制备抗病毒疾病的家禽和其他动物的制作方法

专利名称：制备抗病毒疾病的家禽和其他动物的制作方法
技术领域：
本发明涉及RNA干扰技术用于制备抗病毒感染的动物的用途。
背景技术：
据疾病控制中心(CDC)和世界卫生组织报道，分散在至少3个大陆的 超过47个国家报告了高致死性禽流感病毒毒林H5N1。见例如 <http:〃\vww.cdc.gov/flu/avian/outbreaks/current.htm>。禽;危感是由;^充感病 毒引起的感染。这些流感病毒在鸟类中天然存在。世界上的野生鸟类在其 肠中携带该病毒并且通常是没有症状的。但是禽流感在鸟类中极为流行， 并且可以使一些家养的鸟类，包括鸡、鸭、火鸡严重患病并且导致死亡。
受感染的鸟类在其唾液、鼻分泌物和粪便中散布流感病毒。当易感的 鸟类接触受污染的分泌物或排泄物时，或者接触被受感染鸟类的分泌物或 排泄物污染的表面时，它们会被感染。家养的鸟类通过直接接触受感染的 水禽或其他受感染的家禽，或者通过接触为病毒所污染的表面(如泥土或笼 子)或物质(如水或铜料)而受到禽流感病毒的感染。
家禽中的禽流感病毒感染引起两种主要形式的疾病，它们通过毒力的 高低来区别。"低致病性，，形式通常是不能检测到的并且通常只引起轻微症 状(如竖起羽毛和蛋产量下降)。但是，高致病形式通过家禽群快速传播。 这一形式引起的疾病影响多个内部器官并且通常在48小时内致死率达到
90-100%。因此，如果有制备抗禽流感家禽的方法，那么家禽农场巨大经 济损失的可能性将显著降低。这些抗病毒家禽可以繁殖产生新品种家禽， 以将其抗病毒性一代代传下去。
据估计家禽全球市场每年生产多于500亿头家禽。因此，更重要的是， 制备抗病毒动物如家禽的能力可以预防将令人恐惧的"鸟类流感"病毒传递 给人，因此避免了禽流感在人中的大范围流行。
还存在其他类型的病毒疾病，它们也是家禽工业的难题。例如，马立 克病在小母鸡群中通常引起严重的死亡损失，并且是肉禽厂损失的主要原 因。马立克病是由MD病毒(MDV)引起的淋巴组织增生病，所述病毒属于 疱渗科，并且是近50年间家禽厂的主要问题。识别了 3种MDV毒林的血 清型。将所有的致癌毒林归为血清型l(MDV-l)，而天然非致癌鸡毒林和 火鸡的疱渗病毒(HVT)分别属于血清型2(MDV-2)和3。据估计全世界范围 内每年由于马立克病的经济损失在几十亿美元的范围，这还不包括大量的 接种疫苗。尽管接种疫苗在世界上减少了受影响的家禽群的数量，然而在 世界的许多地方仍有大量的疾病爆发，这使得需要更好的方法来控制疾病。
可以成功治疗的病毒疾病数量有限。当今，接种疫苗是动物对抗病毒 疾病的唯一方法。在许多情形中，特别是在家畜病毒疾病中，由于不能生 产高效疫苗，这一方法是不可用的。 一些疫苗无效的另一原因是高突变率， 这导致抗原性漂移或疫苗功效的丧失。在家禽病毒疾病和家畜病毒疾病的 情形中， 一旦疫苗丧失了其功效，疾病会出现并且能够造成大量的经济损 失。
有两种经典形式的疫苗， 一种是减毒活疫苗，这是最强的一种，因为 其引起免疫系统的体液和细胞武装。这类疫苗的缺点是有再次出现高致病 性逃脱突变体的风险。为此，许多国家不愿准许使用此类疫苗。第二种形 式是灭活的病毒疫苗，这在很多种情形中有低得多的功效，因为它仅诱导 体液免疫系统。在过去的几年中，已经开发了一些类型的重组疫苗如亚单 位疫苗和DNA疫苗。遗憾的是，它们中的许多种不能广泛使用。疫苗的 一个缺点是每年高的经济支出，如在马立克病的情形中所说明的。根据世
界动物卫生组织(OIE)，在2002年对马立克病接种疫苗的动物总数是24.57 4乙。见4列((口<www.oie.com >。
有两种已知途径来接种疫苗。第一种方法是无细胞(冻干的)形式，花 费约3美元/1000单位。第二种形式是细胞相关("湿，，)形式，花费约8美元 /1000单位。估计在2002年对马立克病的全球花费大约在74亿到197亿美 元之间。
从七十年代早期开始，就使用减毒血清型1毒株或HVT接种鸡来对 抗MD。从1983年开始，使用二价和多价组合来对抗更多的致病性领域毒 林。尽管疫苗接种在保护鸡中显著有效，MD在优先疾病的列表中仍排名 靠前。高优先性的主要原因是MDV毒林持续进化为具有引起疫苗毁坏增 加的致病性。
因此，需要预防或减少动物中病毒疾病(例如家禽中的禽流感和马立 克病)的传播。假设现在爆发禽流感病毒，则非常需要有可以制备遗传修 饰的动物如家禽的方法，所述动物能够抵抗病毒感染，例如禽流感。
