具有增加的产量的植物及其生产方法

专利名称：：具有增加的产量的植物及其生产方法具有增加的产量的植物及其生产方法
技术领域：
：本发明一般涉及分子生物学领域并涉及用于与相应的野生型植物相比增加植物产量的方法。更特别地，本发明涉及用于增加植物产量的方法，其包括将编码细胞周期蛋白D3(CYCD3)的核酸引入植物，所述核酸在能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下。本发明还涉及包含分离的核酸的植物，所述核酸编码CYCD3多肽，在能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下，所述植物具有与相应野生型纟直物相比增加的产量。本发明还提供在本发明的方法中有用的构建体。不断增长的世界人口和逐渐减少的农业耕地促使研究朝提高农业效率的方向发展。用于作物和园艺改进的传统方式利用选择性育种技术来鉴定具有目标性状的植物。然而，此类选择性育种技术具有缺点，即这些技术一般是劳动密集型的并获得常常含有异质性遗传成分的植物，其不能够总是获得从母本植物传递而来的目标性状。分子生物学的进步已允许人类修饰动物和植物的种质。植物的基因工程需要分离和操作遗传物质(一般以DNA或RNA的形式)并随后将遗传物质引入植物。此类技术能够生产具有多种改良的经济、农艺或园艺性状的作物或植物。一个特别的经济上重要的性状是产量。产量通常定义为作物经济价值的可测定的生产，并可用数量和/或质量来定义。产量直接依赖于几个因素，例如，器官的数目和大小、植物结构(例如分枝的数目)、种子生产等。根发育、营养吸收和压力耐受力也可为决定产量的重要因素。优化上述因素之一可因此促使作物产量的增加。一个特别的经济上重要的性状是种子产量。植物种子是人和动物营养的重要来源。作物例如玉米、稻、小麦、油菜和大豆占了总的人类热量才聂入的一半以上，无论通过种子本身的直接消费还是通过由加工的种子生产的肉制品的消费。它们还是糖、油和多种用于工业过程的代谢物的来源。种子含有胚一一萌发后新枝条和根的来源，和胚乳一一胚生长、萌发期间和幼苗的早期生长过程中的营养物来源。种子的发育涉及许多基因，并需要从根、叶和茎中将代谢物转移至生长的种子中。胚乳特别吸收糖类聚合物、油和蛋白质的代谢前体，并将其合成储藏大分子以填充谷粒。增加植物产量的能力，无论通过改变种子相关的性状，例如种子数量、种子生物量、种子发育、种子填充或任何其他种子相关的性状，还是通过增加植物器官的数量和大小，或通过影响植物结构(例如，分枝的数目)、才艮发育、营养4聂入或压力耐受力，在农业中将有许多应用，甚至许多非农业用途，例如在物质例如药物、抗体或疫苗的生物4支术生产中。可增加植物产量的方法之一是通过改变植物的固有生长机制。植物的固有生长机制在于高度有序的事件，其共同称为"细胞周期"。通过细胞周期的行进是所有多细胞生物的生长和发育的基础，并对于细胞增殖是至关重要的。酵母、哺乳动物和植物中的细胞周期的主要成分是高度保守的。细胞周期一般分为下列顺序的时期G0-G1-S-G2-M。DNA复制或合成通常发生在S期("S"是指DNA合成)且染色体的有丝分裂分离发生在M期("M"是指有丝分裂)，伴有介于其间的间期，Gl(细胞在DNA复制之前生长的过程)和G2(在DNA复制之后细胞准备分裂的阶段)。细胞分裂在胞质分裂-M期的最后步骤后得以完成。将那些已退出细胞周期并变为静止的细胞称为处于GO期。在此时期中的细胞经刺激可重返细胞周期处于Gl期。Gl、G2和G0中的"G"代表"间隙"。细胞周期过程的完成使得每个处于细胞分裂过程的子细胞获得亲代基因组的完整拷贝。细胞分裂由两个主要的细胞周期事件来控制，即DNA合成的启动和有丝分裂的启动。向每个这些关键事件的每次转换过渡均受到检验点的控制，所述检验点由特定的蛋白质复合体代表(涉及DNA复制和分离)。哺乳动物和植物细胞中Gl/S边界上DNA合成所需基因的表达受到转录因子的E2F家族的调节(LaThangue，1994;Muller等人，2001;DeVeylder等人，2002)。进入细胞周期受到E2F/Rb复合体的调节/引发，其整合信号并使得细胞周期基因的转录激活。细胞周期不同时期之间转换并和从而在细胞周期中行进，是受不同的异二聚体丝氨i^/苏氨酸蛋白激酶——通常称为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的形成和激活来驱动的。这些激酶活性的必要条件是其与特定的细胞周期蛋白的物理结合，激活的时间选择主要依赖于细胞周期蛋白的表达。细胞周期蛋白结合引起所结合的CDK的N-末端片段的构象改变并促使复合体的定位和底物特异性。单体CDKs在与细胞周期蛋白相结合时激活并从而具有激酶活性。细胞周期蛋白水平在细胞周期中波动并因此代表决定CDK活化的时间选择的主要因素。在细胞周期过程中，这些含有细胞周期蛋白和CDK的复合体的周期性激活介导细胞周期转换(检验点)的时序调节。细胞周期蛋白可分为有丝分裂的细胞周期蛋白(在高等真核生物中命名为A-和B-型细胞周期蛋白，在芽殖酵母中命名为CLBs)和Gl特异的细胞周期蛋白(在哺乳动物中命名为D-型细胞周期蛋白，且在芽殖酵母中命名为CLNs)。H-型细胞周期蛋白调节CAKs(CDK激活的激酶)的活性。植物中已知的所有四种类型的细胞周期蛋白大部分是根据其与其人类对应物的类比而得以鉴定的。在拟南芥中，已描述了10种A-型、9种B-型、10种D-型和1种H-型细胞周期蛋白(Vandepoele等人，2002)。将拟南芥中的10种D-型细胞周期蛋白分为7个亚类，Dl至D7,其反映出它们彼此之间缺乏高的序列相似性，这与A-型和B-型细胞周期蛋白相反。只有D3和D4亚类具有多于一个成员，分别为3个和2个。以前已有建议，将D3型细胞周期蛋白的冗余作为当敲除单个D3-型细胞周期蛋白时不能观察到突变体表型的一种解释(Swaminathan等人，2000)。两种D3型细胞周期蛋白经最近的部分复制而连接，这表明这些是功能上冗余的。一种类似的假说可以支持D4-型细胞周期蛋白，因为三个中的两个定位于复制块上。与A-和B-型细胞周期蛋白相比，D-型细胞周期蛋白中所显示的更大区别可能反映了D-型细胞周期蛋白在将发育信号和环境信号整合进细胞周期中的潜在作用。例如，D3-型细胞周期蛋白已显示出对植物激素例如细胞分裂素和油菜素类固醇的反应，而CYCD2和CYCD4在Gl期中较早地激活，并对糖可用性起反应(对于综述，见Stals和Inz6,2001)。据报道烟草中CYCD2;1基因的过表达在未有形态改变的情况下增加了细胞分裂并提高了总体的植物生长速度(Cockcroft等人，2000)。据报道，拟南芥中CYCD3;1基因在CaMV35S启动子控制下的过表达使植物具有变大的子叶、显著减小的最终植物大小和扭曲的发育。在细胞水平，细胞从G1推进，引起分生组织区域和那些细胞分裂通常缺失或受限的区域中的异位细胞分裂。细胞数目的增加伴随着细胞大小的减小(Dewitte等人，2003)。本发明的目标是克服与植物中CYCD3表达的现有技术相关的一些问题。目前已发现，将编码CYCD3多肽的核酸引入植物中，处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子的控制下，使植物相对于野生型植物具有增加的产量，尤其是相对于那些在不能优先驱动胚乳中表达的启动子控制下的转基因植物具有增加的产量。因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种用于增加植物产量的方法，包括将编码CYCD3多肽的核酸引入植物中，使其处于能够优先地在种子胚乳中表达该核酸的启动子的控制下。有利地，根据本发明的方法的操作导致植物与对应的野生型植物相比具有增加的产量，特别是种子产量。将此处所述的术语"增加的产量，，用于表示下列任何一种或多种增加，每种均相对于野生型植物(i)一个或多个植物部分的增加的生物量(重量)，其可包括地上(可收获的)部分和/或(可收获的)地下部分，特别是增加的根生物量；(ii)增加的总的种子产量，其包括种子生物量的增加(种子重量)，重量的增加；(iii)每个圆锥花絮的花("小花，，)数目的增加；(iv)(饱满)种子数目的增加；(v)增加的种子大小，其也可影响种子的组成；(vi)种子体积的增加，其也可影响种子的组成(包括油、蛋白质和糖类总含量和组成)；(vii)增加的个体种子面积和/或种子周长；(viii)增加的个体种子长度和/或宽度；(ix)提高的收获指数，其表达为可收获部分产量例如种子占全部生物量的比率；和(x)提高的千粒重(TKW)，其可从所计数的饱满数量和它们的总重量外推出来。提高的TKW可产生自增加的种子大小和/或种子重量。提高的TKW可产生自胚大小(重量)和/或胚乳大小(重量)的增加。种子大小、种子体积、种子面积和种子长度的增加可由于种子特定部分的增加，例如由于胚和/或胚乳和/或糊粉和/或盾片和/或子叶或种子其它部分大小的增加。以玉米为例，产量的增加可表现为下列的一种或多种每公项或亩的植物数量的增加、每植物穗的数量的增加、行数的增加、每行米粒数、米粒重量、千粒重、穗长/直径的增加、种子饱满率(其为满种数量除以种子总数并乘以IOO)的增加，等等。以稻为例，产量的增加可表现为下列的一种或多种每公项或亩的植物数量、每植物圆锥花序的数量、每个圆锥花序的小穗数量、每个圆锥花序的花的数量、种子饱满率的增加、TKW的增加，等等。产量的增加也可导致改良的结构、或可以由于改良的结构而发生。根据优选的特征，本发明方法的实施导致具有提高的种子产量的植物。特别是，此增加的种子产量包括每圆锥花序花的数目的增加、增加的总的种子产量、增加的TKW和增加的收获指数、每个均相对于相应的野生型植物。因此，根据本发明，提供了一种用于增加植物中种子产量的方法，该方法包括将编码CYCD3多肽的核酸引入植物，所述核酸处于能够优先在种子的胚乳中表达该核酸的启动子的控制下。既然根据本发明的转基因植物具有增加的产量，很可能是这些植物表现出增加的生长速率(在至少部分它们的生命周期中)，其相对于相应的野生型植物在其生命周期的相应阶段而言。增加的生长速率对于植物的一个或多个部分(包括种子)可为特异的，或可基本为整个植物特异的。