专利名称：抑制农作物中黄单胞菌感染的生物免疫－攻击素组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复合型攻击素，它来源于生物提取混合物，用于在农作物中控制和预防致植物病的黄单胞菌(Xanthomonad)感染。本发明是以使用来自非致植物病的黄单胞菌属种(Xanthomonasspp)、哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)和来自植物丝兰萃(Yuccaschidigera)的生物提取物的组合混合物针对致植物病的黄单胞菌引起抗性的原理为基础。本方法是环保的，并且提供了针对许多黄单胞菌属种及其致病变种的植物保护。
背景技术：
黄单胞菌属(Xanthomonas Dowson 1939)包括多组革兰氏阴性、专性需氧、非发酵的杆菌，它们可通过单极生鞭毛运动，并能合成溴化黄色色素，该色素被称为黄单胞菌黄素。所有已报道的该菌属的菌株均被报道与植物相关，并且大部分对特定的植物宿主具有致病性。根据微生物学分类，该菌属可被分为至少五个单独的菌种野油菜黄单胞菌(X.compestris)，草莓黄单胞菌(X.fragariae)，葡萄酒黄单胞菌(X.ampelina)，白纹黄单胞菌(X.albilineans)和地毯草黄单胞菌(X.axonopodis)(Young，K.M.，Due D.w.，Bradbury J.F.et al.1978.Aproposed nomenclature and classification for plant pathogenic bacteria.N.Z.J Agric Res.21153-177；Vauterin，L.，Yang，P.，Hoste，B.et al.1992.Taxonomy of xanthomonads from cereals and grasses，based onSDS-PAGE of proteins，fatty acid analysis and DNA hybridization.J.Gen.Microbiol.1381467-1477)。
在自然界中，这些细菌基本上是独立生存的，构成根际和叶际微生物区系的一个大群(Vauterin，L.，Yang，P.，Alverez A.et al.1996.Identification of non-pathogenic Xanthomonas strains associated withplants.Syst.Appl.Microbiol.1996-105)。已知许多黄单胞菌属种是致植物病的，可引起破坏性的农作物疾病，如在多种柑桔属种(Citrusspp)中出现的柑桔溃疡，柑桔的细菌性叶斑病以及甘蔗中的叶鳞病(leaf scaled disease)(Bradbury，J.F.1986.Xanthomonas Dowson 1939，187.Pages 198-260.Bacteria.CAB International Mycological Institute，Slough，England)。
尽管就与黄单胞菌的致病菌种相关的遗传致病因子而论已有许多出版物，但是涉及对集群的入侵和生物膜相互作用的基本模式的文献非常少。黄单胞菌属种的致病菌株的最可能的入侵位点是通过气孔或者通过伤口进入到植物的叶或果实中(Zubrzycki，H.M.andDiamante，D.Z.A.1987.Relationship between the amount of theinoculum and the infection in the fields.Pages 379-382 inProc.Int.Soc.Citriculture，Sao Paulo，Brazil；Schubert T.S.，Rizvl，S.A.Sun.X etal.2001.Meeting the challenge of eradicating citrus canker inFlorida-Again.Plant Disease 85340-356)。但是，通过气孔的天然入侵可能要求较高的接种源。该浓度较在健康叶际条件下正常能获得的浓度高(Pruvost，o.，Boher，B.，Brocherieux M.，et al.2001.Survival ofXanthomonas axonopodis pv.Citri in leaf lesions under tropicalenvironmental conditions and simulated splash dispersal of inoculum.Phytopathology 92336-346)。因此，该微生物入侵的基本模式可能主要通过植物的损伤区(不为理论确认)。该损伤可通过机械手段或者通过昆虫引起的损伤出现。
控制黄单胞菌属种感染植物的现有方法包括使用含有铜的喷雾剂。同样该喷雾剂也可用来在表面改变某些柑橘果实上的溃疡损伤。但是，由于喷雾剂具有毒性，因此使用该喷雾剂受到一定的限制。另外，一些黄单胞菌属种对于这种含铜试剂已产生了抗性(Gardan，L.，Brault，T.，and Germain E.1993.Copper resistance of Xanthomonascampestris pv.Juglands in French walnut orchards and it associationwith conjugative plasmids.Acta Hort.(ISHS)311239-265)。因此，先验的结果表明许多黄单胞菌属种对含铜喷雾剂具有抗性。这可能不仅包括地毯草黄单胞菌柑桔致病变种—柑桔溃疡的病原。另外，已表明使用这种喷雾方法可加重柑桔细菌性斑点病的传播(Gottwald，T.R.，Graham，J.H.，and Riley T.D.1997.The influence of spray adjuvantson exacerbation of citrus spot.Plant Disease.811305-1210)。
在控制与黄单胞菌相关的疾病方面，大部分国家都采用了颇多根除方案。最流行的是Florida的针对柑桔溃疡的根除方案。一方面严格执行使用多种试剂的控制性净化作用，Florida法也包括除去及破坏在感染区的特定半径内被感染的树木。对于该方法的一个担忧是除去这些被感染的树木的方法可能有助于细菌的扩散。但是，控制措施不是很成功，并且对于控制机构和柑橘园主而言都非常昂贵。因此，需要寻求方便经济地控制该疾病的其它方法。
在自然界中，许多根际和叶际微生物区系具有这样的特征它们通过竞争营养物质或者释放损伤或杀伤可能的病原体的因子使得一些致病细菌菌种保持平衡。该特征集中在生物控制的概念上。自从20世纪90年代初期，大量努力均集中在使用可分泌针对该病原体的杀伤因子的有机体或针对该病原体更严格地竞争营养物从而竞争性阻止更多病原体菌种的生长的有机体来控制真菌性和细菌性疾病。
