多肽。优选的，天然与非天然的LecA多肽变异体均具有一些氨基酸序列，它们与SEQIDN0:2所示的氨基酸序列或其片段具有至少55%、60%、65%或70%的相似性，优选为75%、80%、85%、90%、96%，96%或98%。使用Blast2序列比对程序(Blosum62，Expect10，标准遗传密码)，确定一种假定LecA多肽变异体与一种SEQIDN0:2氨基酸序列之间的百分比相似性。百分比相似性出现差异可能是由于，例如，氨基酸替换、插入或缺失。氨基酸替换定义为一对一的氨基酸置换。当被替换的氨基酸有相似的结构和/或化学性质时，这种替换在本质上是保守的。保守置换的实例有一个亮氨酸被一个异亮氨酸或缬氨酸替换、一个天冬氨酸被一个谷氨酸置换、一个苏氨酸被一个丝氨酸置换。氨基酸插入是变成另一种氨基酸序列，而氨基酸缺失是氨基酸序列内部发生变化。两者发生时，典型地在大约1至5个氨基酸范围内。使用本领域熟知的计算机程序(如DNASTAR软件)，可以确定哪些氨基酸残基能被置换、插入或缺失，而不破坏LecA多肽的生物学或免疫学活性。一个氨基酸的改变是否会引起一种具生物学活性的LecA多肽产生，这很容易通过LecA的活性测定来确定，如下列特殊实例所述。LecA多聚核苷酸可能为单链或双链，而且由一种LecA多肽编码链或其互补链组成。SEQIDN0:2的LecA多肽编码序列如SEQIDN0:1所示。编码LecA多肽的简并核苷酸序列，以及与SEQIDNO:l所示的核苷酸序列至少有大约50%、55%、60%、65%或70%相似性，(优选大约为75%、90%、96%或98%)的同源核苷酸序列，也同样为LecA多聚核苷酸。使用计算机程序，如基于FASTA算法(使用仿射空位搜索，其中，空位开放罚分为-12，空位拓展罚分为-2)的ALIGN软件，确定两种多聚核苷酸序列之间的百分比相似性。那些编码具生物学活性LecA多肽的LecA多聚核苷酸的互补DNA分子(cDNA)、不同物种同源体以及变异体，也同样为LecA多聚核苷酸。上述LecA多聚核苷酸的变异体和同源体也为LecA多聚核苷酸。典型地，如本领域所知晓的，可以通过候选多聚核苷酸与已知LecA多聚核苷酸在严谨条件下的杂交，来鉴定同源LecA多聚核苷酸序列。例如，使用下列洗涤条件2XSSC(0.3MNaCl，0.03M拧檬酸钠，pH7.0)，0.1%SDS，室温洗涤两次，每次30分钟；然后，2XSSC，0.1%SDS，5(TC洗涤一次，30分钟；然后，2XSSC室温洗涤两次，每次10分钟，可以鉴定同源序列，其至多含大约25-30%的错配碱基。同源核酸链更优选含有15-25%的错配碱基，甚至更优选5-15%的错配碱基。通过涉及合适的探针或引物并筛选cDNA表达文库，也可以鉴定本发明所述的LecA多聚核苷酸的不同物种同源体。众所周知，同源性每增加1%，双链DNA的Tm值降低1-1.5。C(Bonneretal.，J.Mol.Biol.81，123(1973))。因此，可以通过将假定的同源LecA多聚核苷酸与含有SEQIDNO:l核苷酸序列或其互补链的多聚核苷酸杂交形成测试杂交链，来鉴定LecA多聚核苷酸变异体或其它物种的多聚核苷酸。将测试杂交链的解链温度与具完全互补核苷酸序列的多聚核苷酸杂交链的解链温度进行比较，然后计算测试杂交链内错配碱基的数目或百分率。在严谨的杂交与/或洗涤条件下，那些与LecA多聚核苷酸或其互补链杂交的核苷酸序列也同样为LecA多聚核苷酸。这些严谨的洗涤条件均为本领域的人们所熟知和了解，其在Sambrook等人编著的《分子克隆实验室手册》(第二版，1989年)的第9.50-9.51页中介绍。典型地，对于严谨的杂交条件，温度应该结合盐浓度选择，即低于所研究杂交链Tm计算值大约12-20°C。含有SEQIDNO:1核苷酸序列或其互补链的LecA多聚核苷酸和与这些核苷酸序列有至少大约50%相似性(优选大约75%、90%、96X或98X)的多聚核苷酸序列之间形成的杂交链的Tm值，可以例如通过Bolton-McCarthy方程(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.48，1390(1962))计算Tm=81.5°C-16.6(loglO(Na+))+0.41(%G+C)-0.63(%甲酰胺)-600/1其中，1=杂交链长度。严谨的洗涤条件包括例如，4XSSC于65"C洗涤或50%甲酰胺和4XSSC于42'C洗涤、或0.5XSSC和O.1XSDS于65'C洗涤。高度严谨的洗涤条件包括例如，0.2XSSC于65'C洗涤。具体实施例方式材料与方法用于烟草叶绿体转化的载体构建含有LecA基因的质粒pcDNA3.1由BarbaraMann博士(美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔市弗吉尼亚大学健康系统)提供，用作模板，引入LecA基因N末端的起始密码子和C末端的终止密码子。所用正反向引物分别为正向，5'-GGAATTGAATTCCATATGTGTGAGAACAGA3';反向，5'-AGAATTGCCTCTAGACTATTCTGAAAC-3'。得到大约1.7kb的PCR扩增产物，其5'端含有NdeI限制性酶切位点，3'端含有XbaI限制性酶切位点。PCR产物使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，并克隆至T0P0载体pCR2.1-LecA。使用限制性内切酶NdeI和NotI将PCR产物从pCR2.1-LecA载体上切下，并克隆连接至p-bluescript(含有T7噬菌体基因10的UTR序列，命名为pBS—g10-LecA)。