具有增加产量的植物及其生产方法

专利名称：具有增加产量的植物及其生产方法
技术领域：
本发明总的涉及分子生物学领域，并关注用于增加植物产量的方法。更特别地，本发明涉及通过将细胞周期蛋白A的核酸，优选地编码细胞周期蛋白A蛋白的核酸导入植物来增加植物产量的方法，所述核酸有效地连接了种子偏爱的启动子。本发明也涉及在植物种子组织中具有增加的细胞周期蛋白A核酸表达和/或在植物种子组织中具有细胞周期蛋白A蛋白的经调节的活性和/或水平的植物，该植物和相应的野生型植物相比以及和相应的其中组成型表达细胞周期蛋白A的转基因植物相比，具有增加的产量。
不断增加的世界人口和农业上可供利用的可耕作土地的供给不断下降刺激了旨在提高农业效率的农业研究。常规的作物和园艺改进方法使用选择育种技术来鉴定具有理想特性的植物。然而，这样的选择育种技术具有几个缺点，即这些技术通常非常费力并且产生通常含有异源遗传成分的植物，该异源遗传成分并非总能引起可从亲本植株传递的理想性状。分子生物学上的进步已使人类能够修饰动物和植物的种质。植物的基因工程使得能够进行遗传物质(通常以DNA或RNA的形式)的分离和操作，以及随后将该遗传物质导入植物。这样的技术能够产生具有各种改善的经济、农艺或园艺性状的作物或植物。尤其具有经济价值的性状是产量。产量通常定义为来自作物的可测量的产物经济值。这可以数量和/或质量表示。产量直接依赖于几个因素，例如器官的数量和大小、植物的结构(例如，分枝的数目)、种子的产量等。根的发育、营养的吸收和压力耐受性在确定产量上也是重量的因素。可通过优化上述因素中的一种来增加作物产量，这种优化可通过修饰植物的内在生长机制来实现。
植物的内在生长机制存在于统称为“细胞周期”的高度有序的事件序列中。通过细胞周期的推进是所有多细胞生物的生长和发育所必需的，对细胞的增殖是至关重要的。细胞周期的主要组成成分在酵母、哺乳动物和植物中是高度保守的。通常将细胞周期分为下列按顺序发生的时期G0-G1-S-G2-M。DNA复制或合成通常发生在S期(“S”表示DNA合成)，而染色体的有丝分裂分离发生在M期(“M”表示有丝分裂)，其间间隔以间期，G1(DNA复制前细胞生长的时期)和G2(DNA复制后，细胞准备分裂的时期)。胞质分裂(M期的最后步骤)后，细胞分裂完成。已退出细胞周期和已变成静止状态的细胞被称为处在G0期。可刺激处于该时期的细胞使之重新进入细胞周期的G1期。G1、G2和G0中的“G”表示“间期”。细胞周期过程的完成使细胞分裂期间的子细胞接受亲本基因组的完全拷贝。
细胞分裂由两个主要的细胞周期事件即DNA合成的起始和有丝分裂的起始所控制。这些关键事件的每一个转换均由特定蛋白复合物(参与DNA的复制和分裂)代表的关卡(checkpoint)控制。在哺乳动物和植物细胞中，在G1/S边界DNA合成所必需的基因的表达由转录因子的E2F家族调节(La Thangue，1994；Muller等人，2001；De Veylder等人.，2002)。细胞周期的进入由E2F/Rb复合物调节/触发，该复合物可整合信号并使细胞周期基因的转录能够被激活。细胞周期的不同时期之间的转换，和由此产生的通过细胞周期的推进，是通过不同的异源二聚丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(通常称作周期蛋白依赖性激酶(CDKs))的形成和激活来推动的。这些激酶活性的前提条件是与特定的细胞周期蛋白的物理结合，激活的时间选择主要依赖于细胞周期蛋白的表达。细胞周期蛋白的结合诱导结合的CDK的N端末瓣(N-terminal lobe)发生构象变化，并促进该复合物的定位和底物特异性。当单体CDKs与周期蛋白结合时被激活，因此具有激酶活性。细胞周期蛋白水平在细胞周期中波动，从而代表确定CDK活化的时间选择的主要因子。这些在细胞周期中含有细胞周期蛋白和CDK的复合物的周期性活化介导了细胞周期转换(关卡)的时间调控。其他调节CDK活性的因子包括CDK抑制剂(CKIs或ICKs、KIPs、CIPs、INKs)、激活CDK的激酶(CAKs)、CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亚基(CKS)(Mironov等人1999；Reed 1996)。
已描述拟南芥A型周期蛋白(A1、A2和A 3)(包含10种周期蛋白)的三个不同亚类。在Vandepoele等人.(The Plant Cell，Vol.14，903-916，April 2002)中已报道了两个A1型基因(CYCA1；1和CYCA1；2)、四个A2型基因(CYCA2；1、CYCA2；2、CYCA2；3和CYCA2；4)、和四个A3型基因(CYCA3；1、CYCA3；2、CYCA3；3和CYCA3；4)。
国际申请WO 01/85946描述了几种细胞周期蛋白，包括细胞周期蛋白As。已提到细胞周期蛋白可在农业中用于改善植物的生长特性，例如特定组织或器官的生长速率或大小、植物的结构或形态、增加的作物产量、提高的对环境逆境条件(例如干旱、盐、温度或营养缺乏)的耐受性、提高的对滥用细胞周期的植物病原体的耐受性或用作靶以帮助鉴定CCPs的抑制剂或激活剂，所述抑制剂或激活剂可用作除草剂或植物生长调节剂。
可通过许多方法增加产量，一些方法令人惊奇。例如，在20世纪60年代对小麦和水稻产量增加(所谓的绿色革命)作出贡献的主要因素是植物高度的降低(Sakamoto和Matsuoka，Current Opinion inBiotechnology 2004，15144-147)。使用大量氮肥后，当时的常规品种生长过高从而产生倒伏，导致显著的产量损失。相反地，绿色革命的半矮缩品种，由于其较矮的株高，具有抗倒伏性，从而导致作物产量的加倍。
现已惊奇地发现可通过向植物中导入细胞周期蛋白A核酸，优选地编码细胞周期蛋白A蛋白的核酸来增加植物产量，该细胞周期蛋白A核酸有效地连接种子偏爱的启动子。在种子偏爱的启动子控制之下的细胞周期蛋白A核酸的表达导致比在植物中组成型表达的细胞周期蛋白A表达时获得的产量更高的产量。
因此，根据本发明的一个实施方案，提供了用于增加植物产量的方法，其包括将细胞周期蛋白A核酸，优选地编码细胞周期蛋白A蛋白的核酸导入植物，该细胞周期A核酸有效地连接了种子偏爱的启动子。
本发明方法的实施导致增加的植物产量。此处定义的术语“增加的产量”包括和对照植物的生物量相比，植物一个或多个部分的生物量(重量)有增加。该术语也包括种子产量的增加，包括各和对照植物相比，种子生物量(种子重量)上的增加和/或种子(饱满的)数量上的增加和/或种子大小上的增加和/或种子体积上的增加。种子大小和/或体积上的增加也可影响种子的组成。种子产量的增加可由花的数目和/或大小的增加造成。产量上的增加也可提高收获指数，其表示为总生物量对可收获部分例如种子的产量的比例。产量的增加也可提高千粒重(thousand Kernel weight，TKW)，其可通过计数得到的饱满种子数目和其总重量推算出来。
以玉米为例子，产量的增加可以下列的一个或多个方面来表现每公顷或英亩的植物数量的增加、每颗植物的穗数目的增加、行(rows)数、每行粒数、粒重、千粒重、穗长/直径的增加等。以水稻为例，产量的增加可通过下列的一个或多个方面的增加来表现每公倾或英亩的植物数量、每颗植物的圆锥花序(panicle)数目、每圆锥花序上的小穗数量、每圆锥花序的花数量的增加、种子饱满率的增加、千粒重的增加等。
在杂交植物中可进一步增加产量或可进一步评估产量。作物例如玉米通常以杂种进行销售。田间作物育种的目的是将存在于单个品种或杂种中的各种想要的性状组合起来。通过利用植物的授粉方法(自花授粉，如在水稻的情况下，或异花授粉，如在玉米的情况下)的不同技术进行育种。谷物的育种通常包括自花授粉和异花授粉步骤。以玉米为例，新品种的产生通常需要近交亲本系的开发、选择和生产，所述近交亲本系随后用于生产具有某些想要的特性的杂交玉米。因此，玉米杂种的开发要求纯合近交系的开发、这些系的杂交和对这些杂交(杂种)的评估。然后可通过杂交(基因导入)或通过转化技术进行的分子导入来导入想要的性状。为确定产物的田间表现，可对纯合的近交植物的纯合群体或对两个纯合近交系之间的杂种进行新作物的评估。上述技术在本领域是熟知的。
更特别地，增加的产量以下列的一个或多个方面来表现各自和对照植物相比，种子重量增加、饱满种子数目增加、种子数目增加、种子大小增加、收获指数增加、千粒重增加和经修饰的种子组成。因此，根据本发明，提供了用于增加植物产量的方法，其中增加的植物产量选自下列的一项或多项各自和对照植物相比，种子重量增加、饱满种子数目增加、种子数目增加、种子大小增加、收获指数增加、千粒重增加和经修饰的种子组成，该方法包括将细胞周期蛋白A核酸，优选地编码细胞周期蛋白A蛋白的核酸导入植物，该细胞周期蛋白A核酸有效地连接了种子偏爱的启动子。
因为本发明的转基因植物具有增加的产量，因此和对照植物在其生命周期的相应阶段的生长速率相比，这些植物可能表现生长速率增加(在其生命周期的至少部分时期)。增加的生长速率对于植物的一个或多个部分(包括种子)可以是特异的，或可以是基本上在整个植株上都如此。在种子特别是谷物种子的情况下，种子的成熟可能与完整地存在于植物上的种子的水分含量有关。因此，和对照植物相比，提供种子成熟指征的含水量也是种子生长速率的一个指征。对于任意给定的植物品种，本领域技术人员知道表示种子可以收获的含水量。可使用已知的技术测量含水量。
此外，生长速率的增加可在植物生命周期的一个或多个阶段上或基本上在整个植物生命周期中发生。在植物生命周期的早期阶段生长速率增加可反映增加的活力。
生长速率的增加可改变植物的收获周期，使得植物可能可以比生长速率未增加的植物更迟播种和/或更早收获。此处定义的术语“收获周期”是指植物的播种和收获之间的时间。如果生长速率充分增加，可允许再次播种相同植物品种的种子(例如播种和收获水稻植物后接着再次播种和收获水稻植物都在一个常规的生长周期内)。类似地，如果生长速率充分增加，可能可以再次播种不同植物品种的种子(例如播种和收获水稻植物后，播种和任选地收获大豆、土豆或任何其他合适的植物)。在一些植物的情况下，对相同根状茎的收获可在一年中的额外时间发生。改变植物收获周期的可能性可导致每英亩年生物量产量的增加(由于可生长和收获任何特定植物的次数(比如一年内)增加)。生长速率的增加也可使转基因植物在比其野生型对应物生长的地理范围更广的范围内进行栽培，因为栽培植物的地域限制通常由在种植时间(早季节)或收获时间(晚季节)上的不利环境条件确定。如果收获周期缩短，那么可避免这些不利的条件。