具有增加的生长速率的植物甚至可表现出早期开花。生长速率的增加可发生在植物生长周期的一个或多个阶段，或基本上在整个植物生命周期过程中。植物生命周期的早期阶段中增加的生长速率可反映出增强的活力。生长速率的增加可改变植物的收获周期，允许植物比其他可能的方式更晚播种和/或更早收获。如果生长速率充分提高，其可允许同一植物物种的再次播种(例如在一个常规的生长周期中，在播种和收获稻植物之后播种和收获另外的稻植物)。类似地，如果生长速率得以足够提高，其可允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种和收获稻植物后，例如播种和任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物稻)。从同一根茎收获额外的次数在一些作物的情况下也是可能的。改变植物的收获周期可引起每亩的年生物量产品的增力口(由于任何特定植物可生长和收获的次数(如一年中)增加)。生长速率的增加也可允许转基因植物比野生型对应物在更广的地域范围内培养，因为种植作物的区域限制常常由种植(早季)时或收获(晚季)时的不利环境条件来决定。如果收获周期缩短，此类不利条件可避免。生长周期可通过来自生长曲线的多种参数来确定，此类参数可为T-Mid(植物达到其最大尺寸的50%所需的时间)和T-卯(植物达到其最大尺寸的卯％所需的时间)，等等。本发明方法的实施使植物具有提高的生长速率。因此，根据本发明，此处提供了用于相对于相应的野生型植物的生长速率而言，提高植物生长速率的方法，该方法包括将编码CYCD3多肽的核酸引入植物中，所述核酸处于能优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子的控制下。无论当植物处于无胁迫状态还是当植物暴露于多种胁迫之下，与对照植物相比，产量和/或生长速率的增加均会发生。植物通常会通过生长地更加緩慢来对暴露于胁迫进行响应。在严重胁迫的情况下，植物可能甚至完全停止生长。在另一方面，此处将轻微胁迫定义为，当植物暴露其中时，不会导致植物完全停止生长、失去重新生长的能力的胁迫。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，在种植的作物中常常不会遭遇严重胁迫。因而，由轻微胁迫引起的受损的生长对于农业常常是不受欢迎的特征。轻微胁迫是植物可能暴露的通常胁迫。这些胁迫可为植物所暴露的日常的生物的和/或非生物的(环境的)胁迫。通常的非生物或环境胁迫包括由非典型的热或冷/严寒的温度引起的温度胁迫、盐胁迫、水胁迫(干旱或过度的7K)。化学品也可导致非生物的胁迫。生物胁迫通常是那些由病原体例如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的胁迫。有利地，本发明方法的实施允许任何植物中产量得到增加。此处所用的术语"植物"包含完整植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花、及组织和器官，其中上述的每种均包含目的基因/核酸。术语"植物"还包含植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区域、配子体、花粉和小孢子，再次其中上述中的每种均含目的基因/核酸。在本发明方法中尤其有用的植物包括所有属于绿色植物(Viridiplantae)总科的植物，尤其是包括选自下列清单的饲料或祠料荚果、观赏植物、食物作物、树木或灌木的单子叶和双子叶植物，其中包括金合欢属物种(Acaciaspp.)、槭树属物种(Acerspp.)、浙尔猴湘匕属物种(Actinidiaspp.)、七叶树属物种(Aesculusspp.)、新西兰贝壳杉(Agathisaustralis)、Albiziaamara、三色桫移(Alsophilatricolor)、须芒草属物种(Andropogonspp.)、落花生属物种(Arachisspp)、槟榔(Arecacatechu)、Asteliafragrans、黄芪(Astragaluscicer)、Baikiaeaplurijuga、桦木属物种(Betulaspp.)、芸莒属物种(Brassicaspp.)、木揽(Bruguieragymnorrhiza)、Burkeaafricana、紫铆(Buteafrondosa)、Cadabafarinosa、朱缨花属物种(Calliandraspp)、茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒属物种(Capsicumspp,)、决明属物种(Cassiaspp.)、距瓣豆(Centroemapubescens)、木瓜属物种(Chaenomelesspp.)、肉才圭(Cinnamomumcassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、Colophospermummopane、变异小冠花(Coronilliavaria)、枸子(Cotoneasterserotina)、山植属物种(Crataegusspp.)、香瓜属物种(Cucumisspp.)、柏木属物种(Cupressusspp.)、Cyatheadealbata、木梨(Cydoniaoblonga)、圆球杉卩杉(Cryptomeriajaponica)、香茅属物种(Cymbopogonspp.)、Cyntheadealbata、木梨(Cydoniaoblonga)、Dalbergiamonetaria、大叶骨碎补(Davalliadivaricata)、山马虫皇属物种(Desmodiumspp.)、迪卡兰(Dicksoniasquarosa)、Diheteropogonamplectens、Diocleaspp、錄扁豆属物种(Dolichosspp.)、Dorycniumrectum、锥穗稗(Echinochloapyramidalis)、Ehrartiaspp.、糝子(Eleusinecoracana)、Eragrestisspp.、刺4同属物种(Erythrinaspp.)、桉属物种(Eucalyptusspp.)、Eucleaschimperi、金茅(Eulaliavillosa)、荞麦属物种(Fagopyrumspp.)、费约罗(Feijoasellowiana)、草雷属物种(Fragariaspp.)、千斤拔属物种(Flemingiaspp)、Freycinetiabanksii、Geraniumthunbergii、银杏(Ginkgobiloba)、Glycinejavanica、Gliricidiaspp、陆地冲帛(Gossypiumhirsutum)、4艮摔属物种(Grevilleaspp.)、Guibourtiacoleosperma、岩黄芪属物种(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemarthiaaltissima)、扭黄茅(Heteropogoncontortus)、大麦(Hordeumvulgare)、Hyparrheniarufa、小连翅(Hypericumerectum)、Hypertheliadissoluta、白花庭蓝(Indigoincarnata)、秀尾属物种(Irisspp.)、Leptarrhenapyrolifolia、胡枝子属物种(Lespedizaspp.)、莴苣属物种(Lettucaspp.)、Leucaenaleucocephala、Loudetiasimplex、Lotonusbainesii、百糾艮属物种(Lotusspp.)、硬皮豆(Macrotylomaaxillare)、苹果属物种(Malusspp.)、Manihotesculenta、紫苜覆(Medicagosativa)、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、大蕉(Musasapientum)、烟草属物种(Nicotianumspp.)、驴食草属物种(Onobrychisspp.)、Ornithopusspp.、稻属物种(Oryzaspp.)、非洲双翼豆(Peltophorumafricamim)、狼尾草属物种(Pennisetumspp.)、鲟梨(Perseagratissima)、碧冬痴属物种(Petuniaspp.)、菜豆属物种(Phaseolusspp.)、槟榔竹(Phoenixcanariensis)、Phormiumcookianum、石楠属物种(Photiniaspp.)、白云杉(Piceaglauca)、松属物种(Pinusspp.)、豌豆(Pisumsativum)、新西兰罗汉松(Podocarpustotara)、Pogonarthriafleckii、Pogonarthriasquarrosa、杨属物种(Populusspp.)、牧豆树(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pymscommunis)、栎属物种(Quercusspp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美味棒花棕(Rhopalostylissapida)、Rhusnatalensis、欧洲醋粟(Ribesgrossularia)、茶薦子属物种(Ribesspp.)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、蔷薇属物种(Rosaspp.)、悬钩子属物种(Rubusspp.)、杉p属物种(Salixspp.)