用HincII和NotI限制性内切酶酶切所得载体，得到含有基因10和LecA基因(大约1.8kb)的最终产物，并将其克隆连接至烟草通用载体pLD-Ctv的EcoRV和NotI位点之间。基因枪轰击与转基因苗筛选小哈瓦那雪茄烟烟草(Nicotianatabacumvar.Petithavana)的叶，使用Bio-RadPDS1000/He基因枪进行轰击。在温育两天后，将此叶转接至含有500yg/ml大观霉素的RMOP培养基上(5，23〕。4至6周后，芽苗出现，将其切成5mm2大小的小片，转移至新鲜配制的RMOP+大观霉素培养基进行第二轮筛选。最后，在第二轮筛选4周后，将芽苗转接至含有MS0培养基(含500yg/ml大观霉素)的培养瓶中(5，23)。转基因整合至叶绿体基因组的确认为了证实转基因的表达框已整合至叶绿体的基因组，使用引物对3P(5'-AAAACCCGTCCTCGTTCGGATTGC-3')-3M(5，-CCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACG-3')进行PCR分析；为了目的基因已整合，使用引物对5P(5'-CTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGC-3，)-2M(5,-GACTGCCCACCTGAGAGCGGACA-3')进行PCR分析(12)。使用阳性对照(已知的转基因植株DNA样品)与阴性对照(野生型PetitHavanaDNA样品)，监控PCR反应。对于50微升反应体积，PCR反应体系的组成如下150纳克植株DNA，5微升10X缓冲液，4微升2.5mMdNTP，每种引物各1微升(储备液)，0.5微升TaqDNA聚合酶，加水补足至总体积。扩增30个循环，其程序如下94。C30秒，65。C30秒，72。C30秒(3P-3M引物对)和72'C1分钟(5P-2M引物对)。循环开始前，于94'C预变性5分钟，循环结束后，于72'C最后延伸7分钟。在0.8%的琼脂糖凝胶上，分析PCR产物。Southernblot分析使用QiagenDNeasy少量提取试剂盒，从转基因TO代植株和未转化烟草植株中提取植物总DNA。使用限制性内切酶HincII酶切此总DNA，并在0.7%琼脂糖凝胶上进行电泳2.5个小时，电压为50伏。然后，将琼脂糖凝胶在0.25M盐酸(脱嘌呤溶液)中浸泡15分钟，脱去嘌呤。紧接着，将此胶在蒸馏水中洗涤两次，每次5分钟，然后，在转移缓冲液(0.4N氢氧化钠，1M氯化钠)中平衡20分钟，再经过夜转移至尼龙膜。用2XSSC(3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠)洗膜5分钟，烘干，并使用Bio-RadGS基因交联仪(设置于C3，150m焦耳)进行交联。将pUC-Ct载体经限制性内切酶BamHI和BglII酶切后，得到0.81kb的侧翼序列探针。pLD-SC载体经限制性内切酶BglII和PvuII酶切后，得到400bp的基因特异性探针。这些探针经随机引发的32P标记(易于操作的DNA标记磁珠，Amersham制药公司)处理。使用Stratagene快速杂交溶液(Stratagene，加利福尼亚州)，将这些探针与膜进行杂交。将该膜用50毫升洗涤溶液(2XSSC与0.1%SDS)在室温洗涤两次，每次15分钟。再用50毫升洗涤溶液(0.1XSSC与O.1%SDS)在6(TC进行第二轮洗涤15分钟，提高杂交的严谨性。放射性标记的斑点，用X光片曝光，然后在X光片处理仪中进行显影。Westernblot分析转化与未转化的植株叶组织，各取100毫克，并使用液氮处理碾成细粉，从中提取蛋白。蛋白提取过程，加入200微升提取缓冲液(100mMNaCl，10mMEDTA，200mMTris-HC1，pH8.0，0.05%吐温20，0.1%SDS，14mMBME，400mM蔗糖，2mMPMSF)，并使用微量研磨棒混和样品3分钟。以13，000Xg，将样品离心5分钟，获得包含可溶性蛋白的上清，并与含BME的上样缓冲液混和，煮沸5分钟，然后点样至10%的SDS-PAGE胶中(或为"进行10%的SDS-PAGE凝胶电泳")。使用转移缓冲液(360毫升10X电极缓冲液，360毫升甲醇，0.18gmSDS，1080毫升双蒸水)，将分离的蛋白经Mini-TransferBlotModule电转仪(85伏，45分钟)转移至0.2微米的Trans—Blot硝酸纤维素膜(Bio—Rad)。纤维素膜在p-T-M溶液(PBS(12mMNa2HP04，3.0mMNaH2P04_H20,145mM氯化钠，pH7.2)，0.5%吐温20，3%奶粉)中封闭一个小时，然后转移至含山羊抗lecA抗体的P-T-M溶液。然后，将膜用蒸馏水洗漆干净，并转移至含抗山羊IgG的辣根过氧化物酶(Sigma，美国密苏里州圣路易斯)标记的兔抗体的P-T-M溶液。随后，将膜用PBST洗漆三次，每次15分钟。然后，用PBS洗涤10分钟，随后加入辣根过氧化物酶HRP(Pierce，美国伊利诺斯州罗克福德)的化学发光底物，并于室温放置5分钟，以形成化学发光。使用X光片进行曝光，并在光片处理仪中进行显影。可溶性总蛋白的估计使用Bradford蛋白定量法，测定植株提取物中总蛋白的量。转化与未转化植株的碾碎的叶组织，各100毫克，加入提取缓冲液(15raMNa2C03，35mMNaHC03，0.2克NaN"0.1%吐温20，5mMPMSF，pH9.6)，继续碾磨悬浮蛋白。