生长速率也可通过从描绘生长实验的生长曲线推导出各种参数来确定，这些参数可以是T-Mid(植物达到其最大尺寸的50％所用的时间)和T-90(植物达到其最大尺寸的90％所用的时间)，等等。
根据本发明，本发明方法的实施产生生长速率改变的植物。因此，根据本发明，提供了用于增加植物生长速率的方法，该方法包括将细胞周期蛋白A核酸、优选地编码细胞周期蛋白A蛋白的核酸导入植物，该细胞周期蛋白A核酸有效地连接了种子偏爱的启动子。
产量和/或生长速率的增加也包括，和对照植物相比，在非压力条件下和在逆境条件下植物有更好的表现。植物通常以更慢地生长来对暴露于逆境作出反应。在严重的逆境条件下，植物可完全停止生长。另一方面，中度的逆境此处定义为这样的任何逆境，其中在该逆境条件下植物不完全停止生长。由于农业实践的进步(灌溉、施肥、杀虫剂处理)，通常在栽培作物植物中不会遇到严重的逆境。因此，由中度逆境诱导的生长降低常常是不想要的农业特性。中度逆境是植物可能遇到的典型逆境。这些逆境可以是植物面临的日常生物和/或非生物逆境。典型的非生物或环境逆境包括由非典型的热或冷/严寒温度造成的温度逆境、盐逆境、水逆境(干旱或过多的水)。非生物逆境也可由化学物质引起。生物逆境通常是由病原体例如细菌、病毒、真菌和昆虫导致的逆境。
在本发明的一个实施方案中，要导入植物的细胞周期蛋白A是A2型细胞周期蛋白，优选地是细胞周期蛋白A22。
此处定义的“细胞周期蛋白A核酸”是指编码这样的蛋白的核酸，其在天然形式下包含基元1，该基元1表示为W L V/I E V S/A D/ED/E Y K/R/T L(基元1)，其中反斜线(/)表示‘或’，即其中‘V/I’表示V或I。氨基酸序列中基元1的存在使所述序列可被鉴定为细胞周期蛋白A而不是任何其他类型的细胞周期蛋白。
此处定义的术语“细胞周期蛋白A2核酸”是编码这样的蛋白的任何核酸，其在天然的形式下包含上面鉴定的基元1，并另外地包含基元2，所述基元2表示为E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/GF R/L L/R/K/N F L P S(基元2)，其中所鉴定的残基(--T-----F--F---)(和上面下划线标出的)中的至少两个残基的存在可使序列被鉴定为A2型细胞周期蛋白而不是任何其他的细胞周期蛋白A。上面的破折号(-)表示氨基酸残基，其中一个破折号等同于在基元2中对应位置上的一个氨基酸残基。
此处定义的术语“细胞周期蛋白A2；2核酸”是编码这样的蛋白的任何细胞周期蛋白A核酸，其中所述蛋白按不断增加的优选顺序编码与SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性或相似性的任何细胞周期蛋白A核酸。
此处定义的“细胞周期蛋白A氨基酸”或“细胞周期蛋白A蛋白”是指这样的氨基酸，其在天然形式中包含基元1，所述基元1表示为W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L(基元1)，其中反斜线(/)表示‘或’，即其中‘V/I’表示V或I。氨基酸序列中基元1的存在使该序列被鉴定为细胞周期蛋白A而不是鉴定为任何其他类型的周期蛋白。
此处定义的术语“细胞周期蛋白A2氨基酸”或“细胞周期蛋白A2蛋白”是任何这样的氨基酸，其在天然形式中包含如上所鉴定的基元1和另外地包含基元2，所述基元2表示为E L T L V/I/T/M D/E/MY T/S/H/P/G F R/L L/R/K/N F L P S(基元2)，其中经鉴定的残基(--T-----F--F---)(和上面下划线标出的)中的至少两个残基的存在使序列被鉴定为A2型周期蛋白而不是任何其他的细胞周期蛋白A。上面的破折号(-)表示氨基酸残基，其中一个破折号等同于在基元2中对应位置上的一个氨基酸残基。
此处定义的术语“细胞周期蛋白A2；2氨基酸”或“细胞周期蛋白A2；2蛋白”是指这样的细胞周期蛋白A，即该蛋白按逐渐增加的优选顺序与SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同源性。
被导入植物的细胞周期蛋白A核酸可来源于任何来源，只要该核酸在植物种子组织中过量表达时导致增加的植物产量即可。被导入植物的核酸可分离自微生物来源，例如细菌、酵母或真菌，或分离自植物、藻类或动物来源。通过有意的人工操作，该核酸在组成和/或基因组环境方面由其天然形式得到实质性修饰。所述核酸序列优选地是同源核酸序列，即从植物获得的核酸序列，无论来自相同的植物品种还是来自不同的品种。核酸序列可分离自单子叶植物或双子叶植物品种，优选地分离自十字花科(Brassicaceae)家族，更优选地分离自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。最优选地，细胞周期蛋白A是A2型周期蛋白，例如细胞周期蛋白A2；1、A2；2、A2；3或A2；4。在特别优选的实施方案中，细胞周期蛋白A2；2由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2表示。
尽管本发明由SEQ ID NO1所示的核酸和由SEQ ID NO2所示的氨基酸举例说明，也可使用细胞周期蛋白A氨基酸变体和细胞周期蛋白A核酸变体来进行所述方法。
用于实践本发明方法的核酸和氨基酸序列变体包括(i)细胞周期蛋白A核酸的功能性部分；(ii)能够和细胞周期蛋白A核酸/基因杂交的序列；(iii)细胞周期蛋白A核酸/基因的变通剪接变体；(iv)细胞周期蛋白A核酸/基因的等位基因变体；(v)由遗传密码简并性产生的变体；和(vi)细胞周期蛋白A蛋白的同源物、衍生物和活性片段。
此处所用的术语“核酸”包括互补链和对应的RNA、DNA、cDNA和基因组DNA。核酸可以是双链的或单链的。
对本领域技术人员来说很明显的是全长细胞周期蛋白A DNA序列不是进行本发明方法的先决条件，也可使用细胞周期蛋白A的核酸的功能性部分。功能性部分是指来源于原始(更大的)DNA分子或从中制备的DNA片段，所述功能性DNA部分当导入植物并在植物中表达时，产生具有产量增加的植物。该部分可包含许多具有或不具有额外控制元件的基因，或可以只包含间隔序列。使用常规技术可容易地确定适合用于本发明方法的部分。例如，可对SEQ ID NO1的核酸序列进行一个或多个缺失和/或截短而不影响其在本发明的方法中执行功能的能力。使用常规技术，例如通过测定细胞周期蛋白A的活性和/或按照实施例部分描述的方法通过简单地用待测定其功能性的部分替代真实实例中所用的序列，可容易地确定适合用于本发明方法的部分。用于本发明方法的优选的部分能够编码包含基元1和优选地另外包含基元2的蛋白。更优选地，所述部分是由SEQ ID NO1所示的细胞周期蛋白A核酸的部分。
因此，根据本发明的其他实施方案，提供了用于增加植物产量的方法，其包括将细胞周期蛋白A核酸(优选地SEQ ID NO1所示的核酸)的功能性部分导入植物，该功能性部分有效地连接了种子偏爱的启动子。
能够和细胞周期蛋白A核酸(例如由SEQ ID NO1所示的核酸)杂交的序列也可用于进行本发明的方法。此处定义的术语“杂交”是指这样的过程，其中基本上同源互补的核苷酸序列相互退火。杂交过程可完全在溶液中(即两条互补核酸都在溶液中)进行。依赖于该过程的分子生物学方法包括聚合酶链式反应(PCR；和所有基于此的方法)、减法杂交(subtractive hybridisation)、随机引物延伸、S1核酸酶作图(nuclease S1 mapping)、引物延伸、逆转录、cDNA合成、RNAs的差异显示(differential display of RNAs)和DNA序列的确定。也可用固定在基质例如磁珠、琼脂糖珠或任何其他树脂上的互补核酸之一进行杂交过程。依赖于该过程的分子生物学方法包括poly(A+)mRNA的分离。另外，可通过用固定在固体支持物例如硝酸纤维素或尼龙膜上或通过例如光刻法固定在例如硅玻璃支持物(后者称为核酸阵列或微阵列或称为核酸芯片)上的互补核酸之一来进行杂交过程。依赖于该过程的分子生物学方法包括RNA和DNA凝胶印迹分析、菌落杂交(colony hybridization)、噬菌斑杂交、原位杂交和微阵列杂交。为了使杂交能够发生，通常对核酸分子进行热或化学变性以使双链解链形成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其他二级结构。杂交的严紧度受条件例如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成影响。用于杂交的高严紧条件包括高温和/或低盐浓度(盐包括NaCl和柠檬酸三钠)和/或杂交缓冲液中甲酰胺的存在和/或降低杂交缓冲液中的化合物例如SDS(去垢剂)的浓度和/或从杂交缓冲液中除去化合物例如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促进分子聚集)。常规的杂交条件描述于例如Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York中，但本领域技术人员认识到可根据核酸序列的已知或预期同源性和/或长度来设计许多不同的杂交条件。低严紧杂交条件对分离与前面定义的本发明DNA序列异源的核酸是特别优选的。低严紧条件的例子是在37-45℃下在4-6x SSC/0.1-0.5％w/v SDS中进行2-3小时。依赖于参与杂交的核酸的来源和浓度，可使用另外的严紧条件，例如中等严紧条件。中等严紧条件的例子包括在1-4x SSC/0.25％w/v SDS中在≥45℃下进行2-3小时。高度严紧条件的例子包括在0.1-1xSSC/0.1％w/v SDS中在60℃进行1-3小时。本领域技术人员知道在杂交和洗涤期间可改变的以及可维持或改变严紧条件的各种参数。引起异源性的因素包括等位性、遗传密码的简并性和偏爱密码子用法上的差异。