尽管生物控制的概念在控制许多真菌性疾病上非常有效，但是最近生物控制才开始集中在黄单胞菌相关的感染上。例如，已在接近宿主植物的土壤中控制某些致病性黄单胞菌属种的根际中鉴定了某些以原生动物为食的细菌(Habte，M and Alexander，M.1975.Protozoa asagents responsible for the decline of Xanthomonas campestris in soil.Appl.Microbiol.29(2)159-164)。到目前为止，这种有机体还没有用来对抗黄单胞菌相关的疾病。相反，黄单胞菌已作为生物控制剂用于控制害草。野油菜黄单胞菌早熟禾致病变种(Xanthomonas campestris pv.poae)被用作一年生莓系属的牧草的生物控制剂(Imaizumi，S.，Tateno，A.，Morita，K.，Fujimori.1999.Sensonal factors affecting the control ofannual bluegrass(Poa annua)with Xanthomonas campestris pv.poaeBiol.Control 1618-26)。
某些情况下，致植物病的微生物自身的入侵会在植物中诱导防御机制，以预防进一步损伤。在一些农作物中大多数损伤并不会被感染，这是由于植物自身的防御系统。现有的许多出版物证实一些根际微生物可在植物中诱导针对根部和叶部疾病的系统抗性。例如，促进植物生长的根瘤菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)可在黄瓜中诱导针对炭疽病(Wei，G.，Kloepper，J.W.，and Tuzun，S.1991.Induction of systemic resistance ofcucumber to Colletotrichum orbiculare by select strains of plant growthpromoting rhizobacteria.Phytopathology 811508-1512)和黄瓜花叶病毒(Raupach，Gs.，Liu，L.Murphy K.F.et al.1996．Induced systemicresistance in cucumber and tomato against cucumber mosaiccucumovirus using plant growth-promoting rhizobacteria.PlantDisease.80891-894)的系统抗性。
利用植物防御机制的诱导，来自多种非植物致病性微生物(主要参与堆制肥料的真菌和细菌)的提取物已用于对抗多种致植物病的微生物，前提是先诱导抗性，然后暴露于非植物致病性微生物的提取物中。该制剂在美国专利No.6,326,016中得以描述。
事实上，与合成堆肥茶相关的微生物的代谢物在控制某些最具有破坏性的与黄单胞菌属种相关的疾病(如柑桔溃疡)上非常有效。这在健康柑桔树上作为防范措施更为成功(Ozores-Hampton，M.O.andObreza，T.A..2000.A composted waste use on Florida cropsA Review.International Composting Symposium，Nova Scotia)。另外，已有的证据表明成团泛菌(Pantoea agglomerans)菌株E278Ar可诱导针对野油菜黄单胞菌假辣根致病变种(X.campestris pv.armoraciae)的系统抗性，该变种可在萝卜中诱导叶斑病(Han，D.，Y.，Colin，D.L.，Bauer，W.D.，and Hoitink，H.A.J.2000.A rapid bioassay for screeningrhizosphere microorganisms for their ability to induce systemicresistence.Phytopathology 90327-332)。
早在1991年，许多研究就集中在这类微生物引起针对特定致植物病原体的植物抗性的作用上。将非致病性微生物暴露给植物所诱导的这种类型的系统抗性被称为诱导性系统抗性(ISR)(Kloepper，J.W.，Tuzun，S.，and
J.A.1992.Proposed definitions related to induceddisease resistance.Biocontrol Sci.Techno1.2349-351)。它不同于由引起坏死的植物病原体所诱导的系统获得性抗性(SAR)(Delaney，T.P.1997.Genetic dissection of acquired resistance to disease.Plant Physiol.1135-12；Ryals，J.，Neuenschwander，U.H.，Willits，M.G.et.al.1994.Systemic acquired resistance.Plant cell 81809-1819)。
基于对ISR和SAR理解的快速发展，已经开发了几种引发植物防御反应的合成型化合物。已开发了其中的一种化合物苯并噻二唑(acibenzolar-S-methyl，Actigard 50W，Bion 50WG，Syngenta，BaselSwitzerland)。这些化合物在控制西红柿中地毯草黄单胞菌茄科致病变种(X.axonopodis pv.vesicatoria)所诱发的细菌性斑点病上不是很成功(Louws，F.J.，Wilson，M.，Campbell，H.L.，et al.2001.Field controlof bacterial spot and bacterial speck of tomato using a plant activator.Plant Disease.85481-488)。不存在其它激活剂。但是，在使用合成型激活剂方面的主要担忧是在控制田间应用期间疾病抗性的诱导上长期的植物毒性和生物活性。
存在天然的植物抗性激活剂。这类激活剂中的其中一种是核黄素。已证实核黄素可作为有效的系统抗性引发剂起作用，并可作为植物中的激活剂通过诱导发病相关基因的表达的信号传导通路起作用(Dong，H.and Beer，S.V.2000.Riboflavin induces disease resistancein plants by activating a novel signal transduction pathway.Phytopathology 90801-811)。将核黄素作为系统抗性引发剂的直接应用局限于实验室实验。目前核黄素在田间多种植物上的使用还没有正式实施。
同样，已就硅(Si2)在引发针对疾病的植物抗性的作用上对其进行了研究。这种作用是有争议的(Werner D.，and Roth R.1983.Silicametabolism.Pages 683-694 inInorganic Plant Nutrition.A.Luchiand R.L.Bieleski，eds.Sringer-verlag，Berlin；and Epstein，E.1994.The anomaly of silicon in plant biology.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9111-17)。但是，这种争议考虑到对植物的被动机械性保护。然而，Si2在使某些双子叶植物免于感染真菌性疾病上是有效的，并且针对这种入侵病原体表现出SAR的某些方面(Bélanger，R.R.，Bowen，P.A.，Ehret，D.L.et al.1995.Soluble siliconIts role in crop and diseasemanagement of green house crops.Plant Disease.79329-336)。