同时，此提取缓冲液用于配制牛血清白蛋白(BSA)标准品溶液，浓度在0.05ug/ul至O.5ug/ixl不等。用提取缓冲液，将植株提取物以l:10禾nl:20进行稀释。每种标准品溶液和每种植株提取物稀释液各10微升，加入至96孔微量滴定板(Cellstar)的小孔内，每种浓度的样品与标准品各加两份。依据说明，使用蒸馏水将Bradford试剂(Biorad蛋白测定)稀释4倍，每孔加入200微升。在630纳米处读取吸光值。将已知浓度的牛血清白蛋白(BSA)的吸光值与样品的吸光值进行比较，以此估计总蛋白的量。ELISA:使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)，对植株粗提取物中的LecA进行定量。收集转基因植株叶样品(幼叶、成熟叶、老叶，各100毫克)和野生型植株叶样品(幼叶、成熟叶、老叶，各100毫克)。将进行规律光照(光照16小时，暗处8小时)的植株叶样品在液氮中碾磨成细粉，随后，使用植物蛋白提取缓冲液(15mMNa2C03，35raMNaHC03,3mMNaN3，pH9.6，0.1%吐温，5mMPMSF)从植物叶中提取蛋白。碾磨过程，使用机械研磨棒。为了对蛋白浓度进行定量，使用包被缓冲液(15mMNa2C03，35mMNaHCO"3mMNaN3，pH9.6)对标准品、测试样品和抗体进行稀释。将纯化的LecA溶于包被缓冲液中，配制浓度在lOOng/ml至1000ng/ml范围内的标准品溶液。标准品溶液和蛋白样品溶液，各100微升，加至聚氯乙烯96孔微量滴定板(Cellstar)，在37。C包被1小时，随后，用PBST洗涤三次，水洗涤两次。用含3%脱脂奶粉和0.1X吐温的PBS溶液中进行封闭l个小时，随后进行洗涤。将山羊抗LecA抗体(弗吉尼亚大学Mann博士提供)以1:2000的比例稀释至含奶粉的PBST中，然后加至96孔板孔槽中，并放置1小时，随后进行洗涤；然后，将抗山羊IgG的HRP标记的兔抗体(美国Qualex公司)稀释(1:5000)于含奶粉PBST溶液中，并将此溶液100微升加至96孔板。然后，将此96孔板于37'C温育1小时。温育后，使用PBST洗板三次，水洗两次。然后，再向96孔板孔槽中加入100微升3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)底物(购自美国Qualex公司)，并于室温温育10-15分钟。每个孔槽加入50微升2N硫酸终止反应，将96孔板放置于读板器(Dynex科技公司)中在450纳米处进行读取。植物衍生的凝集素抗原在小鼠中免疫接种三组6-7周龄的雌性BALB/c小鼠(每组5只)，在第0，15,30和45天，分别经静脉注射植物粗提取物。第一组小鼠，使用表达凝集素(10微克)的植物粗提取物加上50微升铝胶佐剂进行注射。第二组小鼠，使用表达凝集素(10微克)的植物粗提取物但不加佐剂进行注射。第三组小鼠，使用野生型烟草植物的粗提取物进行注射。在末次注射后第15天(即在第60天)，从眼眶后血管丛取血。将血样于室温静置2小时，并以3000rpm的转速离心10分钟提取血清。ELISA检测血清样品中抗PAIgG的抗体将大肠杆菌中生产的凝集素标准品使用PBS配制成浓度为2.0ug/ml的溶液(pH7.4),并将此溶液加至ELISA96孔微量滴定板进行包被，每个孔槽100微升。此96孔微量滴定板于4t:放置过夜。从小鼠采集的血清样品，进行滴度稀释(1:100至1:20000)。然后，将此稀释的血清样品加至96孔微量滴定板中，每孔100微升，并于37'C放置1小时，随后，使用PBST进行洗涤。然后，每孔加入100微升HRP标记的山羊抗体小鼠IgG抗体(lmg/ml储备液稀释5000倍)，并于37。C放置1小时。TMB(美国Qualex公司)用作发光底物，反应通过加入50微升2M硫酸终止。将96孔板放置于读板器(Dynex科技公司)中在450纳米处进行读取。使用与接种与未接种小鼠之间吸光度差异(0.5)相等的临界值，计算滴度值。结果叶绿体转化载体pLD-SC载体(图1)由通用转化载体pLD-CtV构建。pLD-SC这种叶绿体转化载体，含有aadA基因、LecA编码区和3'psbA,通过同源重组，该载体将转基因表达框整合至叶绿体基因组的trnl-trriA区。转基因整合至一个反向重复区，有助于通过拷贝纠正机制整合至另一反向重复区。转基因表达框中存在的psbA3'非翻译区(UTR)赋予了转录物的稳定性(25'15)。嵌合的氨基葡糖苷3'腺嘌呤转移酶(aadA)基因(其赋予了对大观霉素的抗性)，用作一种选择标记，其表达由16S(Prrn)启动子驱动(1°'5'23)。在蛋白合成过程，大观霉素与70S核糖体结合，抑制肽酰tRNA从A位点转位至P位点。aadA基因编码氨基葡糖苷3'腺嘌呤转移酶，这种酶将ATP的腺苷酸部分转移至大观霉素，以此抑制该霉素的活性。PCR分析确认转基因整合至叶绿体-烟草叶经包裹pLD-SC质粒的金微粒轰击后，培养5至6周，大约每块平板有5个芽苗出现。真正的叶绿体转化子与细胞核转化子及PCR突变体之间是有区别的。转基因在叶绿体中的整合，使用两条引物3P和3M进行检测(10，5，23)。如图2A所示，引物3P靶向16SrRNA基因内的天然叶绿体DNA，引物3M耙向aadA基因。因为引物3P不与细胞核转化子退火，因此可以排除核转化子的干扰，同样，由于引物3M不与突变体退火，也可以排除突变体的干扰。靶向整合至叶绿体的转基因的引物3P和3M，产生的扩增产物片段为1.65kb，如图2B所示。