能够和细胞周期蛋白A核酸例如SEQ ID NO1所示的核酸杂交的优选序列是能够编码包含基元1和优选地另外包含基元2的蛋白的杂交序列。使用常规技术，例如通过测定细胞周期蛋白A的活性和/或按照实施例部分描述的方法通过简单地用待测试其功能性的杂交序列替代真实实例中所用的序列，可容易地确定适合用于本发明方法的杂交序列。
因此，根据本发明的另外的实施方案，提供了用于增加植物产量的方法，其包括将能够和在上文中定义的细胞周期蛋白A核酸，优选地与SEQ ID NO1所示的细胞周期蛋白A核酸杂交的核酸导入植物，该杂交序列有效地连接了种子偏爱的启动子。
也可使用细胞周期蛋白A核酸(例如SEQ ID NO1所示的核酸)的变通剪接变体实践本发明的方法。此处使用的术语“变通剪接变体”包括这样的核酸序列变体，其中已切除、替换或加入了选定的内含子和/或外显子。这些变体可以是这样的变体，其中蛋白质的生物学活性未受影响，这可通过选择性地保留由该核酸编码的蛋白的功能性片段来实现。这样的剪接变体可能在自然界中存在，或者可以人工制备。用于制备这些剪接变体的方法在本领域是已知的。优选的剪接变体编码包含基元1和优选地另外包含基元2的蛋白。使用常规技术，例如通过测定细胞周期蛋白A的活性和/或按照实施例部分描述的方法通过简单地用待测试其功能性的剪接变体替代真实实例中所用的序列，可容易地确定适合用于本发明方法的细胞周期蛋白A核酸的剪接变体。
因此，根据本发明的另外的实施方案，提供了用于增加植物产量的方法，其包括将细胞周期蛋白A核酸的剪接变体，优选地SEQ ID NO1所示核酸序列的剪接变体导入植物，该剪接变体有效地连接了种子偏爱的启动子。
有利地，也可使用细胞周期蛋白A核酸的等位基因变体，优选地SEQ ID NO1所示细胞周期蛋白A核酸的等位基因变体，来实践本发明的方法。等位基因变体存在于自然界中，本发明的方法包括这些天然等位基因的用途。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNPs)以及小的插入/缺失多态性(INDELs)。INDELs的大小通常小于100bp。SNPs和INDELs构成了大多数生物天然存在的多态品系(strain)中的最大序列变体集合。优选的等位基因变体编码含有基元1和优选地另外含有基元2的蛋白。使用常规技术，例如通过测定细胞周期蛋白A的活性和/或按照实施例部分描述的方法通过简单地用待测试其功能性的等位基因变体替代真实实例中所用的序列，可容易地确定适用于本发明方法的细胞周期蛋白A核酸的等位基因变体。
因此，根据本发明的另外的方面，提供了用于增加植物产量的方法，其包括将细胞周期蛋白A核酸的等位基因变体，优选地SEQ ID NO1所示细胞周期蛋白A核酸的等位基因变体导入植物，该等位基因变体有效地连接了种子偏爱的启动子。
细胞周期蛋白A氨基酸变体的例子包括SEQ ID NO2所示细胞周期蛋白A的同源物、衍生物和活性片段。
细胞周期蛋白A蛋白的“同源物”包括，相对于未经修饰的所针对蛋白，具有氨基酸替代、缺失和/或插入并且具有与该未经修饰的蛋白相似的生物和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白和酶，所述未经修饰的蛋白是其来源蛋白。为产生这些同源物，可用具有相似特性(例如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或断裂α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的其他氨基酸替代该蛋白的氨基酸。保守替代表在本领域是熟知的(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freemanand Company)。优选地，同源物按逐渐增加的优选顺序与SEQ ID NO2所示细胞周期蛋白A具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的序列同一性(功能性同一性)。具有至少40％序列同一性的同源物包括细胞周期蛋白As，而不包括任何其他的细胞周期蛋白种类。
同源物的两种特殊形式，直系同源物(ortholog)和旁系同源物(paralog)，是用于描述基因的祖先关系的进化概念。术语“旁系同源”涉及物种基因组内产生旁系同源基因的基因重复。术语“直系同源”涉及因祖先关系的原因而存在于不同生物体中的同源基因。
例如，通过进行所谓的交互式基本局部比对工具搜索(reciprocal blast search)可容易地发现单子叶植物物种中的直系同源物。可通过第一次基本局部比对来进行该方案，其包括将所关注序列(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)对任何序列数据库例如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov上找到的公共可获得的NCBI数据库进行基本局部比对。如果搜索水稻中的直系同源物，则将关注序列对例如在NCBI上可获得的来自日本晴水稻(Oryza sativa Nipponbare)的28，469个全长cDNA克隆进行基本局部比对。当从核苷酸着手进行比较时可使用BLASTn，或者，当从蛋白开始时可使用TBLASTX，其中使用标准的默认值(期望值10，比对值50)。可过滤基本局部比对结果。然后反过来将经过滤的结果或未经过滤的结果的全长序列再对关注序列(SEQ ID NO1或2)进行基本局部比对(第二次基本局部比对)。然后比较第一和第二次基本局部比对的结果。在大家族的情况下，使用ClustalW，然后使用相邻连接树(neighbour joining tree)帮助显示聚类。细胞周期蛋白A直系同源物的例子包括在下列录入号下登载的序列在蛋白质录入号AK106653(A3型细胞周期蛋白)下登载的水稻直系同源物、在蛋白质录入号BAA86628(A1型细胞周期蛋白)下登载的水稻直系同源物和在录入号AAC50013下登载的玉米直系同源物。
此处所用的术语“同源物”也包括可用于本发明方法中的蛋白的旁系同源物和直系同源物。
蛋白的“替代性变体”是指这样的蛋白，其中氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基已被去除并且在其位点上插入了不同的残基。氨基酸替代通常是单一残基替代，但可以是成簇的氨基酸替代，这依赖于多肽上所置的功能性限制；插入通常是大约1至10个氨基酸残基，而缺失通常在大约1至20个残基的范围内变动。优选地，氨基酸替代包括保守性氨基酸替代。
蛋白的“插入变体”是指这样的蛋白，其中在蛋白质的预先确定的位点上引入一个或多个氨基酸残基。插入可包括氨基末端和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，氨基酸序列内的插入比氨基或羧基末端融合短，大约为1-10个残基。氨基或羧基末端融合蛋白或肽的例子包括用于酵母双杂交系统中的转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体衣壳蛋白、(组氨酸)6-标签、谷胱甘肽S转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag100表位、c-myc表位、FLAG-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
蛋白的“缺失变体”的特征在于从该蛋白上去除一或多个氨基酸。使用本领域熟知的肽合成技术，例如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作，可容易地制备蛋白的氨基酸变体。用于操作DNA序列以产生蛋白的替代、插入或缺失变体的方法在本领域是熟知的。例如，用于在DNA中预先确定的位点上产生替代突变的技术对本领域技术人员来说是熟知的，其包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或其他定点诱变方案。
用于细胞周期蛋白A同源物的搜索和鉴定的方法在本领域技术人员的技术范围之内。用于比较的序列比对方法在本领域是熟知的，这些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443-453，1970)的算法以找出两个完整序列的比对，该比对使匹配的数目最大化并使缺口的数目最小化。BLAST算法用于计算两个序列之间的百分比序列同一性和进行两个序列之间的相似性统计学分析。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Centre for BiotechnologyInformation)公开获得。
术语“衍生物”是指和细胞周期蛋白A(例如SEQ ID NO2所示的蛋白)氨基酸序列相比，包含天然和非天然发生的氨基酸残基的替代、缺失或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白和酶。细胞周期蛋白A蛋白的“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白和酶，其与该多肽的天然发生形式的氨基酸序列相比，可包含天然发生的改变的、糖基化的、乙酰化的或非天然发生的氨基酸残基。衍生物和其来源氨基酸序列相比，也可包含一个或多个非氨基酸替代，例如报告分子或其他配体，其与该氨基酸序列共价或非共价结合，例如结合其上以促进其检测的报告分子还可包含和天然发生蛋白的氨基酸序列相比包含非天然发生的氨基酸残基。
细胞周期蛋白A蛋白的“活性片段”包含至少基元1和优选地另外包含基元2，并保持和天然发生蛋白相似的生物学和/或功能性活性。
用包含目的序列(即细胞周期蛋白A核酸)的载体转化植物，所述序列有效地连接了种子偏爱的启动子。
因此，根据本发明的另外的实施方案，提供了这样的构建体，其包含(i)细胞周期蛋白A核酸；(ii)种子偏爱的启动子；和可选地(iii)转录终止序列。