、Schyzachyriumsanguineum、金松(Sciadopitysverticillata)、j匕美红斥-(Sequoiasempervirens)、巨才i(Sequoiadendrongiganteum)、两色蜀黍(Sorghumbicolor)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、Sporobolusfimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthoshumilis、葫芦茶属物种(Tadehagispp)、落羽杉(Taxodiumdistichum)、阿拉伯黄背草(Themedatriandra)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、小麦属物种(TriticumSPP')、异叶铁杉(Tsugaheterophylla)、越桔属物种(Vaccini腿spp.)、野豌豆属物种(Viciaspp.)、葡萄(Vitisvinifera)、锥穂沃森花(Watsoniapyramidata)、马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zeamays)、苋属植物(amaranth)、洋蓟(artichoke)、天门冬属(asparagus)、椰菜(broccoli)、孢子甘蓝(Brusselssprouts)、甘蓝、芸苔(canola)、胡萝卜、花椰菜、芽菜、羽衣甘蓝(collardgreens)、亚麻、无头甘蓝(kale)、兵豆属(lentil)、油菜籽油菜(oilseedrape)、秋葵(okra)、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜(squash)、茶和藻类，等等。根据本发明优选的实施方案，植物为作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草等等。进一步优选地，植物为单子叶植物。单子叶植物的一个此类的例子是甘蔗。更优选地该植物为谷物。此类谷物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高梁和燕麦。可利用不同的方法鉴定CYCD3多肽。例如，查询蛋白质序列可与翻译的拟南芥核亂亭列数据库进行BLASTed(例如，利用BLAST默认参数进行空位开放罚分和空位扩展罚分)。BLAST结果中的第一个命中者即为拟南芥CYCD3多肽。用于鉴定CYCD3多肽的另一种方法是通过用已知的CYCD3蛋白质序列比对查询序列，利用例如VectorNTI套包(InforMax，Bethesda，MD)中的AlignX程序。然后可利用空位开放罚分10和空位扩展罚分0.01进行多重比对。为了更好地定位一些保守区域，对比对进行较小的手工编辑也是必要的。如果查询序列是CYCD3多肽，其将与已知的CYCD3多肽序列比对。如此处所述的"CYCD3多肽"是指任何多肽序列，当用于构建细胞周期蛋白或细胞周期蛋白D系统树(例如如图1中所述的一种)时，其落入细胞周期蛋白D3-型组中，该组包括CYCD3多肽(且不是其他D-型细胞周期蛋白，例如细胞周期蛋白D1、D2、D4、D5、D6和D7)。本发明方法的实施需要4吏用编码CYCD3多肽的核酸。此处所涉及的编码CYCD3多肽的核酸是如上所述的编码CYCD3多肽的核酸。本领域技术人员可容易地利用制作此类系统树的已知技术和软件，例如GCG、EBI或CLUSTAL软件包，利用默认参数来确定任何所研究的多肽序列是否落入前述的定义中。一旦建立此系统树，D3-型细胞周期蛋白组中的序列聚类将被认为落入"CYCD3多肽"的定义中。编码此类序列的核酸在实施本发明的方法中将是有用的。D3-型细胞周期蛋白通常具有结合和激活植物CDKs和Rb的能力。除了细胞周期蛋白盒和大约前40个氨基酸内的LxCxE基序(其为大多数D-型细胞周期蛋白特征性的)外，D3-型细胞周期蛋白可包含一种或多种且优选地所有通过图2和6中所示的盒所鉴定的保守区域。如图2和6所示，盒内的一个错配是允许的。编码落入前述CYCD3多肽定义的CYCD3多肽的核酸的例子在下文表1中给出。表1中所示的CYCD3编码核酸在实施本发明的方法中是有用的，即通过引入和表达在能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制之下的这些核酸中的任意一种，获得具有与对应的野生型植物相比增加产量的植物。表l的CYCD3-编码核酸的变体在本发明的方法中也是有用的。SEQIDNO:1，SEQIDNO:48或任一种的变体在本发明的方法中是优选使用的。如此处所述的编码CYCD3多肽的核酸的变体通常编码完整蛋白质的基本部分，其可包含除细胞周期蛋白盒和大约前40个M酸内的LxCxE基序(其为大多数D-型细胞周期蛋白特征性的)外，还包含一种或多种且优选地所有通过图2和6中所示的盒所鉴定的保守区域(如图2和6所示，盒内的一个错配是允许的)。表l中显示了如上文所述的CYCD3多肽的例子(由具有NCBI检索号的多核苷,列编码)。SEQIDNO:2、SEQIDNO:49或二者之一的基本部分代表了用于实施本发明的优选的CYCD3多肽序列。CYCD3多肽可为核酸编码的完整蛋白质，或可为所编码蛋白质的部分。优选地，此处所提供的核酸编码组成完整蛋白质的基本部分的CYCD3多肽，所述完整蛋白质除包含细胞周期蛋白盒和大约前40个氨基酸内的LxCxE基序(其为大多数D-型细胞周期蛋白特征性的)夕卜，还包含一种或多种且优选地所有图2和6中所示的盒所鉴定的保守区域(如图2和6所示，盒内的一个错配是允许的)。此部分可以分离的形式使用或可与其他编码(或非编码)序列融合使用以便，例如，产生组合几种活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，通过翻译产生的所获得的多肽可比预计的CYCD3片段更大。表l:编码CYCD3多肽的核酸的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*不含有终止密码子，其产生了更长的转录物，与相应的非修饰序列(SEQIDNO:2)相比，所得的额外部分被认为并不影响整体功能。此处所提供的CYCD3-编码核酸的变体在本发明的方法中也是有用的。此类变体可来自任何天然或人工的来源。核^/基因或其变体可分离自微生物来源，例如酵母或真菌，或来自植物、藻类或动物(包括人)来源。此核酸可通过故意的人工操作从其组成和/或基因环境中的天然形式修饰而来。核酸优选地来自植物来源，无论来自相同的植物物种(例如与其所要引入的植物相同)或来自不同的植物物种。核酸可分离自双子叶物种，优选地来自十字花科(Brassicaceae)，更优选地来自拟南芥。更优选地，SEQIDNO:1或SEDIDNO:48代表了分离自拟南芥的CYCD3-编码核酸，且SEQIDNO:2或SEDIDNO:49代表了CYCD3多肽序列。CYCD3-编码核^/或基因的变体的例子是能够在降低的严格条件，优选地在严格条件下能够与CYCD3-编码核^/基因杂交，所述核^/基因编码这样的多肽，当用于建立细胞周期蛋白或细胞周期蛋白D系统树时，落入包括如SEQIDNO:2或SEQIDNO:49中的CYCD3的细胞周期蛋白D3-型组。优选地，CYCD3-编码核酸/基因的变体是能够与编码CYCD3多肽的核酸杂交的核酸，该多肽除包含细胞周期蛋白盒和大约前40个氨基酸内的LxCxE基序夕卜，还包含一种或多种且优选地所有图2和6中所示的盒所鉴定的保守区域(如图2和6所示，盒内的一个错配是允许的)。优选的是能够与SEQIDNO:1或SEDIDNO:48所代表的核酸杂交的核酸。另外在本发明的方法中有用的是能够与表1中所示的任一CYCD3-编码核酸相杂交的任何核酸。本文定义的术语"杂交"指其中基本同源互补的核酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的核酸都在溶液中。杂交过程也可以在如下情况下进行，即互补核酸之一固定于基质上，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也可以如此进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者如用照相平板印刷固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或微阵列，或称为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交緩冲液组成等条件的影响。在核酸杂交实验如Southern和Northern杂交的情况中，"严格杂交条件"和"严格杂交洗涤条件"依赖于序列，并且在不同的环境参数下不同。熟练的4支术人员知晓可以在杂交和洗涤过程中改变的多种参数，从而保持或者改变严格条件。Tm是在确定的离子强度和pH值下，50%的耙序列与完全匹配的探针杂交的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。在低于Tm值16。C到32。C获得最大杂交率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂合体形成；当钠浓度高达0.4M时，这一作用明显。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7^，加入50。/。甲酰胺能够使杂交在30到45。C完成，尽管这将降低杂交率。碱基对错配降低杂交率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使L值下降约1'C。Tm值可以用依赖于杂合体类型的下列方程式计算1、DNA-DNA杂合体(Mdnkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138:267-284，1984):Tm=81.5°C+16.6xlog[Na+]a+0.41x%[G/Cb-500x[LT1-0.61x%甲酰胺2、DNA-RNA或RNA-RNA杂合体Tm=79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2國820/Lc3、寡DNA或寡RNAd杂合体<20个核苷酸Tm=2(ln)20曙35个核苷酸Tm=22+1.46(ln)a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内精确。