aadA基因、基因10-LecA基因和3'psbA表达框是否整合至叶绿体，通过使用引物5P和2M并经PCR分析证实。引物5P和2M分别与aadA基因和trnA基因的内部区域退火，如图2A所示。LecA阳性克隆的扩增产物大小为3.3kb,同时，突变体和对照应无扩增产物。图2C显示了引物5P/2M的PCR分析结果。经两条引物PCR分析后，转基因植株随后进行三轮不同的筛选，以获得成熟植株并达到植株同质化。同质化转基因植株的获得那些经PCR分析为阳性的植株，通过三轮筛选后，进行Southern分析，确定转基因的位点特异性整合及其同质性。对于培养瓶中完全再生的克隆(第三次筛选)，从中提取DNA,用于Southern分析。基因表达框在叶绿体基因组发生位点特异性整合，通过使用0.81kb的侧翼序列探针进行检测(图3A)。图3B显示了植株DNA中HincII限制酶切位点。转化的叶绿体基因组经HincII酶切后，产生pLD-SC质粒上对应的6.0kb和2.0kb两个片段(图3C),同时，未转化的叶绿体基因组经HincII酶切后，仅产生一个5.0kb的片段。侧翼序列探针同样显示了，通过三轮筛选后，叶绿体基因组是否已达到同质。表达LecA的植株显示出同质性，因为在转基因株系中没有发现杂交的野生型片段。使用基因特异性探针，6kb片段出现，显示转基因已整合，如图3D所示。LecA在转基因植株中的表达使用山羊抗LecA多克隆抗体检测64kDa蛋白。经检测，野生型植株(Petithavana)无任何条带显现，表明抗LecA抗体未与粗提取物中其它蛋白质发生交叉反应。Tl代植株中，LecA也显示出良好水平的表达(图4)。每一泳道中，LecA抗体检测出的LecA蛋白大约有1.5微克。分子量相对较低的条带可能是LecA蛋白的降解带，而分子量相对较高的条带可能为LecA蛋白的聚体。转基因植株产生的LecA蛋白的定量不同稀释度的LecA纯品用于制作标准曲线。所用的一抗为山羊抗LecA多克隆抗体，所用二抗为兔抗山羊IgG抗体(过氧化物酶标记)。使用Bradford蛋白定量测定法，计算LecA的百分率，以可溶性总蛋白(TSP)的百分率表示，即LecA百分率与TSP值成反比。在老叶中，LecA的表达水平最大可达可溶性总蛋白的6.3%，幼叶中为2.6%,成熟叶中为5.2%。对比于幼叶和成熟叶，LecA的最大表达水平出现于老叶中(图5A)。根据鲜重计算结果，幼叶、成熟叶和老叶中LecA的含量分别为每片叶0.67毫克、2.32毫克和1毫克(图5B)。图5C显示每毫克叶中所含的LecA微克数。免疫原性评价确认凝集素在转基因植株中表达后，我们对这种植物生产凝集素的体内功能进行检验。对此，使用凝集素表达植株的粗提取物进行小鼠免疫接种。接种凝集素表达植株的粗提取物并加佐剂的小鼠群，接种后抗体滴度达1:10000，那些接种凝集素表达植株的粗提取物但不加佐剂的小鼠群，接种后的抗体滴度达1:4000(图6)。讨论-pLD-SC载体(图l)是由通用转化载体pLD-CtV构建'5)。pLD-SC转基因表达框，通过同源重组整合至叶绿体基因组的trn1-trnA区域。LecA重组蛋白在叶绿体中的表达依赖于多种因素。第一，设计的pLD-SC载体，能通过同源重组整合至叶绿体基因组的反向重复区。因此，当在此位点整合时，转基因的拷贝数可以翻倍。基因拷贝数增加引起转录本水平增加，从而生成的蛋白量就更高"°''9)。第二，T7噬菌体基因10的5，UTR含有核糖体结合位点(rbs)，而且psbA3'非翻译区(UTR)用于调控转基因的表达，这均有助于增强外源蛋白的翻译U5，19)。第三，转基因同质化是一种状态，即所有叶绿体基因组都含有转基因表达框。每个细胞有100至1000个叶绿体，每个叶绿体又有100至1000个叶绿体基因组(8'"'。在含有大观霉素的培养基中进行几轮筛选以到达同质性，这对于重组蛋白的生产达到最佳状态以及转基因达最佳稳定性来说，是至关重要的。如果植株没有达到同质性，那么异质性可能会引起细胞分裂产生的两个基因组的相对比率发生变化。嵌合的氨基葡糖苷3'腺嘌呤转移酶(aac!A)基因(其赋予了对大观霉素的抗性)，用作一种选择标记，其表达由16S(Prrn)启动子驱动，。第四，外源蛋白的表达可能依赖于基因的来源以及它本身的AT/GC相对含量。这种原核类叶绿体富含AT序列，其反映了各别tRNA的高丰度。因此，可以预期AT含量为67%的这种LecA基因可以在叶绿体中较好的表达。合成的人垂体生长激素(HST)、人血清白蛋白、人干扰素-a2b、人干扰素-a和胰岛素样生长因子的高效表达说明，真核基因也可以在叶绿体这种质体中表达(17'7'4°'27'6)。但是，某些真核基因需经优化后，才能在叶绿体中表达。通过叶绿体基因组基因工程表达LecA适用于两种目的高水平表达和基因约束。PCR分析用于将叶绿体转化子同细胞核转化子及突变体区分开来。使用Southernblot分析，确认基因表达框的位点特异性整合以及确定植株的同质性或异质性。在成熟叶和老叶中，LecA蛋白获高水平表达，经酶联免疫吸附测定法定量，其数量达可溶性总蛋白的6.3%。当根据百分比TSP和鲜重计算时，老叶与成熟叶中的LecA表达水平有差异，这是因为相对于成熟叶，老叶中TSP水平低的缘故。老叶中TSP水平低，相比于LecA蛋白，可能是由于可溶性蛋白的降解。根据鲜重，当撇开TSP不计时，成熟叶中LecA有更高水平的表达。每棵植株成熟叶中叶绿体数量越多，成熟叶数目越多，大小越大，越有助于更高水平的表达。如果每棵植株LecA的平均产量为24毫克(表l)，则每英亩转基因植物应该产生2.9千万个此种剂量的疫苗抗原。