细胞周期蛋白A核酸可以是任何前述的细胞周期蛋白A序列，包括细胞周期蛋白A变体序列。在下文中定义了合适的种子偏爱的启动子。
术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在此都可互换使用，并且在广义上是指能够影响和其连接的序列表达的调控核酸序列。此处使用的术语“有效连接的”是指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，使得启动子序列能够起始目的基因的转录。
前述术语包括来源于经典的真核细胞基因组基因的转录调控序列(包括精确转录起始所需的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)和额外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，其可响应于发育和/或外部刺激或者以组织特异性的方式来改变基因表达。所述术语还包括经典的原核生物基因的转录调控序列，在该情况下，其可包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其在细胞、组织或器官中提供、激活或增强核酸分子的表达。
有利地，可使用任何种子偏爱的启动子进行本发明的方法。在本发明的上下文中，种子偏爱的启动子是主要在种子组织中具有活性但不一定只在种子组织中具有活性的启动子。种子组织包括种子的任何部分，包括种壳、糊粉层、胚乳(对单子叶植物和胚乳双子叶植物(endospermic dicots)来说)、胚(对于单子叶植物来说包括盾盖、外胚叶、胚芽、胚根；对于双子叶植物来说包括子叶、下胚轴和胚根)。用于实践本发明方法的优选的启动子是在胚乳中具有活性的启动子，例如来自水稻的α球蛋白启动子、燕麦球蛋白启动子、水稻或小麦谷蛋白启动子、blz2、水稻转录因子RISBZ1。特别优选的是在胚乳中具有活性的启动子，该启动子优选地在萌发期间和萌芽之后具有活性，例如来自水稻的谷醇溶蛋白(prolamin)启动子。
下述表1中列出了适于实施本发明方法的启动子实例。
表1种子偏爱的启动子
任选地，也可在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语“终止子”包括这样的控制序列，其是转录单位末端的DNA序列，其为初始转录物的3’加工和聚腺苷酰化以及转录的终止提供信号。其他的调控元件可包括转录和翻译增强子。本领域技术人员知道可适合用于进行本发明的终止子和增强子序列。本领域技术人员知道这些序列或可容易地获得这些序列。
本发明的基因构建体可进一步包括复制序列起点，其是在特定细胞类型中保持和/或复制所需的序列。一个例子是当基因构建体需要在细菌细胞中作为游离体遗传成分(例如质粒或粘粒分子)保持时的情况。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。
基因构建体可选地包含选择标记基因。如此处所用的，术语“选择标记基因”包括为它在其中表达的细胞提供表型以帮助鉴定和/或选择被本发明的核酸构建体转染或转化的细胞的任何基因。合适的标记可选自提供抗生素或杀虫剂抗性或导入新的代谢性状或允许视觉选择的标记。因而含有重组DNA的细胞能够在杀死未转化细胞的抗生素或杀虫剂浓度存在的情况下存活。选择标记基因的例子包括提供对杀虫剂Basta的抗性的bar基因；提供对抗生素卡那霉素的抗性的npt基因；提供潮霉素抗性的hpt基因。视觉标记，例如绿色荧光蛋白(GFP，Haseloff等人，1997)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或荧光素酶，也可用作选择标记。
通过使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术可构建用于本发明方法的构建体。可将基因构建体插入载体，所述载体可商购获得，适合用于转化入植物和适合用于在转化细胞中表达目的基因。
可将细胞周期蛋白A蛋白自身和/或细胞周期蛋白核酸自身直接导入植物细胞或植物本身(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选的特性，优选地通过转化将核酸导入植物。
此处提到的术语“转化”包括将外源多核苷酸转移入宿主细胞，而与用于转移的方法无关。能够进行后续无性繁殖的植物组织，无论是器官发生的还是胚发生的，都可用本发明的基因构建体进行转化并由此生成整株植物。所选择的特定组织可依赖于可获得的用于和最适合于待转化的特定品种的无性繁殖系统而变。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子体、愈伤组织、已有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽、和根分生组织)、和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可被瞬时或稳定地导入宿主细胞，并可保持非整合形式，例如作为质粒保持。或者，其也可被整合入宿主基因组。然后可以本领域技术人员已知的方法将所得的经转化的植物细胞用于再生转化植物。
现在植物物种的转化是非常常规的技术。有利地，可将几种转化方法中的任一种用于把目的基因导入合适的祖先细胞。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄入的化学物质、将DNA直接注射入植物、颗粒枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微注射法。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等人，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等人，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等人，1985Bio/Technol 3，1099-1102)；向植物材料显微注射(Crossway A.等人，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；包被DNA或RNA的颗粒轰击法(Klein T.M.等人，1987，Nature 327，70)；使用(非整合)病毒的感染法等。在水稻转化的情况下，根据本发明的优选方法是按照Hiei等有关人.1994的方案。对于玉米转化，包括玉米组织的基于农杆菌的转化的方法之前已在EP0604662、EP0672752、EP0971578、EP0955371、EP0558676中进行了描述。优选的高效转化玉米的方法是描述于Ishilda等人(High efficiency transformation of maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens.NatBiotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)和描述于Frame等人(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maizeembryos using a standard binary Vector system.Plant Physiol.2002 May；129(1)13-22)中的方案。
通常在转化后，就一个或多个标记的存在与否选择植物细胞或细胞群(所述标记是由和目的基因一起共转化的植物可表达基因编码的)，然后将该被转化材料再生成完整的植株。
在DNA转移和再生后，可使用例如Southern分析法就目的基因的存在与否、拷贝数和/或基因组的组织对推定的转化植物进行评估。可选择地或另外地，可使用Northern和/或Western分析法监控新导入的DNA的表达水平，这两个技术对本领域技术人员来说都是熟知的。
可通过各种方法，例如通过无性繁殖或经典的育种技术，来繁殖产生的转化植物。例如，可将第一代(或T1)转化植物自交以产生纯合的第二代(或T2)转化体，然后通过经典的育种技术将T2植物进行进一步繁殖。
所生成的转化生物可采用多种形式。例如，其可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；无性繁殖的转化体(例如，所有细胞被转化而含有表达盒)；转化和未转化组织的嫁接物(例如，在植物中，被转化的砧木(rootstock)嫁接未转化的接穗)。
很明显本发明扩展至由此处描述的任一方法产生的任何植物细胞或植物，并扩展至其所有植物部分和繁殖体。本发明进一步扩展至包括通过前述方法中任一种方法产生的初级转化或转染的细胞、组织或整株植物的后代，唯一的要求是后代表现出和通过本发明的方法在亲本中产生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本发明也包括含有分离的细胞周期蛋白A核酸分子，优选地编码细胞周期蛋白A蛋白的核酸分子的宿主细胞。本发明的优选的宿主细胞是植物细胞。本发明也扩展至植物的可收获部分，例如、但不限于种子、叶、果实、花、茎培养物、茎、根茎、根、块茎和球茎。
此处所用的术语“植物”包括完整的植物、植物的祖先和后代以及植物的部分，包括种子、枝条、茎、根(包括块茎)和植物细胞、组织和器官。因此术语“植物”也包括悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、种子、根、枝条、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