在过去的十年间，公开了通过基因沉默(被称为"RNA千扰，，(RNAi))的 基因灭活新方法。见，例如Fire等人，7V"似re 391: 806-811 (1998)和美国 专利6,506,559。 RNA千扰是指当RNA多核苦酸通过内源细胞过程作用以 特异性阻抑对应于该RNA序列的基因的表达时发生的事件。靶标基因沉 默是由于宿主动物对双链(ds)RNA的mRNA降解而发生的，有时是通过 RNAase III内切核酸酶消化。消化产生大约长(或大小)为21到23个核苷 酸(或碱基)的分子，但是有时分子大小可以大到30个碱基。
这些短的RNA种类介导了对应的RNA信息链和转录物的降解，这可 能是通过RNAi核酸酶复合物(被称作RNA诱导性沉默复合物(RISC))进行 的，它帮助小dsRNA通it^基对相互作用识别互补mRNA。在siRNA与 其底物相互作用后，将mRNA进行降解，这可能是通过存在于RISC中的 酶。这类机制似乎对于生物抑制病毒感染、转座子跳跃和类似的现象，以 及调节内源基因的表达是有用的。目前RNAi活性已经在植物、昆虫、线 虫类和脊推动物等生物中有记录。 一般的背景信息见例如Schutz等人，KfV^/ogy344(l):151-7 (2006); Leonard等人，G^"e 77iw. 13(6):532-40 (2006); Colbere-Garapin 等人，Af/"o6^ /"/e". 7(4):767-75 (2005); Wall, 77ieW<^eM0/。sv 57(1):189-201 (2002); El-Bashir等人，7Vfl似z^ 411: 494-498 (2001); Fire， A.等人.391: 806-811 (1998); Gitlin等，胸""418: 430-434 (2002); Gitlin等人，/ Fiw/. 79:1027-1035 (2005); Kahana等人，
F/ /. 85， 3213-3217 (2004); Kr。nke等人，/ Ww/. 78: 3436-3446 (2004); Leonard等人，/ 79:1645-1654 (2005);和Yokota等人，￡7V/i5(9
及e/7. 4: 602-608 (2003)。
对于动物特别是家禽中多种病毒疾病广泛传播的问题，有效控制家禽 和家畜病毒疾病的不同方法将是对于解决此问题非常有利的。同样的，本 文公开的发明提供了此问题的解决方法，这是通过提供制备转基因非人脊 推动物例如家禽和家畜的方法以及遗传修饰的家禽和家畜自身来实现的， 所述转基因非人脊推动物携带和表达旨在阻断重要病毒功能的分子，其将 显著抑制致病性病毒的病毒复制。

发明内容
本发明提供了编码靶向病毒序列的siRNA的生殖细胞以及得到它们的 方法。本发明还提供了抗病毒感染的非人脊稚动物和得到它们的方法。
一方面，本发明是包含构建体的非人脊推动物的生殖细胞，所述构建 体含有编码针对病毒基因组保守区的siRNA的序列，其中该序列有效连接 启动子。在一个实施方案中，构建体包含编码针对病毒基因组的多个siRNA 的序列。在另一实施方案中，细胞包含多个构建体，所述构建体包含编码 针对病毒基因组保守区的多个siRNA的序列，其中该序列有效连接启动子。 在另一实施方案中，脊推动物是非人哺乳动物。在另一实施方案中，病毒 是口蹄疫病毒(FMDV)。在另一实施方案中，保守序列选自SEQIDNO: 1、 SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:3。在另一实施方案中，脊稚动物是禽类物 种。在另一实施方案中，病毒是禽流感病毒。在另一实施方案中，保守序 列选自图1-16中的序列。在另一实施方案中，病毒是马立克病病毒(MDV)。
在另一实施方案中，生殖细胞是精子。
在另一方面，本发明提供了抗病毒疾病的非人脊推动物，其中脊推动
物的大部分细胞包含针对引发疾病的病毒基因组保守区的siRNA的编码序 列，其中该序列有效连接启动子。在一个实施方案中，构建体包含针对病 毒基因组保守区的多个siRNA的编码序列。在另一实施方案中，细胞包含 多个构建体，所述构建体包含针对病毒基因组保守区的多个siRNA的编码 序列。在另一实施方案中，脊推动物是非人哺乳动物。在另一实施方案中， 病毒疾病是FMDV。在另一实施方案中，保守序列选自SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:3。在另一实施方案中，脊推动物是禽类物 种。在另一实施方案中，病毒是禽流感病毒。在另一实施方案中，保守序 列选自图1-16中的序列。在另一实施方案中，病毒是MDV。