这说明，相比于细菌表达系统，使用植物生产疫苗抗原可得到低成本疫苗。在加与不加佐剂的情况下，接受提取物接种的动物组之间抗体滴度存在差异是由于累积效应m和铝胶的非特异性免疫系统引发作用。对照组小鼠使用野生型植株叶粗提取物接种，没有显示出任何免疫应答，表明在转基因植株粗提取物存在时，重组的凝集素能够特异地引发免疫应答。以前有报道，使用全长的天然凝集素抗原在沙土鼠中经皮下接种，产生的抗体滴度可达1:1024(35)。同样，使用凝集素半胱氨酸富集区的25肽在沙土鼠中经皮下接种，产生的抗体IgG滴度可达1:200。在本研究中，使用LecA转基因株系的粗提取物进行免疫接种，产生的抗体滴度达1:10000。这比纯化的全长天然凝集素抗原或此凝集素半胱氨酸富集区肽段的免疫原性高出10-50倍。使用叶绿体衍生的LecA蛋白进行免疫接种，甚至在LecA没有纯化的情况下，其诱发IgG抗体产生比以前的研究结果更有效，而且为阿米巴疾病的疫苗开发开辟了新途径。由于BALB/c小鼠对溶组织内阿米巴的感染不敏感，从而没有进行病原体挑战试验。在本研究中，我们进行免疫接种试验的目的，是检验植物衍生的LecA蛋白诱发IgG免疫应答的能力。本研究报道了，LecA蛋白首次在植物表达系统中进行成功表达。而且，对于病原体挑战试验，IgA抗体产生的效率将高于IgG抗体，因为感染主要发生于肠粘膜，而在此处，IgA抗体在有效中和感染方面发挥了主要作用。因此，在将来的研究中，将植物表达的LecA蛋白经口服途径进行免疫接种，研究其诱发IgA应答，并着手进行病原体挑战。研发表达LecA蛋白的转基因胡萝卜，将打开以口腔途径接种疫苗之门，并形成粘膜免疫应答。阿米巴疾病的一种理想疫苗，应该可以诱发粘膜和全身性的免疫保护。如果皮下和口服途径接种疫苗证实是具有免疫保护作用的，那么可证明引发粘膜和全身性免疫系统不仅是一种最廉价的疫苗接种途径，而且是一种抵抗任何攻击粘膜和全身性系统的病原体的最有效免疫接种方法。参考资料1.Audibert^F,2003,Adjuvantsforvaccines,aquest.IntJtomxunopharmadol,3:1187-1193,2.股a逸A*2005.EgressionofH印atitisCviral咖-structuial3protdnintransgeniccbloroplasts.Master'sthesis，UniversityofCentralFlorida^3.Dani吼H.2004，Medicalmolecularpharming:therapeuticrecombinantantibodies,biophamiaceuticalsandediblevaccinesintransgenicplantsengineeredviathechloroplastgenome，p.704710.R.MGoodman(ed)EncyclopediaofPlantandCropScience,farcedDecker,NewYork4.DaxdeDyH.2002,Molecularstrategiesforgenecontainmentintransgeniccrops.NatBiotechnoL加581-587,5.Daniell,EL1997,TransformationaiidforeigngeneegressioninplantsmediatedbymicroprojectilebombardmentMethod^,Mol.Biol.62:453488.6，DrndeU)H"S,ChebolAS,Komar，M.Sin^etonyandILFakon欲.2005.Chloioplast-derivedvaccineantigensandothertiier^peuticproteiiis.Vaccine.23:1779-1783，7,0sni吼H"RCohfl^S,Kumar,N.Dufourm幼t昧旭dDubald*2004.Chlorpplastgeneticengineering,p.423~468,&zH.DaciellandC'Chase(ed),Molecularbiology抑dbiotechnologyofplantorganelles.KhiwerAcademicPublishers,Donbecht*8.Daniell,EL,1MLKh叫旭dLAHison.2002.Milestonesindhloroplastgeneticengineering:anenviroDinentallyfriendlyerainbiotechnology.TrendsPlantScL7:8—919,DantellyEL，S*Kumar,肌dN*DofourmanteL2005,Breakthrou扭inchloroplastgeneticengineeringofagro加xnicallyimportantcrops.TrendsBiotedhnol.23:238-43,10.Daniel^H"SALeAT.Panchal^幼dP.O.