在本发明中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族特别是单子叶植物和双子叶植物的所有植物，包括选自下述的饲料或豆科饲料、观赏植物、粮食作物、树或灌木金合欢(Acaciaspp.)、槭(Acers pp.)、猕猴桃(Actinidia spp.)、七叶树(Aesculusspp.)、新西兰贝壳杉(Agathis astralis)、Albizia amara、Alsophila tricolor、Andropogon spp.、落花生(Arachis spp)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、鹰嘴紫云英(Astragaluscicer)、多小叶红苏木(Baikiaea plurijuga)、桦木(Betula spp.)、芸苔(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkeaafricana、紫铆树(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱樱花(Calliandra spp)、茶树(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒(Capsicum spp.)、决明(Cassiaspp.)、Centroemapubescens、木瓜(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffeaa arabica)、绣球小冠花(Colophospermum mopane)、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、山楂(Crataegus spp.)、香瓜(Cucumis spp.)、柏木(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、Cryptomeria japonica、香茅(Cymbopogonspp.)、Cynthea dealbata、榲桲(Cydonia oblonga)Dalbergiamonetaria、Davallia divaricata、山蚂蝗(Desmodium spp.)、Dicksonia squarosa、Diheteropogon amplectens、Diocles spp、镰扁豆(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloapyramidalis、Ehrartia spp.、(Eleusine coracana)、Eragrestisspp.、刺桐类(Erythrina spp.)、桉树(Eucalyptus spp.)、Eucleaschimperi、Eulalia villosa、荞麦(Fagopyrum spp.)、南美稔(Feijoasellowiana)、草莓属(Fragaria spp.)、千斤拔(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、银杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、岩黄芪(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、黄茅(Heteropogoncontortus)、大麦(Hordeum vulgare)、红苞芽(Hyparrhenia rufa)、小连翘(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、Indigoincarnata、鸢尾(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、Lespedizaspp.、Lettuca spp.、银合欢(Leucaena leucocephala)、Loudetiasimplex、Lotonus bainesii、百脉根(Lotus spp.)、Macrotylomaaxillare、苹果(Malus pp.)、木薯(Manihot esculenta)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、烟草(Nicotianum spp.)、驴食草(Onobrychisspp.)、Ornithopus spp.、稻(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草属(Pennisetum spp.)、Persea gratissima、碧冬茄(Petuniaspp.)、菜豆(Phaseolus spp.)、Phoenix canariensis、新西兰剑麻(Phormium cookianum)、石楠(Photinia spp.)、Picea glauca、松树(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西兰罗汉松(Podocarpustotara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、杨属(Populus pp.)、瓜叶牧豆树(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyruscommunis)、栎(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、Rhopalostylis sapida、Rhus natalensis、Ribes grossularia、茶藨子(Ribes spp.)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇(Rosaspp.)、悬钩子(Rubus spp.)、柳(Salix spp.)、Schyzachyriumsanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美红杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、高粱(Sorghumbicolor)、菠菜(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、三叶草属(Trifolium spp.)、小麦属(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔(Vaccinium spp.)、野豌豆(Viciaspp.)、葡萄(Vitis vinifera)、Watsonia pyramidata、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、觅菜(amaranth)、朝鲜蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、西兰花(broccoli)、芽甘蓝(Brussels sprouts)、圆白菜(cabbage)、芸苔(canola)、胡萝卜(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、甘蓝(collard greens)、亚麻(flax)、羽衣甘蓝(kale)、小扁豆(lentil)、油籽油菜(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋葱(onion)、马铃薯(potato)、水稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、蕃茄、squashtea、树和藻类等。
根据本发明的优选的实施方案，植物是作物植物，包括蕃茄、马铃薯、烟草、黑麦、大豆、向日葵、油菜、紫花苜蓿、油菜籽或棉花。更优选地，本发明的植物是单子叶植物，例如甘蔗。最优选的，所述植物是谷物，例如燕麦、黑麦、水稻、玉米、小麦、粟、高粱或大麦。
本发明也包括可通过本发明的方法获得的植物。因此本发明提供了可通过本发明的方法获得的植物，所述植物和对照植物相比具有增加的产量，其中所述植物在植物种子组织中也具有细胞周期蛋白A的优先表达。
根据本发明的另外的实施方案，提供了生产和对照植物相比具有增加的产量的转基因植物的方法，所述方法包括将有效地连接了种子偏爱的启动子的细胞周期蛋白A核酸导入植物。细胞周期蛋白A可以是SEQ ID NO1所示的核酸或可以是在上文中定义的细胞周期蛋白A核酸变体中的任一种，或可以是落在上文所述细胞周期蛋白A核酸的定义范围内的任何核酸。
图表描述现在参考下列图表对本发明进行描述，其中


图1.通过几个全长细胞周期蛋白A蛋白序列(除了1部分水稻序列外)的比对产生的系统发生树。使用聚类程序(Clustal program)利用默认设置进行比对并将比对显示为系统发育图。如图所示，序列聚类在显示的4个主要群体中。
图2.用于在水稻(Oryza sativa)中在PROLAMIN启动子控制下表达拟南芥细胞周期蛋白A2；2基因的二元载体。该载体含有来自Ti质粒、由左边界(LB重复，LB Ti C58)和右边界(RB重复，RB TiC58)界定的T-DNA。
图3.是显示在细胞周期蛋白A中发现的跨种保守性基元的表。基元1可用于区分细胞周期蛋白A和其他类型的细胞周期蛋白，基元1和基元2一起可用于区分A2细胞周期蛋白和任何其他A型周期蛋白。作为对照，显示了在细胞周期蛋白B；1中发现的基元。
图4.是用于本发明方法的序列表。
序列描述SEQ ID NO1表示用于本发明方法的细胞周期蛋白A2；2核酸。除了两个替代外，其与以录入号NM_121168保藏的序列的编码序列相同，其中第一个替代在位点851上，为C替代成G，第二个替代在位点1295上，为C替代T。据认为这些变化不会产生任何后果。
SEQ ID NO2表示由SEQ ID NO1的核酸编码的细胞周期蛋白A2；2的氨基酸序列。其与以录入号NP_568248登载的序列相同，除了其含有两个氨基酸替代外，其中第一个替代在位点284上，为脯氨酸替代精氨酸，第二替代在位点432上，为丝氨酸替代苯丙氨酸。据认为这些变化不产生任何后果。
SEQ ID NO3是来自水稻的谷醇溶蛋白启动子的代表。
SEQ ID NO4和SEQ ID NO5表示用于基因克隆的引物的序列。