另外，Fawe等人已提供了提示Si2可通过诱导黄瓜合成诸如黄酮醇去糖基型鼠李黄素(flavonol aglycone rhamnetin)的植物抗毒素使黄瓜免受终极腐霉菌(Pythium ultimum)感染的证据(Fawe，A.，Abouu-zaid，M.，Menzies，J.G.et al.1998.Silicon-mediatedaccumulation of flavonoid phytoalexins in cucumber.Phytopathology88396-401)。
尽管该试剂在用于使植物免受疾病感染方面存在争议，本领域的普通技术人员还是能够确定可将该试剂纳入本发明中。但是，已知用于本发明的产品中的来源于丝兰萃的提取物具有多种植物生长促进剂和植物保护刺激剂(Zielgler，D.M.1990.Flavin-containingmonooxygenasesenzymes adapted for multisubstrate specificity.Trends in Pharmacol.Sci.11321-324；Ziegler，D.M.1993.Recentstudies on the structure and function of multisubstrateflavin-containing monooxygenases.Ann.Rev.Pharmacol.Toxicology33179-199；Zhoa，Y.，Christensen，S.K.，Frankhauser，C.，et al.2001.Arole for flavin monooxygenase-like enzymes in auxin biosynthesis.Science 291306-309)。
在生物控制方面，许多木霉菌属种作为针对植物真菌性疾病的生物控制剂使用，并表现出引发针对该病原体的SAR的能力。已鉴定出来源于真菌有益木霉菌(Trichoderma virens)的这类引发剂中的一种，并在美国专利No.6,242,420中描述。但是，它的田间应用目前尚未解决，并且它基本上针对于根际相关的真菌性植物疾病。
木霉菌属的许多真菌合成杀伤或抑制多种需氧菌和厌氧菌的生长的物质。基于该原则，有益木霉菌(T.virens)作为植物病原体的真菌寄生物和合成抗生素的拮抗剂使用，并且被证实是针对多种土壤引发的根部疾病的有效的生物控制剂(Reyes A.A.1985.Suppression ofFusarium and Pythium pea root rot by antagonistic microorganisms，Phvtoprotect.6623-29)。另外，有益木霉菌的原始培养物和培养过有益木霉菌的培养基已作为针对多种致植物病的真菌的生物控制剂来使用，参见Tahvonen等人的美国专利No.5,968,504。使用该有机体的一个主要问题该制剂的稳定性；因此，该有机体的生命力受到了影响。该制剂在美国专利No.4,724,147中描述。同样，来自木霉菌属种的提取物与其它添加的微生物提取物一起使用，以在植物中诱导针对致植物病的微生物的抗性，参见美国专利No.6,326,016。
木霉菌属种合成大量被认为是抗生素的物质，包括胶霉毒素、绿胶霉素、氯粘帚霉素(gliovirin)和萜烯七酯酸。萜烯七酯酸是有效的抗生素和抗真菌剂(Ghisalberti，E.L.and Sivasithamparan，K.1991.Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp.Soil Biol.Biochem.231011-1021)。
许多木霉菌属种合成多种具有较强抗生素活性的产物。这类代谢物中的一种被称为哌珀霉素(peptaibols)。它们是范围在15到20个氨基酸的短链多肽。它们的大部分氨基酸是非典型的，如羟脯氨酸、异缬氨酸、乙基正缬氨酸和氨基异丁氨酸。正如名字所提示的那样，哌珀霉素一般被认为是蛋白抗生素。哌珀霉素的抗微生物活性被认为是由于它可破坏脂质膜的完整性的能力所引起的，因此，针对革兰氏阴性菌和真菌更有效。到目前为止，特征最为清楚的哌珀霉素在真菌的木霉菌属和翅孢壳菌属(Emericellopsis)中所公开。
在本发明中，来自哈茨木霉菌的哌珀霉素包括哈木菌素(trichorzianin)、trichokindin、trichorzine和harzianin(EI Hajji，M.，Rebuffat，S.，Lecommandeur，D.，and Dodo，B.1987.Isolation andsequence determination of trichorzianines A antifungal peptides fromTrichoderma harzianum.Int J Peptide Protein Res.29207-215；Lida A，Sanekata，M.，Fugita，T.et al.1987.Fungal metabolites XVI.Structureof new peptaibols，trichorzins I-VI from the fungus TrichodermaHarzianum.Int J Peptide Protein Res.29207-215；Rebuffat，S.，EIHajji，M.，Henning，P.et al.1989.Isolation sequence，and conformationof seven trichorzianines B from Trichoderma harzianum.Int J PeptideProtein Res.34200-210；Sawa，R.，Mori，Y.，Inuma，H.1994.Harzianicacid，a new microbial antibiotic from a fungus.J.Antibiotics(Tokyo)47731-732)。本发明利用了哈茨木霉菌的该代谢物的产生。
哈茨木霉菌菌株在某些植物中被用作针对线虫和真菌性疾病的生物控制剂，并被指认为植物促进剂(引自美国专利No.6,475,772)。同样，哈茨木霉菌的某些菌株无需要求临时容许量(temporarytolerance)，并在农作物中作为与根际相关的真菌性疾病的生物控制剂使用(Hasan，S.B.2000.Trichoderma harzianum Rifai Strain T-39；Exemption from the requirements of a Tolerance，Federal Register65121，pp.38753-38757)。然而，关于它针对叶际病原体-特别是针对属于黄单胞菌属的病原体的文献报道很少。