柳ebe，2001ExpresdonofcholeratoxinBsubunitgeneandasseniblyasfimctionaloligomersintransgenictobaccocbloroplasts,JMolBiol.311:1001—1009,11Daniel^SL,0N.Ruiz^andA*Dhingra,2004.Chlorqplastgeneticengineeringtoimproveagrononiictraits.MethodsMol.Biol.286:111-137.12.DeCosa，B"W.Moar,SJB,Lee，1VLMiller,andELDanielL2001.Overexp微sionofthe5toy2Aa2邻eroninchloropUistsleadstoformationofinsecticidalcrystals.NatBiotechnoL19:71-74,13，BeGray,G"ICRajasekaraiiyF.Smith,LSanford^andHDanielL2001Expressionofanantimicrobisdpeptideviathechloroplastgenometocontrolphytopaihogenicbacteriaaadfongi.PlantPhysioL127:852-862.14.Devine^AX，旭dH.DanielL2004.Chloroplastgeneticengineeringforenhancedagronomictraitsandexpressionofproteinsformedical/industrialapplications,p，283-323.itzS.G,M0ller(ed),Plastids,Blackwdlpublishing,Oxford.15,Dhingra，A，AJLPortis，旭dELDanielL2004，Enhancedtranslationofachloropl^t-express;i^cSgenerestoressmallsubunitlevelsandphotosynthesisinnuclearamis咖e版Splants.Proc.Natl.Acad.ScLUS入-lOl:6315-6320.16.Dodson^J.M,，P,W,LenkowsldJr"AC.Eubanks，TJF.G丑Jackson^J.Napod旭o，DMLyerly，HLockhart^BJJVfa叫andWA,PetriJr.1998.Infectionandimmunitymediatedbythecarbohydraterecognitiondomainofthe五"/a加oe2wAisto/WcflGal/GalNAclectin.JInfectDis.179:460-466.17.F咖幼dez-SanMfllan，A.,AM,Miugeo-Castel,M,Miller，andH,DanielL2003.Achloroplasttransgraiicapproachtohyper-expressandpurifyhumanserumalbumin,aproteinhighlysusceptibletoproteolyticdegradatioixPlantBiotec^nolJ,1:71-79，18.Grevich，J,J.andDanielL2005,Chloroplastgeneticengineering:Recentadvancesandfixtureperspectives.Crit.Rev.PlantSci.24:83-108.19.Guda，C.，S.B.Lee,andH*DanielL2000.Stableegressionofbiodegradableproteinbasedpolymerintobaccochlor叩lasts.PlantCellH印.19:257-262.20.HouptyE"L.Barroso,LLockhart^ILWrigh、C.Cramer,D.Lyerly，andW丄Petri,Jr.2004.Preventionofitrtestiiialamebiasisbyvaccinationwith五ntomoeZaAiyfofyft'caGal/GalNAclectinVaccine22:611617.21.Husto]^CJD.，andW,APetriJr.1998.Host-pathogeninteractioninAmebiasisandprogressvaccinedevelopmentEur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis，17:601-614.22.Koya，V.，M.MoayerijS,H.L柳la，andH.DanielL2005,Plantbasedweeine:miceimmunizedwithchioroplast-derivedanthraxprotectiveantigensurviveanthraxlethaltoxin.'challenge.Infect.Immua73:8266-8274.23.K咖ar，S.andELDanieU.2004.Engineeringthedhloroplastgenomeforhyper-e邵ressionofhumantherapeuticproteinsandvaccineantigensinrecombinantproteinprotocols.MethodsMol.Biol.267:365-383.24.ICumar，S,,ADhingra^andBLDanieU.2004.Plastid-expressedbetainealdehydedehydrogenasegeneincairotculturedcells,roots,andleavesconferenhancedsalttolerance.PlantPhysiol.136:2843-2854.25.Ku咖r，S.