实施例现在用下列实施例描述本发明，所述实施例只是用于说明目的。
DNA操作除非另外提到，根据在(Sambrook(2001)Molecular Cloningalaboratory manual，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)中或Ausubel等人.(1984)，Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols的第1和2卷中描述的标准方案进行重组DNA技术。在由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy编著的Plant Molecular Biology Labfase(1993)中描述了用于植物分子操作的标准材料和方法。
实施例1基因克隆使用拟南芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增拟南芥细胞周期蛋白A2；2(内参照CDS95)。在对从幼苗提取的RNA逆转录后，将cDNAs克隆入pCMV Sport 6.0。文库的平均插入片段大小为1.5kb，克隆的原始数目为1.59×107cfu。原始滴度经确定为9.6×105cfu/ml，第一轮扩增后为6×1011cfu/ml。在提取质粒后，在50μl PCR混合物中使用200ng模板。包含用于Gateway重组的AttB位点的引物prm582(正向引物，起始密码子以粗体标示，AttB1位点以斜体标示5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatgtattgctcttcttcgatgc 3’)和prm583(反向引物，互补物，终止密码子以粗体标示，AttB2位点以斜体标示5’5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgcttggtgtcatcttgagaatag 3’)用于PCR扩增。使用Hifi Taq DNA聚合酶在标准条件下进行PCR。也使用标准的方法扩增和纯化1311bp的PCR片段。然后进行Gateway方法(BP反应)的第一步骤，在此期间PCR片段与pDONR201质粒在体内重组，产生按照Gateway术语学被称为“入门克隆(entry clone)”的p754。质粒pDONR201购自Invitrogen，作为Gateway技术的部分。
实施例2载体构建然后将含有细胞周期蛋白A2.2的入门克隆和用于水稻转化的目的载体用于LR反应。该载体含有在T-DNA边界内的功能性元件植物选择性标记；视觉标记；和用于和已在入门克隆中克隆的目的序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于过量表达的谷醇溶蛋白启动子(PRO90)位于该Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，将如图2中所示的所得表达载体(细胞周期蛋白A2；2谷醇溶蛋白-上调)转化入农杆菌中，然后再转化入水稻植物。让经转化的水稻植物生长，然后就实施例3中描述的参数对其进行检测。
实施例3评估和结果A.统计学分析F-检验将二因子ANOVA(变量分析)用作统计学模型进行植物表型性状的总体评估。对针对用本发明的基因进行转化的所有事件的所有植物测量的所有参数进行F检验。进行F检验以检查基因对所有转化事件的影响和确定基因的总体效应，也称作“全局基因效应”。如果F检验的值显示数据是显著的，那么可得出存在“基因”效应的结论，意味着不仅仅是基因的存在或位置导致了表型的差异。对于F检验，真实全局性基因效应的显著性阈值设在5％的概率水平。
B.评估方案产生大约15至20株独立的T0水稻转化子。将初级转化子从组织培养室转移至温室中培养并收获T1种子。保留几个这样的事件，其中在所述事件中，T1后代中转基因的存在/不存在以3∶1比例发生分离。对这些事件中的每一个事件，选择大约10个含有转基因(杂合子和纯合子)T1幼苗，和大约10个缺少转基因(零合子(nullizygotes))的T1幼苗。
(i)营养生长测量值将选择的T1植物(大约10个具有转基因的和大约10个无转基因的)转移至温室中。各植物接受独特的磁带条形码标记以明确地将表型确定数据和对应的植物关联。在下列环境设置下将选择的T1植物种植在直径10cm花盆中的土壤上光周期＝11.5小时、日照强度＝30,000勒克斯或更多、日间温度＝28℃或更高、夜间温度＝22℃、相对湿度＝60-70％。将转基因植物和相应的零合子以随机的位置并行种植。从播种阶段至成熟阶段，将各植物数次通过数码成像室并照象。在各时间点，从至少6个不同的角度对各植物进行数码成像(2048×1536像素，1600万种颜色)。使用图象分析软件以自动的方法从所有植物的数码图象推算出参数，例如地上部分面积。
(ii)种子相关参数测量值收获、袋装、磁带条形码标记成熟主穗(primary panicle)，然后在烘箱中在37℃下干燥三天。然后将穗子脱粒，收集所有种子并计数。使用吹风设备将饱满的壳和空壳分离。弃去空壳并对剩下的部分进行计数。在分析天秤上对饱满的壳称重。由该方法得到成套的下面描述的种子关联参数。
(a)总的种子数目通过计数从植物收获的壳的数目来测量总种子数目。来自在种子偏爱的启动子(谷醇溶蛋白)控制之下表达细胞周期蛋白A2；2的植物的总种子数目的结果显示于下面的表2中。
表2细胞周期蛋白A2；2种子偏爱的启动子(谷醇溶蛋白)的总种子数目
来自在组成型启动子控制之下表达细胞周期蛋白A2；2的植物的总种子数目(数据未显示)少于获自由谷醇溶蛋白启动子驱动表达细胞周期蛋白A2；2基因的植物的总种子数目(如上所示，从F检验得到显著的p值，表明存在总体基因效应)。
(b)饱满种子数目通过计算在分离步骤后剩下的饱满外壳的数目来确定饱满种子数目。下面显示来自在种子偏爱的启动子(谷醇溶蛋白)控制之下表达细胞周期蛋白A2；2的植物的饱满种子数目(表3为T1植物，表4为T2植物)以及来自在组成型启动子控制之下表达细胞周期蛋白A2；2的植物的饱满种子数的结果(表5)。
表3T1评估-细胞周期蛋白A2；2pProlamin的饱满种子数目
结果显示了显著的总体基因效应(F检验中有显著的p值)。和对照植物相比，T1转基因植物表现出饱满种子数目有显著的增加。
表4T2评估-细胞周期蛋白A2；2pProlamin饱满种子的数目
结果显示有显著的总体基因效应(F检验中有显著的p值)。和对照植物相比，T2转基因植物表现出饱满种子数目有显著的增加。
表5细胞周期蛋白A2；2pGOS2饱满种子数目
相对于对照植物，在组成型启动控制之下表达细胞周期蛋白A2；2的植物的饱满种子数增加，然而在谷醇溶蛋白启动子控制下表达细胞周期蛋白A2；2的植物显示更多的饱满种子数目(参见上面的表3和表4)。
(b)总种子产量通过称量从植物中收获的所有饱满外壳的重量来测量每株植物的总种子产量。下面显示了在谷醇溶蛋白启动子(pProlamin)控制之下表达细胞周期蛋白A2；2的植物的总种子产量(对于T1评估结果参见表6，对于T2评估结果参见表7)和在pGOS2控制下表达细胞周期蛋白A2；2的植物的总种子产量(参见表8)的结果。
表6T1评估-细胞周期蛋白A2；2pProlamin总种子产量
T1评估的结果显示有总体基因效应，在F检验中有显著的p值。
表7T2评估-细胞周期蛋白A2；2pProlamin的总种子产量
T2评估的结果显示有总体基因效应，在F检验中有显著的p值。
表8细胞周期蛋白A2；2pGOS2的总种子产量
如表8所显示的，组成型表达细胞周期蛋白A2；2的植物的总种子产量不如种子优选的表达的结果好(参见上面的表6和表7)。
(d)收获指数此处定义收获指数为总种子产量和地上面积(mm2)之间的比例乘以因数106。在种子偏爱的启动子(谷酵溶蛋白)控制之下表达细胞周期蛋白A2；2的植物的收获系数显示于下列的表9中。
表9细胞周期蛋白A2；2pProlamin的收获指数
细胞周期蛋白A2；2pProlamin表达植物的收获指数显示存在总体基因效应(参见来自F检验的p值)。在组成型启动子控制之下表达细胞周期蛋白A2；2的植物的收获指数(数据未显示)不如上面表9中显示的结果好。
(e)千粒重(TKW)从计算的饱满种子数目和其总重量推算TKW。下面显示表达细胞周期蛋白A2；2pProlamin的植物的TKW(参见表10)与表达细胞周期蛋白A2；2pGOS2的植物的TKW(参见表11)的结果。
表10细胞周期蛋白A2；2；pProlamin的TKW
上表显示了来自F检验的显著性p值，从中可明显看出总体基因效应。
表11周期蛋白A2；2pGOS2的千粒重
细胞周期蛋白A2；2pGOS2的千粒重的结果显示TKW有增加，但所述增加不如上面表10中显示的增加大。
(iii)逆境评估细胞周期蛋白A2；2pProlamin播种种子，在10天后，将幼苗移栽至装有1∶1湿沙和蛭石混合物的10cm直径花盆中。将所述10cm直径花盆插入12cm直径花盆中，在两个花盆之间放置一层塑料织物以阻止下土层流失。然后在移栽前用新鲜的水浸透花盆。在移栽一天后，使幼苗接受盐条件。
每天在8am、12am、4pm和9pm用含有下列成分的盐逆境诱导性营养物溶液浇灌花盆4次·NPK营养物混合物，浓度为1kg/m3的20-20-20Petersprofessional(Scotts)。
·Magnesium chelate，333.33ml/m3的Chelal Mg(BMS，Bornem，Belgium)·Iron chelate，21.67g/m3的Libfer(CIBA，Bradford，UK)·1.425kg/m3的NaCl在每周的基础上监控盐浓度，需要时加入盐。在盐逆境条件下培养植物直至谷粒充盈开始。在此时间点上，将其转移至温室的不同区室中，在那里每天用新鲜的水浇灌其直至种子收获。然后以和上面(a)至(e)中针对非逆境植物所述相同的方式测量和记录下列参数。
表12细胞周期蛋白A2；2pProlamin的总种子产量
由针对在以盐逆境为例的逆境条件下细胞周期蛋白A2；2pProlamin植物进行的F-检验的P值可明显看出，表12中的结果显示有显著的基因效应。