将木霉菌属种作为针对真菌植物病原体的生物控制剂更为成功。引起该作用的主要机理包括入侵的病原体和植物宿主的微寄生关系，它引起一连串事件，包括引起植物宿主细胞的防护性相互作用以及被所使用的木霉菌属种对目标真菌病原体的直接降解。
由木霉菌属种所分泌的分泌型壳多糖酶(chintanase)和葡聚糖酶(glucanase)(β-1，3-葡聚糖酶和β-1，6-葡聚糖酶)不仅会引起降解其它微寄生物，而且还在引发植物细胞防御机制中起作用。尽管据报道该葡聚糖酶可溶解真菌和酵母壁，但是该酶还被报道可溶解细菌(Dela Cruz，J，Pintor-Toro，J.A.，Benítez，T.，and Llobell，A.1995.Purfication and characterization of an endo-β-1，6-glucanase ininducing host cell defense response remain obscure)。尽管如此，壳多糖酶(chintanase)、β-1，3-葡聚糖酶和β-1，6-葡聚糖酶在诱导宿主细胞防御反应中的作用仍然不清楚。
使用许多木霉菌属种的一个主要问题是它们合成可损伤目标宿主植物的毒植物素。这类毒素中的其中一种是绿胶霉素(Jones，R.W.，W.T.Lanini，and J.G.Hancock.1988.Plant growth response to thephytotoxin viridiol produced by the fungus Gliocladium virens.WeedSci.36683-687；Weindling，R.，and O.H.Emerson.1936.The isolationfo a toxin substance from the culture filtrate of Trichoderma.Phytopathology 261068；Howell，C.R.，and R.D.Stipanovic.1984.Phytotoxicity to crop plants and herbicidal effects on weeds of viridiolproduced by Gliocladium virens.Phytopathology 741346-1349)。在这方面，哈茨木霉菌也合成绿胶霉素。
在这类真菌中，绿胶霉素与固醇合成有关，在1994年，Howell和Stipanovic发现当在添加的类固醇抑制剂存在时培养真菌，绿色粘帚霉(Gliocladium virens)的绿胶霉素产量显著减少。同样，据报道这类真菌不仅绿胶霉素(作为绿毛菌醇)产量减少，而且该菌种的植物毒性也降低(Howeel，C.R.，and Stipanovic R.D.1994.Effect of sterolbiosynthesis inhibitors on phytotoxin(viridin)production byGliocladium virens in culture.Phytopathology 84969-972)。诱导抑制绿毛菌醇的方法在美国专利No.5,882,915中得以较为详细的描述。根据本发明，本领域的微生物学家可快速发现这些方法可运用于本发明。但是，由于本发明所采用的提取方法，哈茨木霉菌的回收产物还含有非常少量的绿胶霉素和绿毛菌醇—如果存在的话。
根据本发明，我们最初使用来自佛罗里达州的拉哥(Largo，FL)的Venture Biodiscovery的哈茨木霉菌的一个菌株的提取物。该菌株MBMH-21首次从德克萨斯州的米申(Mission，Texas)的土壤样品中分离获得。但是，根据本发明，我们发现多种哈茨木霉菌效果良好。所使用的这些菌株包括哈茨木霉菌(美国典型培养物保藏中心(ATCC)No.20873)。其它容易从销售商以及哈茨木霉菌的新鲜土壤分离物获得的菌株也被用于本发明。
使用哈茨木霉菌生物提取物和/或完整的活的哈茨木霉菌(或者其它木霉菌属种)是基于上文所述的诱导性系统抗性现象。如上所述，当非致病性有机体被导入宿主中时(这激发一连串对抗致病性有机体入侵的防御反应)，就可观察到这种现象。植物暴露到相关的非致病性菌种可针对相关植物病原体引发ISR是理所当然的。根据本发明，我们使用非致病性黄单胞菌属种的提取物。下文本发明详细描述中将介绍这种应用。根据本发明，我们使用X.theicola和X.codiaei的提取物。这些有机体可从土壤和某些植物中分离得到。另外，它们可从诸如ATCC的保藏机构购买。
本发明的另外一个组分是植物丝兰萃的提取物。这类提取物包括皂苷。皂苷是许多植物合成的天然去污剂。皂苷具有去污剂或表面活性剂性质是因为它们含有水溶性组分和脂溶性组分。它们由脂溶性中心部分组成，该中心部分具有胆固醇结构或三萜系化合物结构，并且具有一条或多条水溶性碳水化合物的侧链。皂苷被用于多种食品、饲料、化妆品和饮料中。同样，它们还被指出在治疗多种疾病中具有治疗价值(Bingham，R.，Bellew，B.A.，Bellew J.G.1975.Yucca plantsaponin in the management of arthritis.J Appl Nutr.2745-50；Hartwell，J.L.1976.Types of anticancer agents isolated from plants.Cancer Treat Rep.601031-1067；Scarpato，R.，Bertoli，A.，Baccarati A.et al.1998.Different effects of newly isolated saponins on themutagenicity and cytotoxicity of the anticancer drugs mitomycin C andbleomycin in human lymphocytes.Mutat.Res.42049-54)。
皂苷作为增强剂与醛类联合使用以控制植物和动物病原体，参见美国专利No.5,639,794。丝兰萃和Y.Hedera的提取物在控制非水蜗牛和鼻涕虫上是有效的，参见美国专利No.5,290,557。很显然，加入皂苷可帮助混合物控制在多种植物中发生的真菌性疾病和疫病(引自美国专利No.5,639,794和6,482,770)。但是，据我们所知，本发明是首次针对黄单胞菌相关的植物/作物疾病使用丝兰萃提取物(含皂苷和其它成分)。
本发明的主要组分包括某些黄单胞菌属种的主要提取物。用于本发明的具体菌种包括X.theicola和X.codiaei。使用这些有机体是基于如上文所述使用荧光假单胞菌(P.fluorescen)的外膜组分在农作物中诱导ISR所观察到的原理。与革兰氏阴性菌病原体相互作用的动物和植物宿主均取决于一连串事件。脂多糖在诱导高敏反应和ISR上极其有效。本领域的普通技术人员将会认识到可使用更密切相关的目标宿主特异性疾病的这类提取物。但是，本研究提供的证据表明X.theicola和X.codiaei的提取物可在多种植物(即柑橘、西红柿和甘蔗)中引起高敏反应(HR)。另外，考虑到可能转化为感染性植物病原体，使用这些相对安全的非致病性黄单胞菌属种更为环保。
发明内容