，ADhingra，andELDanielL2004.Stabletransfoimationofthecottonplastidgenomeandmatmialinheritanceoftransgeues.PlantMol.Biol,56:203-216.26.Lee，SJB.，ELB.KwoaS.J,KwoaS.C，ParkjM丄Jeong，S.E.Han，M.O.ByuDj幼dDanielL^003.Accumulationoftrehalosewitliintransgeniccbloroplastsconfersdroughttolerance.MolBreed11，1—13.27.Leelavathi,S"andV.S.Reddy,2003,Chloroplastexpressiono￡His-taggedGUSfosions:ageneralstrategytooverproduceandpurifyforeignproteinsusingtransplastomicplantsasbioreactors.MolBreed.11:49-58.28.LotterH"F,Khajawa^S.L,StanleyJr"andE.Tannich.2000.Protectionofg红biisfromamebicliverabscessbyvaccinationwitha25-merpeptidederivedfromtheCystdne-RichRegionof五"tomoefcatoto/;yft'caGalactose-spec迅cadherencelectin.InfectLniiiun.68:44164421.29.Ma叫B.J.2002'Structureandfonctionofthe五;fa加oeiflA&tofyric"Gal/GalNAclectin,Intl.Rev,Cyt.216:59-80.30.Mann^B丄,C.Y，Chung，JJMDodson，L.S.Ashley,LJL,Braga^T丄，Snodgrass,1993.Neutralizingmonoclonalantibodyepitopesofthe^Wto加oeZwA/对o/yft'c"galactoseadhesinmaptothecysteine-ridiextracellulardomainofthe170-kQodaltonsutmnit.InfectIrnmun.61:1772-1778.31.Ma叫B,J"andLA.Lockhart1998.MolecularanalysisoftheGal/GalNAcadhesinof五"to/noe6(3Afato/j/rtca.JEuLMicrobiol.45:13S-16S.32.McCoy,J.J"B.XMa皿,胆dWAJPetriJr.1994.Adherenceandcytotoxicityof五咖moe&atotofyft'azorhowlectinsletparasitestickaround.Infect.ImmuiL62:3045-3050.33.McCoy，J丄，BJaManB9T，S.Vedvick^Y.PakjIXB-Heimark^WAJPetriJr.1993'Structiiralanalysisoftheli^htsubimitofthe五幽moe6。galactose邻ecificadherencelectin.J.Biol.Chem.268:24223-24231.34.Molina^A，S.Herva-Stubbs,HJDaniell，A*M.Mingo-Caste^andJ,VeramendL2004.Hi扭yieldegressionofaviralp印tideanimalvaccineintransgenictobaccochloroplasts.PlantBiotechnoLJ.2:141-153.35.Petri，W.AJr"R>Haq叫andB,J.Mann*2002.Thebittersweetinter&ceofpaxasiteandhost:lectin-carbohydrateinteractionsduringhumaninvasionbytheparasite五"tomoe6atooZyticfl,Annu.iev.MicrobioL56:39-64.36.Quesada-Vargas，T，0>N.RuiZ)ELDaniell.2005.Characterizationofheterologousmultigeneoperonsintransgenicchloroplasts.Traoscriptionjprocessingandtranslation.PlantPhysiol.138:1746-1762.37.Ramakrishn叫G.,S.Lee，BJ-Mann^andW.AJPetriJr2000.Rotamoebahistolytica:deletionoftheGPIanchorsignalsequenceontheGal/GalNAclectinli扭tsubunitpreventsitsassemblyintothelectinheterodimer.E邓Parasitol.96:57-60.38.RuizO,N汰ndHDaniell2005.EngineoingcytoplasmicmalesterilityviathechloroplastgenomebytheexpressionofP-ketotiiiolase.5lantthysiol.138:1232-1246，39.Stanley,S丄，Jr'1997.Progresstowardsdevelopmentofavaccineforamebiasis.Clin.Microbiol.Rev,10:637-649，40.Staub,tLM.