表13细胞周期蛋白A2；2pProlamin的饱满种子数目
表13中的结果显示有显著的基因效应，这由针对在以盐逆境为例的逆境条件下细胞周期蛋白A2；2pProlamin植物进行的F-检验的P值可明显看出这一点。
表14细胞周期蛋白A2；2pProlamin的种子总数
表14中的结果表明，相对于对照植物，种子总数有增加。
表15细胞周期蛋白A2；2pProlamin的收获系数
表15中的结果显示，相对于对照植物，收获指数有增加。
表16细胞周期蛋白A2；2pProlamin的TKW
由针对在以盐逆境为例的逆境条件下细胞周期蛋白A2；2pProlamin植物进行的F-检验的P值可明显看出，表16中的结果显示有显著的基因效应。
实施例4本发明在玉米中的应用此处描述的本发明也可用于玉米。在适合用于土壤杆菌介导的玉米转化的植物转化载体中，将细胞周期蛋白A克隆在种子偏爱的启动子的控制之下。在文献(EP0604662、EP0672752、EP0971578、EP0955371、EP0558676；Ishida等人，1996；Frame等人，2002)中已描述了这些用于玉米转化的载体和方法。
将由这些方法产生的转基因植物在温室中进行培养以生产T1种子。通过定量实时PCR和Southern印迹分析法检测转基因的遗传能力和拷贝数，并通过逆转录PCR和Northern分析法确定转基因的表达水平。选择具有转基因单拷贝插入和具有不同转基因表达水平的转基因系用于生产T2种子。在适合玉米的条件(16:8的光周期、26-28℃日间温度和22-24℃夜间温度)下以及在缺水、缺氮和过量NaCl的条件下，在温室中萌发和培养后代种子。
在自交的情况下，来自相同亲本系的无效分离子以及相同栽培品种的野生型植物用作对照。就不同的生物量和生长参数对通过自交或杂交产生的后代植物进行评估，所述生长参数包括植物高度、秆/茎粗度、叶片数目、总地上面积、叶片绿度、成熟时间、抽丝时间、开花时间、穗数目、穗长度、行数(row number)、谷粒数目、谷粒大小、谷粒含油量、谷粒成熟度、收获时间。选择对于上述参数中任一种获得最显著提高的系进行进一步的田间检测和标志辅助育种(marker-assisted breeding)，目的是将田间验证的转基因性状转移入商业化种质中。在本领域内已很好地建立了在田间检测和玉米生长和产量相关的参数的方法以及用于将特定基因座(含有转基因的基因座)从一种种质渐渗入另一种种质的技术。这也包括将感兴趣的性状从经转化的近交系转移至具有想要的农艺或营养或药物价值的商业化杂种中。
序列表<110>CropDesign N.V.
<120>具有增加产量的植物及其生产方法<130>CD-106-PCT<150>US 60/532,287<151>2003-12-22<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1311<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<220>
<221>misc_feature<223>以录入号NM_121168登载的序列的编码序列变体在第851位含有G而不是C，在第1295位含有T而不是C<400>1atgtattgct cttcttcgat gcatccaaat gcaaacaaag aaaatatctc tacttcagat60gtacaggaga gttttgtacg aataacgaga tcacgagcta aaaaagccat gggaagagga120gtatcaatac ctccaacaaa accttctttt aaacagcaaa agagacgtgc agtacttaag180gatgtgagta atacctctgc agatattatt tattcagaac ttcgaaaggg aggcaacatc240aaggcaaaca gaaaatgtct aaaagagcct aaaaaagcag caaaggaagg tgctaacagt300gccatggata ttctggtaga tatgcataca gaaaaatcaa aattagcaga agatttgtcc360aagatcagga tggctgaagc ccaagatgtc tctctttcaa actttaaaga tgaagaaatt420actgagcaac aagaagatgg atcaggtgtc atggagttac ttcaagttgt agatattgat480tccaacgtcg aagatccaca gtgttgcagc ttgtatgctg ctgatatata tgacaacata540catgttgcag agcttcaaca acgacccttg gctaattata tggagcttgt gcagcgagat600atcgacccag acatgagaaa gattctgatt gactggcttg tagaagtttc tgacgactac660aagctggttc cagatacgct ttaccttaca gtgaatctta tcgaccggtt tctgtccaac720agttacattg aaaggcaaag actccagctc cttggtgtct cttgcatgct tatagcttca780aaatatgaag agctttccgc accaggggtg gaggagtttt gcttcattac ggccaacaca840tacacaagac cagaagtgct gagcatggag attcaaattc taaattttgt gcactttaga900ttatcggttc ctaccaccaa aacatttctg aggcggttca ttaaagcagc tcaagcttcg960tacaaggtgc ctttcattga actggagtat ttagcaaact atctcgccga attgacactg1020gtggaatata gtttcctaag gttcctgcca tcactaattg ctgcttcagc tgttttccta1080gcccgatgga cactcgacca aactgaccat ccttggaacc ctactctgca acactacacc1140agatatgagg tagctgagct gaagaacaca gttctcgcca tggaggactt gcagctcaac1200accagtggct gtactctcgc tgccacccgt gagaaataca accaaccaaa gtttaagagc1260gtggcaaagc tgacatctcc caaacgagtc acatcactat tctcaagatg a 1311
<210>2<211>436<212>PRT<213>拟南芥<220>
<221>MISC_FEATURE<223>以录入号NP_568248登载的序列变体在第284位含有精氨酸而非脯氨酸，在第432位含有苯丙氨酸而非丝氨酸<400>2Met Tyr Cys Ser Ser Ser Met His Pro Asn Ala Asn Lys Glu Asn Ile1 5 10 15Ser Thr Ser Asp Val Gln Glu Ser Phe Val Arg Ile Thr Arg Ser Arg20 25 30Ala Lys Lys Ala Met Gly Arg Gly Val Ser Ile Pro Pro Thr Lys Pro35 40 45Ser Phe Lys Gln Gln Lys Arg Arg Ala Val Leu Lys Asp Val Ser Asn50 55 60Thr Ser Ala Asp Ile Ile Tyr Ser Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asn Ile65 70 75 80Lys Ala Asn Arg Lys Cys Leu Lys Glu Pro Lys Lys Ala Ala Lys Glu85 90 95Gly Ala Asn Ser Ala Met Asp Ile Leu Val Asp Met His Thr Glu Lys100 105 110Ser Lys Leu Ala Glu Asp Leu Ser Lys Ile Arg Met Ala Glu Ala Gln115 120 125Asp Val Ser Leu Ser Asn Phe Lys Asp Glu Glu Ile Thr Glu Gln Gln130 135 140Glu Asp Gly Ser Gly Val Met Glu Leu Leu Gln Val Val Asp Ile Asp145 150 155 160Ser Asn Val Glu Asp Pro Gln Cys Cys Ser Leu Tyr Ala Ala Asp Ile165 170 175Tyr Asp Asn Ile His Val Ala Glu Leu Gln Gln Arg Pro Leu Ala Asn180 185 190Tyr Met Glu Leu Val Gln Arg Asp Ile Asp Pro Asp Met Arg Lys Ile195 200 205