本发明由将哈茨木霉菌、丝兰萃、X codiaei和X theicola的提取干物质复水形成生物免疫-攻击素，该攻击素引起针对致植物病的黄单胞菌的植物细胞宿主的先天性防御。生物免疫-攻击素指分散可引起入侵/暴露的宿主植物的天然防御的因子以对抗入侵的病原体的试剂。提取物可在多种铺展剂/粘着剂中复水，用于喷雾、滴注或种子处理。尽管可使用多种铺展剂/粘着剂，我们发现非离子性粘着剂SS 9(AgProSystems，Inc.)效果良好。本发明旨在提供易感植物免受黄单胞菌感染的保护作用。所提及的对易感植物的保护包括但不限于西红柿、柑桔(橙子、酸橙、柚子)、胡萝卜、甘蔗、假荆芥和大豆。
本发明的原理是提供环保的和不毒害植物的生物控制剂，该生物控制剂可预防和/或降低在农作物和植物上的致植物病的黄单胞菌属种所引起的损害。“生物控制剂”意为通过使用从有生命的有机体提取的天然产物，利用其对病原体感染的直接抗病活性和/或诱导的宿主植物的抗性，控制植物病原体。“天然产物”为天然来源的有机化合物，它在某一种有机体中是独特的，或者是少量紧密相关的有机体所共有的(包括所述有机体的二级代谢物)。
因此，本发明包括具有该特征、性质的物质的组合物以及将会在后文描述的组合物中所示例的组分之间的关系，本发明的范围将在权利要求书中指明。
具体实施例方式 采用不同的方法提取和制备哈茨木霉菌、丝兰萃、X codiaei和Xtheicola的提取物，但是，该提取方法一般为微生物领域的大部分技术人员所使用。同样，提取干物质的组合遵循重组形成终试剂的特定模式。
A.所使用的相关试剂的限制性分析 1.真菌提取 从佛罗里达州的拉哥的Venture Biodiscovery获得哈茨木霉菌的原始菌株(MBMH-21)。该菌株是在1998年和1999年的夏季从德克萨斯州的米申的柑桔林中所获得的土壤样品中分离得的。但是，我们发现可容易地使用多种哈茨木霉菌菌株。本发明的该产物的应用使用了ATCC的哈茨木霉菌(No.20873)。本发明中所使用的哈茨木霉菌菌株由微生物学家鉴定，并且将其形态学、化学和生长特征与从ATCC获得的哈茨木霉菌的典型菌种(它们也可用于本发明)(NO.20873、20848和20846)进行了比较。
本发明所使用的哈茨木霉菌的所有菌株均在液体培养基和固体培养基中培养。所使用的固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(Potato-Dextrose Agar，PDA)。为将我们的制品能用在商业上，该有机体通过常规发酵方法在液体培养基中生长，该液体培养基(pH6.8)由Czapec培养基组成，并添加了10％(w/v)的葡聚糖和0.1％(w/v)壳多糖组成。发酵在20L自动灭菌Nalgene瓶中进行，28℃一直搅拌。生长期取决于从固体马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)所获得的培养物的原始接种物的多少。基本上，初始接种物为2.8g/L。本领域的普通技术人员很易发现可使用其它发酵培养基以实现大规模培养哈茨木霉菌。
在达到为获得最初稳定期的培养时间后，6000×g离心收集菌丝体，并将所得到的上清液与沉淀小心分离开。用50mM磷酸盐缓冲液充分洗涤回收得到的沉淀。回收得到的物质125℃干燥3到6个小时。同时，合并回收得到的上清液，4℃储存备用。
步骤A.上清液的抽提 在4℃时用硫酸铝(饱和度为80％)沉淀法处理回收得到的上清液，并通过离心回收沉淀，然后用50mM乙酸钾缓冲液(pH5.5)彻底透析。采用De La Cruz等人所描述的方法(De La Cruz，J，Pintor-Toro，J.A.，Benítez，T.，and Llobell，A.1995.Purification andcharacterization of an endo-β-1，6-glucanase from Trichodermaharzianum that is related to its mycoparasitism.J.Baceriol.1771864-1871)将所得到的透析物用乙醇沉淀的石耳素处理。离心回收被石耳素所吸收的物质，70mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗涤沉淀，并用添加了1mM苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)和1mM叠氮化钠的50mM乙酸钾缓冲液重悬。37℃过夜孵育混合物，并且一直搅拌。将石耳素消化后，把混合物12,000×g离心10分钟。然后将澄清的溶液用25mM咪唑-HCl缓冲液(pH7.4)透析。4℃下使用氮气将回收得到的透析液使用Amicon超过滤单位中的PM-100 Amicon膜浓缩10倍。回收得到的浓缩物真空干燥，-80℃保存，用以检测葡聚糖酶活性。采用De La Cruz等人所描述的方法对β-1，3-葡聚糖酶和β-1，6-葡聚糖酶进行检测(上文已引用)。
步骤B干菌丝体的提取 液氮冷冻40g到150g(干重)物质并用组织碾磨器碾磨，然后破裂物质。两种抽提均在干物质上进行。将该物质加入1L由乙氰和乙醇(3∶1)组成的有机溶剂，并在室温下孵育2.5到4小时，然后离心。所回收得到的抽提物30,000×g离心30分钟，并小心去除上清液。
真空干燥上清液。采用标准方法(Burdon，R.H.and P.H vanKnippenberg(Eds)Laboratory techniques In Biochemistry andMolecular Biology，Volume 17Application of HPLC in Biochemistry.1987.ElsevierNew York)将干的残留物进行蛋白质、碳水化合物、类固醇以及脂质分析。采用Jones和Hancock的方法(Jones，R.W andHancock，J.G.1987.Conversion of viridin to viridiol by viridinproducing fungi.Can.J.Microbiol.33913-966)将提取物进一步进行绿毛菌醇分析。采用Brükner所描述的方法(Brükner，H.1984.Methods for the rapid detection，isolation and sequence determinationof Peptaibols and other aib-containing peptides of fungal orgin.Chromatographia 19188-199)对哈茨木霉菌培养物的提取干物质进行哌珀霉素分析。
在配备ISCO V4检测器的ISCO 2360 HPLC系统上进行色谱分析。使用前文提及的参比物、胶霉毒素、绿胶霉素、绿毛菌醇和萜烯七酯酸，在所建议的参比柱上使用优选的洗脱流动相进行分级分离。回收样本的分析结果在表1中示出。
2.丝兰提取法 尽管本领域普通技术人员知道可以购买多种丝兰萃提取物，但是在我们的制剂中，我们优选使用丝兰萃幼苗(平均高度大约≤1m)的叶和根。德克萨斯州的Willis的Emerald庄园收集了丝兰萃的叶和根样本并提供给我们。