，B.Garda，J,Graves,P,T.J.Hajduklewkz，P.Hunter,N.Nehra，V,Paradkar，M,ScbIi幼er，XA*Carrol^Spatola^D.Ward^G.Ye，andDJLRussell,2000.扭^h-yieldproductionofahumantherapeuticproteinintobaccochloroplasts.NatBiotechnol.18:333—338.41.Singleton，M工，2003.ExpressionofCaFlandLcrVasaftisionproteinfordevelopmentofavaccineagainstYerw》w'flpasrisviachloroplastgeneticengineering.Master'sthesis,UniversityofCentralFlorida.42.Tregoning，丄S,，P.Nixon，ELKuroda，Svab,S.Clare^F.Bowe，N,Fair-w幼也er,J.Ytterberg，ICJ,vanWljl^G.Dougan^andPalMaliga.2003.Expressionoftetanustoxinfragment(3intobaccochloroplasts.NucleicAcidsRes.31:174-1179,43.Watson^J"V.Koya，S.Leppla，andH,DanielL2004.Expressionof^cz7Zus朋快ra^protectiveantigenintransgenicchloroplastsoftobacco,anon-food/feedcrop.Vaccine22:43744384,表l:pLD-SC烟草T。转基因株系中LecA的相对表达量<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>计算以每株植物平均产24.29毫克LecA蛋白计算，一英亩8000株植物，可生产的LecA蛋白量为8000*24.29=194320毫克。根据每年有三次收成计算，总产量将为582960毫克。纯化过程蛋白的平均损失率以50%计，LecA蛋白的净产量将为291480毫克。凝集素疫苗单次剂量为IO微克。以此剂量计算，291480毫克LecA蛋白应该可以生产29148000(大约2.9千万)份此种剂量的疫苗制品。因此，可以从一英亩烟草中获得2.9千万份疫苗制品。最后，尽管本发明列举了各种实施方案并做说明，但是，很明显，这些实施方案仅通过实例的方式列举。只要不偏离本发明，可以进行多种变动、变更和替换。因此，本发明仅限定于发明所附权利要求的精神和范围。本发明引用的所有专利及其它参考文献的训导，以引证的方式全部并入本申请，某种程度上，它们并非与本发明的训导不一致。权利要求1.一种在受试者中诱发预防溶组织内阿米巴感染的血清抗体产生的方法，其包括在所述受试者中接种一种组合物，其中所述组合物由一种LecA多肽和一种植株残余物组成。2.—种在人中接种疫苗防止溶组织内阿米巴感染的方法，其在人中接种免疫数量的含一种LecA多肽的组合物，其中，所述的LecA多肽来源于一种表达所述LecA多肽的转化植株。3.—种含有免疫有效数量LecA多肽和植株残留物的疫苗组合物。4.一种稳定的质体转化与表达的载体，其包括一个从5'至3'翻译方向作为开放连接组分的表达框，该表达框包括一种在所述质体中起作用的启动子，一种选择性标记序列，一种异源多聚核苷酸序列，其编码产物与LecA蛋白至少有70%的相似性、在所述质体中具功能的转录终止区、以及表达框两侧的侧翼序列，这种侧翼序列为与目的质体基因组DNA序列具同源性的侧翼DNA序列，由此，异源编码序列稳定整合至目的植株质体基因组这一过程，通过侧翼序列与目的质体基因组中的同源序列之间的同源重组得以顺利完成。5.根据权利要求4中的载体，其中所述质体选自由下列物质组成的群组叶绿体、色质体、淀粉形成体、前质体、白色体及黄色体。6.根据权利要求4中的载体，其中所述选择性标记序列为非抗生素选择标记。7.—种稳定转化的植株，其包括使用权利要求4中载体或其子代稳定转化的质体，包括种子。8.根据权利要求7中一种稳定转化的植株，其为一种单子叶植物或双子叶植物。9.根据权利要求7中一种稳定转化的植株，其为玉蜀黍、稻、草、裸麦、大麦、燕麦、小麦、大豆、花生、葡萄、马铃薯、甘薯、豌豆、芸苔、烟草、蕃茄或棉花。10.根据权利要求7中一种稳定转化的植株，其能为哺乳动物和人类所食用。11.根据权利要求7中一种稳定转化的植株，其中，所有叶绿体均获得转化。12.—种生产LecA多肽的工艺，包括将根据权利要求5所述的一种质体转化载体整合至植物细胞的质体基因组；培养所述植株细胞，由此表达所述的保护性抗原。13.—种转化后包含LecA多聚核苷酸以表达LecA蛋白的质体基因组。全文摘要在此介绍的是，制备一种溶组织内阿米巴疫苗的方法，以及在受试者中接种此种疫苗的方法。特别举例说明的是，那些表达一种LecA多肽的植株，以及从这种植株中获得的原料，作为疫苗接种的主要成分。文档编号C12N15/82GK101291579SQ200680018591公开日2008年10月22日申请日期2006年5月30日优先权日2005年5月27日发明者亨利·丹尼尔申请人:中央佛罗里达大学研究基金会有限公司