另一方面，本发明提供了产生非人脊推动物生殖细胞的方法，其包括 在使得构建体进入细胞的条件下将生殖细胞与构建体一起孵育，所述构建 体包含针对病毒基因组保守区的siRNA的编码序列，其中该序列有效连接 启动子。在一个实施方案中，将构建体整合到宿主细胞基因组中。
在另一方面中，本发明提供了产生抗病毒疾病的非人脊推动物的方法， 其包括(a)在形成二倍体细胞的条件下将生殖细胞与构建体一起孵育，所述 构建体包含针对病毒基因组保守区的siRNA的编码序列，其中该序列有效 连接启动子；以及(b)在形成非人脊推动物的条件下培育(a)的二倍体细胞。


图1-8显示禽流感H5N1序列，其可以用于此禽流感毒4朱的基因组7。 图9-12显示禽流感H5N1序列，其可以用于此禽流感毒4朱的基因组1。 图13-16显示禽流感H5N1序列，其可以用于此禽流感毒林的基因组5。
发明详述
本发明提供了抗病毒感染的动物和制备这些类型的转基因动物的方 法。通过存在沉默分子如本文公开的siRNA分子，可以将靶标病毒基因沉
默，并且因此它们不能在病毒生命周期中发挥它们的作用。此过程的结果 是对病毒复制的有效阻断，这导致感染不能引起这些动物的发病或/和死 亡。因此，由于完全确保肉类和其他家畜产品的持续供应，本发明将对农 民和社会具有重要的经济价值。
除非另外声明，本发明的实施将使用分子生物学(包括重组技术)、微
生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常^L技术，这些属于本领域的 技术。此类技术在文献中详细说明，如Mo/ecw/"r C7o附Vig:爿Lfl^r"too; Affl"廳/，笫二版(Sambrook等人，1989) Cold Spring Harbor Press;
(M.j. Gait，编著，1984); /iw/附fl/ O// Cm/似m (R.I. Freshney)，编著，1987); Me幼ocfe ^E""g^附o/ogy (Academic Press, Inc.); //做必卯A: 0/Ejc/7c/附e"/"/ /附附《朋/<^ (D.M. Weir & C.C. Blackwell，编 著)；Gewe 7Vvww/er /。r Ma附附fl/Zfl/1(j.M. Miller & M.P. Calos，
编著，1987); C"^re"f尸w/oco/s /" Afo/ecw/a尸B/o/柳(F.M. Ausubel等人编 著，1987);户C/ : r/ie尸o(v附^vwe C7m/w i^flCV "， (Mullis等人编著，1994); CWrewf尸,她o /s /附附簡^gv (j.E. Coligan等人编著，1991)和5"/ro" /V柳co/sAfo/ecw/fli* J5/o/o^v (Wiley和Sons, 1999)。
本专利申请中引用的所有参考文献、专利和专利申请均完整引入本文 作为参考以用于所有目的。
定义
除非另外说明，本申请中使用的所有科学和技术术语具有本领域中常 规使用的意思。如本申请所用到的，下列单词或短语具有所声明的意思。
术语"多核苷酸"和"核酸"在本文中互换使用，是指任何长度的核苷酸 (核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的多聚形式。这些术语包括单链、双链或 三链DNA、基因纟且DNA、 cDNA、 RNA、 DNA-RNA杂交体，或包含噤呤 和嘧咬碱基的多聚体，或其他天然的，化学修饰的、生物化学修饰的，非 天然的或衍生的核苷酸碱基。
"启动子"是调控序列，其为控制转录的起始和速率的多核苷酸序列区 域。它可以包舍遗传元件，其中调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他
转录因子)可以结合在其上。例如，启动子可以是组成型、诱导型、阻抑型
或组织特异性的。术语"有效连接(operable linked)，，、"有效定位"、"有 效连接(operatively linked)"、"受到调控"和"受到转录调控，，意思是启动子 处于核酸序列的正确功能位置和/或方向中，从而调控该序列的转录起始和 /或表达。启动子可以与"增强子，，组合使用，或者不组合使用，所述增强子 是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。 一个启动子可以调节一 个或多个基因的表达。 RNAi靼标