使用最少量的水在碾磨器中将新鲜叶初步碾磨。破裂后，加入100mL 95％乙醇，然后在4℃下使用碾磨器再次将该叶破裂20分钟。该提取之后，使用No.2 Whatman针头式过滤器过滤该匀浆物，并在4℃将滤液20,000×g离心20分钟。去除所得到的上清液，并使用BüchiR-300 Rotavapor蒸发器进行低温蒸发(30℃)。所得到的残留物用40％乙醇重悬，并在4℃储存备用。
使用相同的方法用小刀将丝兰萃的根初步切碎，然后与相同体积的甲醇∶丁醇(1∶1v/v)一起放入剪切碾磨器。匀浆后，如上文所述将物质离心并过滤。过滤之后，如上文所述将所得到的滤液蒸发。使用最少量乙醇回收该残留物，并在4℃储存备用。
我们对这些提取物的主要关注在于类固醇类的皂苷。尽管本领域的普通技术人员可想到相当多用于定性分析皂苷部分的方法，但是我们还是采用了Wei的方法(Wei，J.1998.Determination of steroidalsaponins in Rhizoma prides by UP-HPLC.Yak Xu Bad 33465-468)。在上文所描述的ISCO系统上，使用对称的C8柱进行色谱分析。用于分离的流动相为流速为1.0mL/min的乙氰∶水(42∶58v/v)。洗脱物在203nm检测。
回收了大量的皂苷。基于该分析(一直进行着)，鉴定出几种已知的皂苷，并且在特征上它们与已出版的报道中所回收到的丝兰萃中的皂苷没有差异。本发明所使用的皂苷参见表2。
除了皂苷，丝兰萃含有多种活性成分。我们现在检测这些具有生物活性的化合物，为的是进一步支持本发明的目的。
3.黄单胞菌属种提取 根据本发明，我们使用了X codiaei和X theicola。这些微生物易于从很多细胞保藏机构获得。在本发明中，我们集中在使用采用标准方法获得的细菌膜片段的提取物。首先在固体73 YGC琼脂上培养所使用的黄单胞菌属种。为大规模生产，有机体分别在由10g/L酵母提取物、10g/L葡萄糖、5g/L CaCO3和0.1g/L酪蛋白组成的液体培养基(pH6.8)中通过发酵培养。尽管在该发酵过程中可使用其它液体培养基，但是在本发明中所使用的培养基效果很好。如上所述，发酵在Nalgene瓶中进行，并且最初的接种物由3.1g/L YGC琼脂培养得到的相关细菌组成。在25℃持续搅拌下进行发酵。采用4℃下4,000×g离心20分钟回收相关细菌。使用10mM HEPES缓冲液(pH7.4)将回收得到的细菌洗涤两次，然后将回收得到的沉淀在-80℃储存，用以采用Vesy等人的方法(Vesy，C.J.，Kitchens，R.L.，Wolfbauer，J.J.et al.2000.Lipopolysaccharide-binding protein and phospholipid transferprotein release lopopolysaccharides from gram-negative bacterialmembrances.Infect.Immun.682410-2417)进行膜提取。采用已经建立的方法(Burdon，R.H.and P.H van knippenberg(Eds)1987.Laboratory techniques In Biochemistry and Molecular Biology，Volume 17Application of HPLC in Biochemistry.ElsevierNew York；Work，T.S.and E.Work(Eds.)1982.Laboratory techniques inBiochemistry and Molecular BiologyTechniques of Lipidology.ElsevierNew York)对回收得到的脂相关物质进行分析。
在平行实验中，可采用Severn等人所描述的热酚提取法(Severn，W.B.，Kelly，R.F.，Richards，J.C.，and Whitfield，C.1996.Structure ofthe core oligosaccharide in the serotype O8 lipopolysaccharide fromKlebsiella pneumoniae.J.Bacteriol.1781731-1741)从黄单胞菌属种中鉴定脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。
通过我们的提取方法，可回收大量脂质、磷脂和脂多糖。由于已知脂多糖(LPS)加重了病原体的攻击，因此我们集中对在本发明中所使用的黄单胞菌属种的LPS进行表征。对所回收到的LPS的阐述有一定的局限性，原因在于被表征的LPS是黄单胞菌属种的天然组分，而不是纯的化学物质。尽管一些黄单胞菌属种的一些LPS组分已经被表征(Ojanen，T.，Helander，I.M，Haahtela，H.，et al.1993.Outermembrane proteins and lipopolysaccharides in pathovars ofXanthomonas campestris.Appli.Environ.Microbiol.594143(Abstr.))。可鉴定组分的结果参见表3；但是，现在正对更多具体产物的分析进行研究。
表1.哈茨木霉菌(ATCC 20873)的被选组分的浓度
＝物质被进一步分析。
＝未检测。
表2.在丝兰萃的叶和根的提取物中回收得到的皂苷
＝未检测 表3.合并的Xanthomonas theicola和Xanthomonas codiaei的脂提取物 a数据用所鉴定的总脂肪酸的摩尔百分比表示。i＝同 B.生物免疫-攻击素的制剂(“本发明”) 本发明包括下列有关的生物提取物的适当混合 1.制备哈茨木霉菌本方法的第一步是如上所述在发酵环境下大量培养哈茨木霉菌。培养有机体一直到到达生长的最初的稳定期，这通过蛋白浓度测定。如上所述，离心收集菌丝体。如上文所述，将所回收得到的沉淀用液氮冷冻并进行用组织碾磨器碾磨，然后将物质破裂。使用回收物的多个样本用乙氰和乙醇(3∶1)抽提匀浆液，比率为400到600g匀浆液(湿重)/每升溶剂。提取物在一直搅拌最高达5个小时的条件下制备得到。将回收得到的提取物在4℃下30,000×g离心30分钟，并小心去除上清液。合并回收得到的上清液并真空干燥。干燥条件下保存该物质(在本文中称为THM)，以备用于下文所描述的制剂中。
2.制备丝兰萃提取物如上文所述将丝兰萃的叶和根破裂。简单地说，先将60到90g剪碎的叶悬浮于最少量的水中，然后用碾磨器在4℃下破裂。加入100mL 95％乙醇，然后在4℃下再次在碾磨器中破裂20分钟。该抽提后，用No.2 Whatman针头式过滤器过滤该匀浆物，并在4℃下将滤液20,000×g离心20分钟。去除所得到的上清液，并使用Büchi R-300 Rotavapor蒸发器进行低温蒸发(30℃)。保存所得到的干物质(本文中被称为YSL)，以备用于最终的制剂中。
使用相同的方法用小刀将丝兰萃的根初步切碎，然后与相同体积的甲醇∶丁醇(1∶1v/v)一起放入剪切式碾磨器。匀浆后，如上文所描述将物质离心并过滤。过滤后，如上文所述将所得到的滤液蒸发。干燥保存所回收的残留物(本文中被称为YSR)，以备用于最终的制剂中。