b仅对于在30%到75%范围内的y。GC精确。c1^双链体的碱基对长度。d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效长度-2x(G/C数)+(A/T数)。注释对于每1%甲酰胺，TJ1降低约0.6到0.7。C,而6M尿素的存在可使Tm值降低约30'C。杂交特异性通常是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性条件下进行。一般地，如上设置适用于核酸杂交测定或基因扩增检测操作的严格条件。也可以选择更高或更低的严格性条件。通常，对于在确定的离子强度和pH值下的特定序列，选择比热解链温度(TJ低50'C的低严格条件。中等严格条件温度比TJ氐20'C，而高严格条件温度比Tm低10X:。例如，严格条件是至少像如条件A-L—样严格；降低的严格条件是至少像如条件M-R—样严格。可以通过许多已知技术中的任一来控制非特异性结合，所述技术诸如，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交緩冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。在下表2中列出杂交和洗涤条件的实例，表2:杂交和洗涤条件的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*"杂合体长度"是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过比对序列及鉴别本文所述的保守区域来确定杂合体长度。t在杂交和洗涤緩冲液中，可以用SSPE(1xSSPE是0.15MNaCl，10mMNaH2P04和1.25mMEDTA，pH7.4)代替SSC(1xSSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后洗涤15分钟。杂交和洗涤可以另外地包括5xDenhardt's试剂、0.5-1.0%SDS、100照/ml变性片段化的鲑精DNA、0.5%焦磷酸钠和高达50%的甲酰胺。*Tb-Tr:对于预期长度小于50个碱基对的杂合体，杂交温度应该比杂合体的解链温度TVf氐5-10'C;根据上述方程式确定Tm。*本发明还包括以PNA或修饰的核酸代替任一或多个DNA或RNA杂交配偶体。为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等(2001)的《分子克隆实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)。编码CYCD3多肽的"同源物"的核酸也可用于本发明中。"同源物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸替代、缺失和/或插入，并且具有与其衍生自的未修饰形式蛋白质相似的生物活性和功能活性。为了产生这样的同源物，蛋白质的氨基酸由具有相似性质(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破ot螺旋结构或P片层结构的倾向)的其它氨基酸所替换。保守替代表是本领域内众所周知的(例如见Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany和下表3)。术语"同源物"还包含两种特殊形式的同源，其包括直系同源序列和旁系同源序列，其中包含用于描述基因的祖先关系的进化概念。术语"旁系同源"涉及在一个物种的基因组内部导致旁系同源基因的基因-副本。术语"直系同源"涉及由于物种形成导致的不同生物中的同源基因。上文中表1中给出了CYCD3多肽同源物的例子。例如，可以通过所谓的交互(reciprocal)blast搜索容易地找到例如在单子叶植物种中的直系同源物。这可以通过使用查询序列(例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:48或SEQIDNO:49)针对任何序列数据库，如可在http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov找到的公共可获得的NCBI数据库，进行一次blast而实现。当从核苷,列开始时，可使用BLASTN或tBLASTX，而当从蛋白质开始时，可使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。Blast结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列源自的相同生物体的序列进行反向blast(二次blast)。然后比较第一次和第二次blast的结果。如果二次blast中得分靠前的命中事件来自查询序列源自的相同物种，则找到了旁系同源物；如果二次blast中得分靠前的命中事件不是来自查询序列源自的相同物种，则找到了直系同源物。得分靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，得分越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中事件的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。在大家族的情况下可以使用ClustalW,继之以邻近连接树来辅助相关基因的聚类可视化，以鉴定直系同源物和旁系同源物。有用的。根据本发明，提供了用于增加植物产量的方法，其包括将编码SEQIDNO:2或SEQIDNO:49所代表的CYCD3多肽的直系同源物或旁系同源物的核酸引入植物，该核酸处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下。同源物可以是蛋白质"替代变体，，的形式，即在氨基^列中至少有一个残基被除去，并在这一位置插入不同的残基。氨基酸替代通常是单个残基的替代，但是视施加于多肽的功能性限制而定也可能是成簇替代；插入通常在1到10个氨基酸残基的数量级。优选地，氨基酸替代包括保守的氨基酸替代。本领域可以容易地获得保守替代表。下表3给出了保守氨基酸替代的实例。表3:保守氨基酸替代的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>lieLeu;Val同源物也可以是蛋白质的"插入变体，，的形式，即在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合，以及单个或多个氨基酸的内部序列插入。一般，多肽序列内部的插入将小于氨基或氛基端的融合，数量级在约1到10个残基。氨基或羧基端融合蛋白质或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白质、(组氨酸)6标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag'100表位、c-myc表位、FLAG⑧表位、lacZ、CMP(4丐调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。蛋白质"缺失变体"形式的同源物特征在于从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。可通过本领域众所周知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作容易地得到蛋白质的多肽变体。用于操纵DNA序列以产生蛋白质的替代、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，本领域技术人员熟知在DNA预定位置产生替代突变的技术，其包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland,OH)、QuickChange位点定向诱变(Stratagene，SanDiego,CA)、PCR介导的位点定向资变或其它位点定向请变方法。CYCD3多肽可为衍生物。蛋白质的"衍生物"包含肽、寡肽、多肽，其包含与多肽的天然存在形式的M酸序列相比而言，天然发生改变(糖基化、酰基化、泛素化、异戊烯化、磷酸化、豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然改变的氨基酸残基。衍生物还可包含与其所来源的氨基酸序列相比，一个或多个氨基酸替代或添加，例如报告分子或其他配体，其共价或非共价地结合到M酸序列上，例如结合以帮助其检测的报告分子，和相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列而言的非天然存在的氨基酸残基。CYCD3多肽可由CYCD3编码核^/基因的可变剪接变体编码。如此处所用的术语"可变剪接变体"包含核酸序列的变体，其中已将所选择的内含子和/或外显子切除、维持、替换或增加，或者已将其中的内含子缩短或加长。此类变体将是保持蛋白质的生物学活性的变体，其可通过选择性地保留蛋白质的功能片段来获得。此类剪接变体可在自然中找到或可人造。用于制备此类剪接变体的方法是本领域中公知的。根据本发明，提供了用于增加植物产量的方法，包括将编码CYCD3多肽的核酸剪接变体引入植物，所述变体处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制之下。优选的剪接变体是编码多肽的核酸剪接变体，其当用于建立细胞周期蛋白和细胞周期蛋白D系统树时，落入D3-型组，该组包括SEQIDNO:2或SEQIDNO:49所代表的CYCD3。此类剪接变体可为上面表1所述的任何一种核酸的剪接变体。SEQIDNO:1或SEQIDNO:48的剪接变体用于本发明的方法是特别优选的。CYCD3多肽还可由CYCD3编码核^/基因的等位基因变体来编码。