Leu Ile Asp Trp Leu Val Glu Val Ser Asp Asp Tyr Lys Leu Val Pro210 215 220Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Val Asn Leu Ile Asp Arg Phe Leu Ser Asn225 230 235 240Ser Tyr Ile Glu Arg Gln Arg Leu Gln Leu Leu Gly Val Ser Cys Met245 250 255Leu Ile Ala Ser Lys Tyr Glu Glu Leu Ser Ala Pro Gly Val Glu Glu260 265 270Phe Cys Phe Ile Thr Ala Asn Thr Tyr Thr Arg Pro Glu Val Leu Ser275 280 285Met Glu Ile Gln Ile Leu Asn Phe Val His Phe Arg Leu Ser Val Pro290 295 300Thr Thr Lys Thr Phe Leu Arg Arg Phe Ile Lys Ala Ala Gln Ala Ser305 310 315 320Tyr Lys Val Pro Phe Ile Glu Leu Glu Tyr Leu Ala Asn Tyr Leu Ala325 330 335Glu Leu Thr Leu Val Glu Tyr Ser Phe Leu Arg Phe Leu Pro Ser Leu340 345 350Ile Ala Ala Ser Ala Val Phe Leu Ala Arg Trp Thr Leu Asp Gln Thr355 360 365Asp His Pro Trp Asn Pro Thr Leu Gln His Tyr Thr Arg Tyr Glu Val370 375 380Ala Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu Ala Met Glu Asp Leu Gln Leu Asn385 390 395 400Thr Ser Gly Cys Thr Leu Ala Ala Thr Arg Glu Lys Tyr Asn Gln Pro405 410 415Lys Phe Lys Ser Val Ala Lys Leu Thr Ser Pro Lys Arg Val Thr Ser420 425 430Leu Phe Ser Arg435<210>3<211>654<212>DNA
<213>Oryza sativa<400>3cttctacatc ggcttaggtg tagcaacacg actttattat tattattatt attattatta60ttattttaca aaaatataaa atagatcagt ccctcaccac aagtagagca agttggtgag120ttattgtaaa gttctacaaa gctaatttaa aagttattgc attaacttat ttcatattac180aaacaagagt gtcaatggaa caatgaaaac catatgacat actataattt tgtttttatt240attgaaatta tataattcaa agagaataaa tccacatagc cgtaaagttc tacatgtggt300gcattaccaa aatatatata gcttacaaaa catgacaagc ttagtttgaa aaattgcaat360ccttatcaca ttgacacata aagtgagtga tgagtcataa tattattttc tttgctaccc420atcatgtata tatgatagcc acaaagttac tttgatgatg atatcaaaga acatttttag480gtgcacctaa cagaatatcc aaataatatg actcacttag atcataatag agcatcaagt540aaaactaaca ctctaaagca accgatggga aagcatctat aaatagacaa gcacaatgaa600aatcctcatc atccttcacc acaattcaaa tattatagtt gaagcatagt agta 654<210>4<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>序列PRM582<400>4ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgtat tgctcttctt cgatgc56<210>5<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PRM583<400>5ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg cttggtgtca tcttgagaat ag5权利要求
1.用于增加植物产量的方法，其包括将细胞周期蛋白A核酸，优选地编码细胞周期蛋白A蛋白的核酸导入植物，该细胞周期蛋白A核酸有效地连接了种子偏爱的启动子。
2.权利要求1的方法，其中所述植物产量选自下列中的一项或多项各相对于对应的对照植物而言，有增加的种子重量、增加的饱满种子数目、增加的种子数目、增加的种子大小、增加的收获指数、增加的千粒重和经修饰的种子组成。
3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞周期蛋白A蛋白包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL构成的基元。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述细胞周期蛋白A核酸是选自细胞周期蛋白A2；1、细胞周期蛋白A；2；2、细胞周期蛋白A2；3和细胞周期蛋白A2；4的细胞周期蛋白A2。
5.权利要求4的方法，其中所述细胞周期蛋白A2包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL构成的基元和由ELTLV/I/T/M D/E/MY T/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS构成的、具有残基(--T-----F--F---)中的至少两个残基的基元。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述细胞周期蛋白A是选自下列的细胞周期蛋白A序列变体(i)细胞周期蛋白A核酸的功能性部分；(ii)能和细胞周期蛋白A核酸/基因杂交的序列；(iii)细胞周期蛋白A核酸/基因的变通剪接变体；(iv)细胞周期蛋白A核酸/基因的等位基因变体；(v)由于遗传密码的简并性产生的变体；和(vi)细胞周期蛋白A蛋白的同源物、衍生物和活性片段。
7.权利要求6的方法，其中(i)至(v)的细胞周期蛋白A变体能够编码包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL构成的基元和由ELTLV/I/T/M D/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS构成的、具有残基(--T-----F--F---)中至少两个残基的基元的蛋白质。
8.权利要求6的方法，其中所述(vi)的细胞周期蛋白A变体包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL构成的基元和由ELTLV/I/T/MD/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS构成的、具有残基(--T-----F--F---)中至少两个残基的基元。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述种子偏爱的启动子是在胚乳中具有活性的启动子。
10.权利要求9的方法，其中所述启动子是谷醇溶蛋白启动子。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述增加的产量在最适和亚最适的生长条件下获得。
12.权利要求11的方法，其中所述亚最适生长条件包括非生物逆境条件，例如盐逆境。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、向日葵、芸苔、甘蔗、紫花苜蓿、粟、大麦、油籽油菜(rapeseed)、高粱和棉花。
14.可通过权利要求1至13中任一项的方法获得的植物。
16.构建体，其包含(i)编码下述蛋白质的核酸，该蛋白质包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL构成的基元和任选地另外包含由ELTLV/I/T/MD/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS构成的、具有残基(--T-----F--F---)中至少两个残基的基元；(ii)种子偏爱的启动子；和可选地(iii)转录终止子序列。
16.权利要求15的构建体，其中所述种子偏爱的启动子是在胚乳中有活性的启动子。
17.权利要求16的构建体，其中所述启动子是谷醇溶蛋白启动子。
18.在种子偏爱的启动子控制下表达细胞周期蛋白A的植物，其中所述细胞周期蛋白A包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL构成的基元以及可选地另外包含由ELTLV/I/T/M D/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS构成的、具有残基(--T-----F--F---)中至少两个残基的基元，该植物和相应的野生型植物以及和组成型表达细胞周期蛋白A的转基因植物相比，具有增加的产量。
19.权利要求18的植物，其中所述种子偏爱的启动子是在胚乳中有活性的启动子。
20.权利要求19的植物，其中所述启动子是谷醇溶蛋白启动子。
全文摘要
本发明涉及通过将细胞周期蛋白A的核酸，优选地编码细胞周期蛋白A蛋白的核酸导入植物来增加植物产量的方法，该细胞周期蛋白A的核酸有效地连接至种子偏爱的启动子上。通过使用该方法，在最适和亚最适生长条件下可增加植物的产量。由该方法生成了相对于相应的野生型植物和相对于组成型地表达细胞周期蛋白A的转基因植物而言，具有增加的产量的植株。
文档编号A01H5/00GK1906304SQ200480040587
公开日2007年1月31日 申请日期2004年12月22日 优先权日2003年12月22日
发明者V·弗朗卡德, V·米罗诺夫 申请人:作物培植股份有限公司