3.制备黄单胞菌属种用上文所述发酵方法分别培养X.theicola和X.codiaei。离心收集细菌，并将每一个种所回收得到的沉淀在FrenchPress中分别破裂。合并回收得到的物质并在一直搅拌的条件下用乙氰∶乙醇(3∶1)抽提4到6个小时。如上文所述将提取物离心并将所得到的上清液真空干燥。干燥保存回收得到的残留物(本文中被称为XSE)，以备用于最终的制剂中。
制备了产品的各种制剂，以鉴定在控制实验室实验中在预防或治疗黄单胞菌感染上有效的浓度。制剂如下列所示有所不同 制剂I##THM∶YSL∶YSR∶XSE##∶1∶1∶1∶1(干重，w/w/w) 制剂II##THM∶YSL∶YSR∶XSE##0.5∶1∶1∶1(干重，w/w/w) 制剂III##THM∶YSL∶YSR∶XSE##1∶1∶0.5∶0.5(干重，w/w/w) 制剂IV##THM∶YSL∶YSR∶XSE##1∶0.5∶0.5∶1(干重，w/w/w) 制剂V##THM∶YSL∶YSR∶XSE##0.5∶0.1∶0.2∶1(干重，w/w/w) 制剂VI##THM∶YSL∶YSR∶XSE##0.5∶0.1∶0.1∶1(干重，w/w/w) 根据给定比率将本发明的上述制剂混合。悬浮该制剂，用选择性粘着剂/铺展剂悬浮制剂以最终使用。使用SS9(AgroPro Systems，Inc.)我们获得了很大成功；但是我们使用了其它的粘着剂/铺展剂。不引起可观察到的植物毒性的每一种制剂的有效浓度确定如下 制剂I∶0.2g到1g/加仑铺展剂/粘着剂 制剂II0.2g到1g/加仑铺展剂/粘着剂 制剂III0.3g到2g/加仑铺展剂/粘着剂 制剂IV0.2g到2g/加仑铺展剂/粘着剂 制剂V0.5g到5g/加仑铺展剂/粘着剂 制剂VI0.5g到5g/加仑铺展剂/粘着剂 将制剂加入铺展剂/粘着剂并用手搅拌。大部分制剂易溶于SS 9中，但是浓度达到1g/加仑SS9的制剂1导致大量泡沫的形成。但是，可通过加入恰当的抗沫剂减少泡沫。
植物毒性检测 黄单胞菌感染大量农作物。我们的主要兴趣是使用本发明对各种破坏性黄单胞菌感染提供保护。因此，我们已将本发明的多种制剂喷洒在多种农作物中，例如西红柿(Lycopersicon esculentum)、橙树(Citrussinensis)、葡萄柚(Citrus paradisi)、胡萝卜(Daucus carota)、莴苣(Lactuca sativa)、柿子椒(Capsicum annuum)，最近也用于甘蔗(Saccharum officinarum)中。
植物毒性研究仍在进行。每个月都使用本发明的多种制剂对这些植物品种进行喷洒，每一种制剂喷洒不同品种。该检测是季节性的，检测了很多特征。尽管试验组与对照组相比，在秋天和春天处理柚子树和橙树的幼苗和成株并未表现出任何降低水果产量或延缓生长速度的迹象，本研究还进一步进行。
同样，在春天和秋天对柿子椒、萝卜和莴苣进行喷洒对这些蔬菜的生长或产量没有不良作用。一些证据表明对辣椒而言，产量似乎更高。但是，该研究仍在进行之中。
实施例 实施例1高敏反应的离体筛选 在柑桔属种原生质体上进行针对本发明的高敏反应以及病原体攻击。愈伤组织的原生质体来源于甜橙(citrus sinensis)、葡萄柚(citrusparadisis)和柠檬(citrus limon)的嫩枝条，并采用已建立的方法(Kyte，L and Kleyn，J(eds.)1996.Plants from test tubesAn introduction tomicroporpagation.3th Edition.Timber PressPortland，Oregon)常规制备。来源于所需柑桔属种移植物的愈伤组织来源的细胞和原生质体按如下方法制备培养愈伤组织细胞，然后用3％纤维素酶、0.5％软化酵素(macerase，溶于0.5M的甘露醇和蔗糖，最终渗透压为825mmole/kg)消化。在KM8p原生质体培养基中培养回收得到的原生质体。
将刚分离得到的原生质体(回收后48小时内)用于试验和对照研究。所选的所需原生质体的培养物暴露于多种浓度的不同制剂以及不同浓度的活性成分中。同样，吐温80、两性霉素B和核黄素也用于鉴定它们由阳性对照和阴性对照的原生质体释放过氧化氢(H2O2)的能力。采用已建立的方法(Jabs，T.，Tschpe，M.，Colling，C.，et al.1997.Elicitor-stimulated ion fluxes and O2 from oxidative burst are essentialcomponents in triggering defense gene activation and phytoalexinsynthesis in parsley.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944800-4805)通过检测由铁氰化物所催化的鲁米那氧化产生的化学发光，检测试验组和对照组的培养基中过氧化氢的产量。原生质体的活性通过二醋酸酯荧光素和碘化丙锭染色检测。
本发明使用甜橙、葡萄柚和柠檬的原生质体。本发明确实合成了相对大量的H2O2到原生质体的培养基中。在多数情况下，所使用的原生质体的结果在所使用的不同原生质体培养基之间相差不大。但是，就本发明的实施例1而言，我们提供了使用甜橙的原生质体的研究的结果。H2O2产生的结果参见表4。
基于已知的XACE的蛋白浓度，病原体地毯黄单胞菌柑桔致病变种(X.axonopodis[pv.]citri，XACE)(由德克萨斯大学的Marion Levy博士提供)的提取物终浓度在60μg/mL。如上文所述检测过氧化氢的释放。结果参见
图1。
表4.暴露于本发明并攻击了不同时间后甜橙的原生质体的培养基中过氧化氢的累积
不能检测。
＝以脂类浓度为基础。§＝以特定重力为基础。
在平行试验中，甜橙的原生质体培养物暴露于10μg/mL本发明的制剂V中4小时。通过瞬时离心回收原生质体，用原生质体培养基洗涤，重悬于新鲜培养基中并再培养24小时。培养后，将甜橙原生质体暴露给外膜。
图1.在加入XACE前用本发明(制剂V)处理的原生质体培养基中的过氧化氢的产量。实心三角形代表在重悬前用制剂V处理、不暴露于任何其它活性试剂的原生质体(对照组)。空心方块代表仅仅暴露于XacE.的原生质体。实心方块代表在给定时间内暴露于XacE前先用制剂V处理的原生质体。
尽管用于研究的黄单胞菌属种的使用以及流通受到美国农业部动植物卫生检疫局严格限制，但是我们仅仅使用易获得的黄单胞菌病检测本发明。目前，我们已许可将我们的产品用于抗柑桔溃疡和其它严重的黄单胞菌相关疾病的试验中。
同样，上文所描述的多种制剂已被用于这些研究中。但是，仅仅给出了制剂V的数据。其它制剂有着相似的结果；但是，当制剂V被加入本发明所用的铺展剂和粘着剂时，它具有较少的泡沫问题。
实施例II对黄单胞菌诱导的假荆芥的叶斑病的控制 将假荆芥(Nepeta cataria)用包括野油菜黄单胞菌的多种细菌引起叶斑病。为了检测本发明的混合物对黄单胞菌所引起的疾病的有效性，我们使用了假荆芥模型。位于德克萨斯州的Willis的可控温室中，我们在盆里种植了28棵2个月大的假荆芥。该植物被分为试验组和对照组，每组有4棵。试验前48小时，每组均放置于充满湿气的湿室里。
在搅拌下于营养培养基中将野油菜黄单胞菌培养48小时，并稀释成为106CFU/mL的悬浮液，这通过平板培养法检测。将吐温20加入细菌悬浮液中，使其终浓度为0.5％。使用手持式弥雾器，用细菌混合物喷洒植物。每隔一天检查一次植物发病情况。