等位基因变体天然存在，本发明方法还包括这些天然等位基因的用途。等INDELs的大小通常小于100bp。SNPs和INDELs形成了大多数生物天然发生的多态性林系中序列变体中最大的部分。根据本发明，提供了用于增加植物产量的方法，包括将编码CYCD3多肽的核酸的等位基因变体引入植物，使其处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下。优选的等位基因变体是编码多肽的核酸的等位基因变体，其当用于建立细胞周期蛋白和细胞周期蛋白D系统树时落入D3-型组，该组包括如SEQIDNO:2或SEQIDNO:49中的CYCD3。此类等位基因变体可为上面表1所述的任何一种核酸的等位基因变体。SEQIDNO:1或SEQIDNO:48的等位变体用于本发明的方法是特别优选的。位点定向诱变和定向进化是能够产生新CYCD3变体的技术的例子。几种方法可用来实现位点定向诱变，最普遍的是基于PCR的方法(分子生物学的通用方案。WileyEds.http:〃www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。定向进化，也称为基因改组，也可用于产生CYCD3编码核酸的变体。其组成为重复进行DNA改组，随后是合适的筛选和/或选择从而产生CYCD3编码核酸或其编码CYCD3多肽部分或其具有修饰的生物学活性部分的部分(Castle等人，(2004)Science304(5674):1151-4;美国专利5,811,238和6,395,547)。因此，引入植物的核酸可为一种通过位点定向诱变或定向进化的技术或其它用于产生此类变体序列的已知方法所获得的核酸。所要引入植物的核酸可为全长核酸或可为如上文所定义的变体序列。根据本发明的优选方面，设想CYCD3-编码核酸的增加的表达。增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的记录，其包括，例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式多核苷酸的适当位置(一般是上游)，从而上调CYCD3编码核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或替代，体内地改变内源启动子(见Kmiec，美国专利号5,565,350;Zarling等，PCT/US93/03868)，或者将分离的启动子在本发明基因的适当方向和距离引入植物细胞中，从而控制基因的表达。降低基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的记录。如果期望多肽表达，通常优选在多肽编码区域的3，末端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。例如，待加入的3，末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或备选地源自其他植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。也可以在5，非翻译区或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的数量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入的可剪接内含子均可以在mRNA和蛋白质水平增加高达1000倍的基因表达，Buchman和Berg，Mol.Cellbiol.8:4395-4405(1988);Callis等，GenesDev.1:1183-1200(1987)。通常这类内含子^U文置在转录单位5，末端附近时，其增强基因表达的作用达到最大。玉米内含子Adhl-S内含子l、2和6，Bronze-l内含子的使用是本领域公知的。通常见TheMaizeHandbook,第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer,N.Y.(1994)。本发明还提供遗传构建体和载体，以促进用于本发明方法中的核苷酸序列的引入和/或表达。因此，提供了基因构建体，其包含(i)编码CYCD3多肽的核酸；(ii)一种或多种控制序列，其能够优选地驱动(i)的核酸序列在种子胚乳中表达；和任选地(iii)转录终止序列。编码CYCD3多肽的核酸可为任何如上文所述的编码CYCD3多肽的核酸。特别优选的是如表1所述的核酸，特别是SEQIDNO:1或SEQIDNO:48所代表的核酸。另外优选的是表l中所述核酸的核酸变体，此类变体如上所述。可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建用于本发明方法的构建体。可以将基因构建体插入可商购的、适合于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的基因的载体中。本发明因此提供了如上文所述的基因构建体在本发明方法中的用途。用包含目的序列(即，编码CYCD3多肽的核酸)的载体转化植物。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接至能够优先驱动核酸在种子胚乳中表达的启动子)。术语"调控元件"、"控制序列"和"启动子"在本文中都可交换的使用，从广义上是指能够影响与i^目连的序列表达的调控核酸序列。上述术语包括源自典型真核生物基因组基因的转录调控序列(包括具有或没有CCAAT盒序列的TATA盒，其对于精确的转录起始是必需的)，以及另外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，其通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。该术语还包括了经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语"调控元件"也包含合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸分子的表达。本文所用的术语"有效连接"指在启动子序列和目的基因之间的功能性连接，以使启动子序列能起始目的基因的转录。能够优先在种子胚乳中表达核酸的启动子是胚乳特异性启动子。胚乳特异性启动子指的是任何能够优先驱动目的基因在胚乳中表达的启动子。此处对优先增加种子胚乳中的表达的引用是指在胚乳中增加的表达基本上排除了植物中其它地方的表达，除了由于遗漏启动子导致的任何残留表达之外。例如，醇溶谷蛋白启动子显示胚乳中的强表达，带有分生组织中的遗漏，更特异地芽分生组织和/或分生组织中的辨别中心。优选地，胚乳特异性启动子是种子贮藏蛋白质启动子，更优选地分离自谷醇溶蛋白基因的启动子，例如SEQIDNO:3所代表的稻谷醇溶蛋白RP6(Wen等人，(1993)PlantPhysiol101(3):1115-6)启动子或相似长度的启动子和/或与稻谷醇溶蛋白启动子具有相似表达才莫式的启动子。相似长度和/或相似表达模式可通过例如将启动子连接至报告基因并检测植物组织中的报告基因功能来进行分析。一种众所周知的报告基因是P-葡糖醛酸糖苷酶并用比色GUS染料显示植物组织中的p-葡糖醛酸糖苷酶活性。应当清楚本发明的应用并不局限于由SEQIDNO:1或SEQIDNO:48所代表的核酸，本发明的应用也不局限于编码CYCD3多肽的核酸在受谷醇溶蛋白启动子驱动时的表达。可用于实施本发明方法的其它胚乳特异性启动子的例子显示于下面的表4中。表4:用于本发明的胚乳特异性启动子的例<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>任选的，还可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语"终止子"包括控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，传递信号引发初级转录本的3，加工和多聚腺苷酸化以及转录的终止。另外的调控元件可以包括转录和翻译的增强子。本领域技术人员将知道适合用于进行本发明的终止子和增强子的序列。这类序列为本领域技术人员所公知或者可以容易地获得。本发明的遗传构建体还包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为附加型遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于fl-ori和colEl。遗传构建体可以任选地包括可选择的标记基因。如本文所用，术语"可选择的标记基因"包括赋予细胞表型的任意基因，该基因在细胞中表达，有利于鉴定和/或选择经本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。适当的标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许可视选择。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptn,或磷酸化潮霉素的hpt)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar;或提供草甘膦抗性的aroA或gox)、或者提供代谢性状的基因(例如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA)。可视标记基因导致形成颜色(例如P-葡糖趁酸糖苦酶，GUS)、发光(例如焚光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。本发明还包含根据本发明的方法可获得的植物(及其部分)。本发明因此提供了根据本发明的方法可获得的植物，该植物已经引入和在其中表达了CYCD3-编码核酸，其处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下。