在两个星期内，在几棵试验植物上观察到叶斑病的小的褐色斑点。一个星期后，斑点的大小发展成为较大的角状褐色斑点，这与在假荆芥的叶斑病所观察到的共有特征相似。分组，并在出现斑点到大量坏死的各个阶段进行处理。
在观察到疾病特征和恶化之后，我们在如下条件下使用了本发明的混合物。制备制剂V，使其终浓度为0.5g制剂/加仑SS 9。对照组仅用SS-9处理。本试验后，将植物及其塑料盆烧掉。将种植所有植物的盆里的土壤高压灭菌，并将充满露水的室消毒。结果在表5中列出。
如表5所示，对感染早期的植物用制剂V喷洒两个星期，阻断了疾病的发生。在该处理后一个月在这些植物中均没有观察到疾病的征象。同样，暴露于制剂V之前表现出一定坏死的植物在以制剂V喷洒后2周内表现出感染减少并且有恢复过程。处理后4个星期内，未观察到明显发病，并且未观察到褐色斑点。
同样，制剂V对表现出较高水平坏死的假荆芥样本提供保护。用制剂V处理后三个星期内，在坏死恢复中观察到效果显著提高，并且在用制剂V喷洒后四个星期内观察到完全康复。
相反，仅仅用SS-9处理不对被感染的假荆芥提供保护。如图5所示，疾病快速恶化，因此，由于疾病的快速恶化，结束对照组实验。
在平行试验中，如上所述，用制剂V喷洒总共8棵2个月大的植物。喷洒一个星期后，用上文所给定的浓度和条件用野油菜黄单胞菌感染植物。如上所述，结束所有的对照组实验和实验组实验，并将其破坏。本试验的结果在表6中列出。
如表6所示，在野油菜黄单胞菌感染前，用制剂V对假荆芥植物喷洒一个星期提供了针对该细菌的保护。相反，仅仅用SS-9喷洒的植物病情得以恶化。
实施例3对黄单胞菌杀伤早熟禾的控制 除了检测黄单胞菌感染假荆芥的效果外，我们使用了一年生莓系属的牧草早熟禾，以检测本发明的混合物对用野油菜黄单胞菌早熟禾致病变种(Xanthomonas campestris[pv.]poannua，作为XPO从EcoSoil Systems获得)感染的该牧草的效果。在该研究中，早熟禾在开放式植物生长盒(Phytatray，Sigma)中生长。该生长盒分为对照组(N＝10盒)和实验组(N＝10盒)。生长一个月后，根据产品说明书，用野油菜黄单胞菌早熟禾致病变种喷洒试验组生长盒。感染后，我们等待对该牧草的损伤的出现，然后用上文给出的制剂V喷洒。对照组为不用制剂V处理或仅仅用SS-9处理。结果在表7中列出。
如表7所示，制剂V使牧草的疾病免于恶化。对表现出最小损伤的植物的效果在喷洒制剂V后一个星期内提供了保护。同样，表现出中度损伤的植物可得到治疗并且在暴露于制剂V后两个星期内免于感染疾病。表现出受野油菜黄单胞菌早熟禾致病变种较高程度的损伤的植物在暴露于制剂V后三个星期内免于感染疾病。相反，在仅仅用SS-9喷洒前表现出中度疾病症状的牧草未能提供免受野油菜黄单胞菌早熟禾致病变种感染的保护。
在平行试验中，在用野油菜黄单胞菌早熟禾致病变种感染前，我们用制剂V对健康的牧草喷洒了一个星期，以确定本发明对该牧草提供预防保护使其免受该病原体感染。试验结果在表8中列出。
如表8所示，在暴露于病原体前用制剂V喷洒牧草提供了保护。相反，与未用任何制剂(除了含病原体的制剂)所喷洒的被感染的植物相比，仅仅用SS-9喷洒的牧草不会得到保护并且表现出疾病的恶化。
表5.使用本发明的混合物制剂V对假荆芥的黄单胞菌感染的控制
用病原体喷洒有斑点的植物，并在喷洒前一直培养到出现所需病变。按照如下所示分析反应3+过度坏死；2+一定程度的水渍坏死；1+观察到一定的斑点；
＝恢复证据表明疾病没有恶化；
＝表明由于疾病的进展阶段，除去植物并焚烧。
图6.在假荆芥中混合物在阻止野油菜黄单胞菌感染的有效性
在植物接受足量的制剂V后用细菌喷洒有斑点的植物一个星期。按照如下所示分析反应3+过度坏死；2+一定程度的水渍坏死；1+观察到的一定程度的斑点；
＝恢复证据表明疾病没有恶化；
＝表明由于疾病的进展阶段，除去植物并焚烧。
表7.使用混合物制剂V对在早熟禾中的黄单胞菌感染的控制
用病原体喷洒种植牧草，并在制剂V喷洒前一直培养到出现所需病变。按照如下所示分析反应3+过度褐变、坏死；2+高度褐变、萎缩；1+观察到一定程度的褐变；
＝愈合证据表明疾病没有恶化；
＝表明植物死亡。
表8.混合物在早熟禾中阻止黄单胞菌感染的有效性
在用病原体接种前用制剂V喷洒种植牧草。按照如下所示分析反应3+过度褐变、坏死；2+高度褐变、萎缩；1+观察到一定程度的褐变
＝恢复证据表明疾病没有恶化；
＝表明由于疾病的进展阶段，除去植物并焚烧。
因此可见上述目的与通过上述说明变得显而易见的目的一样可有效实现，并且在不背离本发明的范围下，可对上述物质的组成作出某些改变，因此上文描述中所包含的所有物质旨在进行示例性阐述，而非限制。
还需要理解的是下面的权利要求旨在囊括本文所描述的发明的普遍特征和特定特征，并且所有对本发明范围的描述通过语言落入其中。特别地，应该理解的是在所述权利要求书中，只要条件允许，单数形式叙述的组分或化合物旨在包括该组分的相容混合物。
已对本发明进行了描述。
权利要求
1.一种在农作物中治疗黄单胞菌属种感染的组合物，所述组合物包括以重量计约0.5-1.0哈茨木霉菌，以重量计约0.1-1.0丝兰萃根部提取物，以重量计约0.1-1.0丝兰萃的叶提取物，以及以重量计约0.5-1.0黄单胞菌属种提取物。
2.根据权利要求1的组合物，包括以重量计约1.0哈茨木霉菌，以重量计约1.0丝兰萃根部提取物，以重量计约1.0丝兰萃的叶提取物，以及以重量计约1.0黄单胞菌属种。
3.根据权利要求1的组合物，包括以重量计约0.5哈茨木霉菌，以重量计约1.0丝兰萃根部提取物，以重量计约1.0丝兰萃的叶提取物，以及以重量计约1.0黄单胞菌属种。
4.根据权利要求1的组合物，包括以重量计约0.5哈茨木霉菌，以重量计约0.5丝兰萃根部提取物，以重量计约1.0丝兰萃的叶提取物，以及以重量计约0.5黄单胞菌属种。
5.根据权利要求1的组合物，包括以重量计约1.0哈茨木霉菌，以重量计约0.5丝兰萃根部提取物，以重量计约0.5丝兰萃的叶提取物，以及以重量计约1.0黄单胞菌属种。
6.根据权利要求1的组合物，包括以重量计约0.5哈茨木霉菌，以重量计约0.2丝兰萃根部提取物，以重量计约0.1丝兰萃的叶提取物，以及以重量计约1.0黄单胞菌属种。
7.根据权利要求1的组合物，包括以重量计约0.5哈茨木霉菌，以重量计约0.1丝兰萃根部提取物，以重量计约0.1丝兰萃的叶提取物，以及以重量计约1.0黄单胞菌属种。
8.一种在农作物中治疗黄单胞菌属种感染的方法，所述方法包括将权利要求1的组合物通过喷洒用于被感染的农作物。
9.一种提高农作物对黄单胞菌属种感染的抗性的方法，所述方法包括将权利要求1的组合物通过喷洒用于农作物。
全文摘要
一种治疗农作物中黄单胞菌属种感染的组合物，其中该治疗组合物是哈茨木霉菌、丝兰萃根部提取物、丝兰萃叶提取物和黄单胞菌属种提取物的混合物。该组合物作为提高农作物对这种感染的抗性的预防感染试剂也是有效的。该组合物优选通过喷洒使用。
文档编号A01N25/26GK1901797SQ20048004020
公开日2007年1月24日 申请日期2004年12月17日 优先权日2004年1月9日
发明者R·M·希斯米思 申请人:生物系统公司