本发明还提供了用于生产具有增加的产量的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达CYCD3编码核酸，其处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下。更特别地，本发明提供了用于生产具有增加产量的转基因植物的方法，该方法包括(i)在植物或植物细胞中引入和表达编码CYCD3多肽的核酸，该核酸处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下。(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。产量的增加如上文定义。可以将核酸直接《j入植物细胞或植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其它部分)。才艮据本发明的优选方面，通过转化优选将核酸引入植物。本文所指术语"转化"包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。通过器官发生或者胚胎发生的能够随即克隆增殖的植物组织都可以使用本发明的遗传构建体转化并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可提供和最适于转化的具体物种的克隆增殖系统而改变。示例性的靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及i秀导的分生组织(例如子叶分生^L织和胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒保持非整合的状态。备选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着用于以本领域技术人员熟知的方式再生为转化的植物。植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用几种转化方法的任一向适当的祖先细胞引入目的基因。转化方法包括用脂质体、电穿孔、增强游离DNA摄取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和显微投影(micr叩rojection)。方法可以选自用于原生质体的钩/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，(1882)Nature296，72-74;NegrutiuI.等，(1987)PlantMol.Biol.8:363-373);原生质体的电穿孔法(ShillitoR.D.等，1985Bio/Technol3，1099-1102);植物材料的显微注射(CrosswayA.等，(1986)Mol.GenGenet202:179-185);DNA或RNA包被的粒子轰击(KleinT.M.等，(I987)Nature327:70);(非整合的)病毒感染，等等。优选使用任何转稻转化的熟知方法，通过农杆菌介导的转化，产生表达CYCD3编码核酸/基因的转基因稻类植物，例如在任何以下任一文献中描述的方法乂/^开的欧洲专利申请EP1198985Al，Aldemita和Hodges(Planta，199:612-617，1996);Chan等(PlantMol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hid等(PlantJ.6(2):271-282，1994)，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入本文作为参考。至于谷物转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6):745-50，1996)或Frame等(PlantPhysiol.129(1):13-22，2002)中所述，其/>开的内容如同其陈述的全部内容那样并入本文作为参考。通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之将转化的材料再生成整个植物。DNA转移和再生之后，可评估推定转化的植物，例如用Southern分析评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选的或额外的，可用Northern和/或Western分析监测新引入基因的表达水平，两种技术都是本领域内普通技术人员所熟知的。产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如用克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交得到纯合的第二代(或T2)转化体，T2植物进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如经过转化包含表达盒的所有细胞)；转化和非转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的根茎嫁接到非转化的接穗上)。本发明显然延及由本文所述方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分和其无性繁殖体。本发明还涵盖由任意上述方法产生的初级转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，所述后代的唯一要求是与本发明方法产生的亲本呈现同样的基因型和/或表型特性。本发明也包括含有分离的CYCD3编码核酸的宿主细胞。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明也延及植物可收获的部分，例如，但不限于种子、叶、果实、花、茎培养物、根茎、块茎和球茎。本发明还涉及由这样的植物的可收获部分直接衍生的产品，如干丸或干粉、油类、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还包含CYCD3编码核酸的用途和CYCD3多肽的用途。一种此类用途涉及增加的产量、特别是种子产量。种子产量如上文中所定义并优选地包括下列中的一种或多种每圆锥花序增加的花的数量、增加的总的种子产量、增加的TK，W和增加的收获指数，每项均相对于相应的野生型植物而言。CYCD3编码核酸或其变体、或CYCD3多肽可在育种程序中发现用途，该程序中通常遗传连接至CYCD3编码基因或其变体的DNA标记得以鉴定。CYCD3-编码核^/基因或其变体、或CYCD3多肽可用于定义分子标记。然后可将此DNA或蛋白质标记用于育种程序中来筛选具有增高产量的植物。CYCD3编码基因或其变体可，例如，为由SEQIDNO:1或SEQIDNO:48所代表的核酸。CYCD3编码核^/基因的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。这类育种程序有时需要使用，例如EMS诱变，通过植物诱变处理引入等位基因变体；备选的，此程序可以以收集无意产生的所谓"天然"起源的等位基因变体开始。然后通过例如PCR鉴定等位基因变体。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，所述等位基因变体赋予植物增加的产量。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位基因变体的植物的生长性能来进行选择，例如SEQIDNO:1或SEQIDNO:48的不同等位基因变体。生长性能的监测可在温室或田间进行。进一步任选的步骤包括将其中鉴定了较好的等位基因变体的植物与另一植物杂交。这可用于例如组合感兴趣的表型特征。CYCD3-编码核酸或其变体还可以作为探针，用于对为那些基因连锁性状的一部分并作为其标志物的基因进行遗传和物理的作图。这样的信息可以在植物育种中使用，以得到具有所期望表型的品系。CYCD3-编码核酸或其变体的这类应用仅需要长至少15个核苷酸的核酸序列。CYCD3-编码核酸或其变体可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用CYCD3-编码核酸或其变体探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(SambrookJ，FritschEF和ManiatisT(1989)《分子克隆实验室手册》)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1:174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此夕卜，可以使用核酸在含有一组个体的限制性内切酶处理的基因组DNA中探测Southern印迹，所述一组个体为代表明确的遗传杂交的亲本和子代的一组个体。记录DNA多态性的分离并用于计算在先前用此群体获得的遗传图镨中CYCD3-编码核酸或其变体的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum-Genet.32:314-331)。在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.Reporter4:37-41中。众多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系(NIL)和其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员众所周知的。核酸探针也可以用于物理作图(即在物理图镨上安置序列；见Hohdsel等In:Non-mammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996,第319-346页，及其中引用的参考文献)。在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向用于大的克隆(几个kb到几百个kb;见Laan等(1995)GenomeRes.5:13-20),但是灵敏性的提高允许在FISH作图中应用较短的探针。用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS;Sheffield等(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science241:1077-1080)、核普酸延伸反应(Sokolov(19卯)NucleicAcidRes.18:3671)、方文射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。本发明的方法中通过向植物中引入编码CYCD3多肽的核酸，使其处于能优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下，获得了产量增加。然而，此类产量增加也可通过其它众所周知的技术例如T-DNA激活、TILLING和同源重组来获得。T-DNA激活标记(Hayashi等人Science(1992)1350-1353)涉及将通常含有启动子(也可为翻译增强子或内含子)的T-DNA插入到目的基因的基因组区域或基因编码区域的10kb上游或下游，其以这样的构型存在，使得启动子指导靶基因的表达。一般，乾基因通过其天然启动子的表达调节被破坏，而基因落入新引入的启动子的控制下。启动子通常包含在T-DNA中。此T-DNA随机插入到植物基因组中，例如，通过农杆菌感染并导致所插入的T-DNA附近的基因过表达。由于所引入启动子附n因的过表达，所获得的转基因植物显示出显性表型。引入的启动子可为能够优先驱动在种子胚乳中表达的任何启动子。TILLING(TargetedInducedLocalLesionsInGenomes)4支术也可用于重现进行本发明方法的效果。TILLING是诱变技术，用于产生和/或鉴定，并最终分离具有<多饰的表达和/或活性的CYCD3-编码核酸。TILLING还允许选择带有此类突变变体的植物。这些突变变体可在强度上或位置上或在时间选择中(例如如果突变影响启动子)显示出修饰的表达。TILLNG结合了高密度诱变和高通量筛选方法。在TILLING中通常跟随的步骤有(a)EMS诱变(RedeiGP和KonczC(1992)InMethodsinArabidopsisResearch,KonczC，ChuaNH，SchellJ，eds.Singapore,WorldScientificPublishingCo,pp.16-82;Feldmann等人，(1994)InMeyerowitzEM,SomervilleCR，eds，Arabidopsis.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，pp137-172;LightnerJandCasparT(1998)InJMartinez-Zapater，JSalinas,eds，MethodsonMolecularBiology,Vol.82.HumanaPress,Totowa，NJ，pp91-104);(b)DNA制备和个体的合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以允许异源双链体的形成；(e)DHPLC，其中库中异源双链体的存在被检测为色镨图中的额外峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。用于TILLING的方法是本领域中所公知的(McCallum等人，(2000)NatBiotechnol18:455-457;由Stemple(2004)NatRevGenet5(2):145-50综述)。携带此类突变变体的植物优先在胚乳中增加CYCD3编码基因的表达。T-DNA激活和TILLING是能够产生遗传4务饰(优选在编码CYCD3多肽的基因的基因座中)的技术的例子，其产生了编码CYCD3多肽的核酸在植物胚乳中的优先增加的表达。此处将基因的基因座定义为基因组区域，其包括目的基因和编码区域的10kb上游或下游。同源重组允许在基因组的限定选择的位置上引入所选核酸。同源重组是生物科学中用于低等生物例如酵母或莒藓剑叶藓(Physcomitrella)的常规使用的标准技术。植物中进行同源重组的方法已有所描述，不仅对于模式植物(Offringa等人(19卯)EMBOJ9(10):3077-84)，而且对于作物植物，例如稻(Terada等人(2002)NatBiotech20(10):1030-4;Iida和Terada(2004)CurrOpinBiotech15(2):132-8)进行了描述。将核酸(其可为如上文所述的CYCD3-编码核酸或其变体)靶向CYCD3基因的基因座。待乾向的入。靶向的核酸优选地为控制植物中编码CYCD3多肽的核酸的天然表达的区域。将胚乳特异性启动子引入此区域，在此之外，或部分或基本全部替代它。如前所述，才艮据本发明的所有方法均获得具有增加产量的植物。这些有用的性状也可与其它经济上有利的性状相组合，例如进一步产量提高的性状、对多种胁迫的耐受、修饰多种结构特征和/或生物化学和/或生理学特征的性状。附图描述现在将参考下列图对本发明进行描述，其中图1是利用ClustalW和默认值所进行的多重多肽比对，然后是平均距离树计算。显示了CYCD3多肽聚类。图2是已知才直物CYCD蛋白质序列的比对。利用VectorNTI套包(InforMax，Bethesda，MD)中的AlignX程序对这些序列进行了比对。多重比对利用空位开放罚分10和空位扩展罚分0.01来进行。为了更好地定位一些保守区域，还对比对进行了较小的手工编辑。显示的行指出CYCD3多肽从其它D-型细胞周期蛋白的分离。对多个CYCD3多肽特异性的基序加框。图3是利用MatGAT(MatrixGlobalAlignmentTool)产生的相似性/同一性矩阵，其在给定的数据组中在不需数据预比对的情况下计算了每对多肽序列之间的相似性和同一性。该程序利用Myers和Miller总体比对算法(空位开放罚分为12，空位扩展罚分为2)进行了一系列逐对比对。然后其利用例如Blosum60作为得分矩阵计算相似性和同一性，然后将结果》文入距离矩阵中。序列相似性显示于分界线的下半部分，而序列同一性显示于分界线的上半部分。SEQIDNO:2的序列在矩阵中显示为5号。与SEQIDNO:2的序列具有至少30%序列同一性的多肽序列包含CYCD3多肽。图4是用于在稻中表达处于谷醇溶蛋白启动子的控制下的拟南芥CYCD3;3基因的双元载体。图5详细描述了用于实施才艮据本发明的方法的序列的例子。图6是仅植物CYCD3蛋白质序列的比对。利用VectorNTI套包(InforMax，Bethesda,MD)中的AlignX程序对所述序列进行了比对。多重比对利用空位开》文罚分10和空位扩展罚分0.01来进行。为了更好地定位一些保守区域，还对比对进行了小的手工编辑。除了细胞周期蛋白盒(在共有序列下标记为"X"(Interproref:IPR006670))和大约前40个氨基酸内的LxCxE基序外，还鉴定了多个CYCD3多肽特异的基序。实施例现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明。DNA操作除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克隆实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)或者Ausubel等(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols笫一巻和第二巻的标准方法执行。植物分子操作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于PlantMolecularBiologyLabfase(1993),由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)出版。实施例l:基因克隆使用拟南芥幼苗cDNA文库(Invitrogen,Paisley,UK)作为模板通过PCR扩增拟南齐CycD3;3基因。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进入pCMVSport6.0。该库平均插入片段大小为1.5kb,并且原始克隆数为1.59xl07cfu。在6xl011cfu/ml的第一次扩增之后，确定原始滴度为9.6xl()5cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板用于50plPCR混合物中。PCR扩增所用的引物包括Gateway重组的AttB位点，为引物prm0360(正义，起始密码子为粗体，AttBl位置为斜体5，GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTTTAGAAGAGGAGGA3，)和prm0361(反义，互补的，终止密码子为粗体，AttB2位置为斜体5，GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGAGGACTACTACTAAGCA3，)。在标准条件下使用HifiTaqDNA聚合酶进行PCR。同样用标准方法扩增和纯化1086bp的PCR片段。接着进行Gateway操作的第一步，BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生Gateway术语所称的"进入(entry)克隆"，p0443。作为Gateway⑧技术一部分的质粒pDONR201购自Invitrogen。对于SEQIDNO:48/49的修饰序列，反义引物为5，GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGAGGACTACTATAAGCA3，。实施例2:载体构建随后将进入克隆p0443用于与p0830的LR反应中，p0830为用于稻转化的终点载体。此载体含有在T-DNA边界内作为功能元件的植物选择标记、植物筛选标记、和用于与已克隆入进入克隆的目的序列进行LR体内重组的Gateway盒。将用于胚乳特异性表达的谷醇溶蛋白启动子(PROOO卯；SEQIDNO:3)定位于此Gateway盒的上游。在LR重组步骤后，将所获得的表达载体(见图4)转化入农杆菌菌抹LBA4404并随后转入稻植物。将如图4中所示的，所获得的表达载体转化入农杆菌并随后转化入稻植物中。让转化的稻植物生长并随后对其检查如实施例3中所述参数。实施例3:评估和结果大约产生了15到20个独立的TO稻类转化体。初级转化体由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。6个事件得以保留，其中T1代发生转基因存在/缺乏的3:l分离。通过监测可视标记的表达，在每一事件中选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的Tl幼苗，和大约IO个缺少转基因(无效合子)的Tl幼苗。将转基因植物和相应的无效合子并排栽培在随机的位置。从播种期直到成熟期，将植物穿过数字成像室几次。每次从至少6个不同的角度对每抹植物采集点数字图像(2048xl536象素，1600万色彩)。对5个Tl事件在T2代进一步评估，接着是与Tl相同但是每个事件使用更多个体的评估步骤。统计分析t检验和F检验使用双因子ANOVA(方差分析)作为植物表型特性整体评估的统计模型。在由本发明基因转化的所有事件的所有植物中，对所有测量参数进行F检验。进行F检验来检查所有转化事件中基因的效应，并验证基因的整体效应，亦称为整体基因效应。真实的整体基因效应显著性的阈值设定为F检验的5%概率水平。显著性F检验值证明基因效应，其意味着不仅仅^因的存在或位置引起表型的差异。为检测基因在事件内的效果，即品系特异性效果，在每个事件内利用来自转基因植物和相应的无效植物的数据集进行t检验。"无效植物"或"无效分离子"或"无效合子"是以与转基因植物同样的方式处理的植物，但是转基因已分离。也可将无效植物描述为纯合的阴性转化植物。将t检验的显著性阈值设置为10%概率水平。一些事件的结果可超出或低于此阈值。这是基于这样的假设，即基因仅可在基因组的某些位置有效，且这种位置依赖性效果的发生是普遍的。这种基因效果在此也叫作"基因的品系效果"。通过将t值与t分布相比较或备选地通过将F值与F分布相比较来获得p值。于是p值给出了无效假设(即无转基因效果)为正确的概率。3.1种子相关参数的测定收获成熟的原代圆锥花序(primarypanicle),装袋、标记条形码、然后在37。C的烘箱中干燥三天。然后将圆锥花序脱粒并收集和计数所有种子。利用空气鼓风装置将饱满的壳从空壳中分离出来。弃去空壳并再次计数剩余的部分。在分析天平上称量饱满的壳。此方法获得了一组如下所述的种子相关参数。3.1.1每个圆锥花序的花的总数如本发明中所述的每个圆锥花序花的总数是种子总数和成熟原代圆锥花序数目的比值。在T2中两个显著性转基因事件与其相应的无效合子之间的百分比差异显示于表5中。还显示了T2评估中的显著性事件的P值。显著性P值表明转基因的存在涉及每个圆锥花序花的总数的增高。表5:每个圆锥花序花的总数<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>3.1.2总的种子产量通过称重所有收获自植物的饱满壳来测定总的种子产量。T2中三个显著性转基因事件与其相应的无效合子之间的百分比差异显示于表6中。T2评估中的显著性事件的P值也有所显示。显著性P值表明转基因的存在涉及总的种子产量的提高。表6:总的种子产量<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>3.1.3TKW本发明中的TKW是由计数的饱满种子的数目和其总重量推断而来的。T2中三个显著性转基因事件与其相应的无效合子之间的百分比差异显示于表7中。还显示了T2评估中的显著性事件的P值。显著性P值表明转基因的存在涉及TKW的提高。表7:TKW<table>complextableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>3.1.4植物的收获指数本发明的收获指数定义为总的种子产量与地上面积(mm2)的比值，乘以因子106。T2中三个显著性转基因事件与其相应的无效合子之间的百分比差异显示于表8中。还显示了T2评估中的显著性事件的P值。显著性P值表明转基因的存在涉及收获指数的提高。表8:收获指数<table>complextableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>实施例4:比较数据pOleosin::细胞周期蛋白D3;3产生含有上述构建体的植物并利用如上所述的同样方法评估pOleosin::细胞周期蛋白D3;3。Tl评估的结果显示于下表9至11中。转基因植物及其相应的无效合子的百分比差异显示于每个表中。还显示了F检验的p值。表9:地上面积<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>权利要求1.用于与相应的野生型植物相比增加植物产量的方法，其包括增加编码细胞周期蛋白D3(CYCD3)多肽的核酸在植物中的表达，并任选地选择具有增加的产量的植物，其中所述核酸处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下。2.根据权利要求l的方法，其中所述在种子胚乳中的增加的表达是通过优选在编码CYCD3多肽的基因的基因座中引入遗传修饰来实现的。3.根据权利要求2的方法，其中所述遗传修饰是通过下列之一来实现的T-DNA激活、TILLING、位点定向i秀变或定向进化。4.用于与相应的野生型植物相比增加;fet物产量的方法，其包括在植物中引入并表达编码CYCD3多肽的核酸，所述核酸处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下。5.根据权利要求4的方法，其中所述核酸编码CYCD3多肽的一部分或能够与CYCD3编码核酸杂交。6.才艮据权利要求4的方法，其中所述核酸编码SEQIDNO:2的CYCD3蛋白质的直系同源物或旁系同源物。7.才艮据权利要求4或6中任意一项的方法，其中所述CYCD3编码核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自十字花科，更优选地该核酸来自拟南芥。8.根据权利要求4至7中任意一项的方法，其中所述CYCD3编码核酸有效连接到胚乳特异性启动子。9.根据权利要求8的方法，其中所述的胚乳特异性启动子是谷醇溶蛋白启动子。10.根据权利要求1至9中任意一项的方法，其中所述增加的产量是增加的种子产量。11.根据权利要求1至10中任意一项的方法，其中所述增加的产量选自每个圆锥花序增加的花的数量、增加的总的种子产量、增加的TKW和增加的收获指数。12.通过根据权利要求1至11中任意一项的方法可以获得的植物。13.构建体，其包含(i)编码CYCD3多肽的核酸；(ii)一种或多种控制序列，其能够优先驱动(i)的核酸序列在种子的胚乳中表达；和任选地(iii)转录终止序列。14.根据权利要求13的构建体，其中所述控制序列是胚乳特异性启动子。15.根据权利要求14的构建体，其中所述胚乳特异性启动子是谷醇溶蛋白启动子。16.才艮据权利要求15的构建体，其中所述的谷醇溶蛋白启动子如SEQID戮3表示。17.用根据4又利要求13至16中任意一项的构建体转化的植物。18.用于产生具有增加的产量的转基因植物的方法，该方法包括(i)将编码CYCD3多肽的核酸引入植物或植物细胞中并在植物或植物细胞中表达，所述核酸处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下；和(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。19.具有增加的产量的转基因植物，其由编码CYCD3多肽的核酸引入所述植物并在所述植物中表达获得，所迷核酸处于能够优先在种子的胚乳中表达该核酸的启动子控制之下。20.根据权利要求12、17或19的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物，例如甘蔗，或者其中所述植物为谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高梁。21.才艮据4又利要求12、17、19或20中任意一项的植物的可收获部分。22.根据权利要求21中任意一项的植物的可收获部分，其中所述可收获部分为种子。23.直接来自根据权利要求22的植物和/或来自根据权利要求21或22的植物的可收获部分的产品。24.根据权利要求13的构建体在与相应的野生型植物相比增加产量、特别是种子产量上的用途。25.根据权利要求24的用途，其中所述种子产量选自每个圆锥花序增加的花的数量、增加的总的种子产量、增加的TKW和增加的收获指数。全文摘要本发明涉及用于与相应的野生型植物相比增加植物产量的方法。更优选地，本发明涉及用于增加植物产量的方法，其包括将编码细胞周期蛋白D3(CYCD3)多肽的核酸引入植物，所述核酸处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下。本发明还涉及包含分离的编码CYCD3多肽的核酸的植物，所述核酸处于能够优先在种子胚乳中表达该核酸的启动子控制下，所述植物具有与相应的野生型植物相比增加的产量。本发明还提供了可用于本发明方法的构建体。文档编号C12N15/82GK101180398SQ200680018121公开日2008年5月14日申请日期2006年3月24日优先权日2005年3月25日发明者V·弗兰卡德,V·米隆诺弗申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司