本发明提供了沉默基因的方法，从而可以生产抗病毒动物。在一个实 施方案中，本发明使用基因沉默技术如RNAi，与脂质转染一起来内部制 备免疫转基因家禽和家畜。在优选的实施方案中，本发明使用限制酶介导 的整合("REMI，，)(如在WO 99/42569中公开的)来制备抗病毒动物。动物将 携带和表达靶向病毒基因(例如复制不可缺少的病毒基因)的单个或多个基 因沉默分子。
当靶标基因在细胞中存在并且能够表达时，本发明提供的短干扰 RNA(siRNA)可用于调节和/或削弱此类基因表达。表达的调节可以是基因 功能的部分抑制，更优选是完全抑制，或者甚至是在应答初级草巴标基因的 抑制中其他二级靶标基因的上调或此类基因表达的增强。
基因表达的削弱可以包括基因功能、转录过程或转录物翻译的部分或 完全阻抑或抑制。在RNA干扰的背景中，认为基因表达的调节是通过蛋 白质和RNA(特别包括可以作用为"指导"RNA的小、dsRNA)复合物来进 行的。因此认为当siRNA的核苷^列充分对应于草巴标基因的至少部分核 苷酸序列时，它是有效的。尽管本发明不受到此机理假设的限制，但是非 常优选的是siRNA中的核苷酸序列与乾标基因序列的至少部分基本一致。 在一个实施方案中，靶标病毒核苷酸和siRNA之间的序列同一性是100%, 即精确同源。在另一实施方案中，有1个碱基对(bp)的不同。在另一实施 方案中，有2个碱基对不同。在另一实施方案中，有3个碱基对不同。
"靶标基因"或"靶标序列"通常意味着包含编码基因产物(如多肽)的区域的多核苷酸，或调节复制、转录或翻译或对于多肽表达重要的其他过程 的多核苷酸区域，或包含编码多肽的区域和有效连接到其上以调节表达的 区域的多核苷酸。靶标序列不必须编码完整的基因产物。在本发明的上下 文中，"有效连接"是指启动子处于多核苷酸序列的正确功能位置和/或方向 中，以调控该序列的起始和/或表达。
在一方面中，siRNA的耙标基因是病毒基因。在一个实施方案中，病 毒基因是参与禽类病毒疾病(例如禽流感和马立克病)传播的那些。包括在 本发明范围内的基因序列包括在图l-16中显示的那些。
siRNA的长度足以充分阻断病毒复制，但是不能引起细胞破坏并且通 常在大约19个碱基对到大约27个碱基对之间的范围内。在一个实施方案 中，siRNA长为21bp。在另一实施方案中，siRNA长为22bp。在另一实 施方案中，siRNA长为大约19、 20、 23、 24、 25、 26或27bp。在另一实 施方案中，siRNA长为大约28、 29或30bp。对于本领域技术人员显而易 见的是siRNA的长度不能太长，因为它将在其所处的细胞中刺激细胞的某 类自我破坏机制。例如，Elbashir等人教导了 21bp的长度能有效避免细胞 的抗病毒机制，如干扰应答(Elbashir等人，411:494-498 (2001))。
如图1-16中所示，不同的长度可以用作干扰RNA。 一个优选的实施 方案长为21bp。本领域的技术人员可以使用在图1-16中描述的序列并且 沿着序列向下每次逐步移动一个碱基对，来产生不同的21bpsiRNA。 一些 变换显示在这些图中。但是，没有显示所有可能的21bp siRNA序列，因 为只要是显示了整个序列(如在图1-16中所示)，对于本领域的技术人员来 说沿着序列向下逐步移动是常规技术。另外，除21bp以外的长度也包含 在本发明中。如上述所讨论的，在一个实施方案中，siRNA长为大约21bp 到约27bp。技术人员可以使用图1-16中公开的序列并且使用所需的长度， 并且沿着序列向下每次移动一个bp来生成不同的读框。例如，如果要制 备23bp的siRNA，那么技术人员将从序列的一端开始并且使用第一个23bp 作为siRNA的一种变换。然后他/她将沿着序列向下移动一个碱基对，并 且下个23个碱基对将是下一个变换，并且以此类推。
实验确定或从公共数据库中可得的序列数据可以通过生物信息工具进
行篩选。通过使用公共可用或可商购的程序(例如GCG包中的PILEUP和 PRETTY程序)可以实现同源性分析。可以用公共可用的序列(例如 Genbank),使用PILEUP和PRETTY程序或FASTA程序，任选进行同 源性搜索(Pearson等人，PA^S85: 2444-2448 (1988))。
将病毒基因序列，特别是影响动物健康和安全的那些构想为本发明的 靶标基因。作为靶标的理想病毒序列是高度保守的那些。保守的高程度通 常是没有突变偏离保守序列的选择性压力的指示。对于许多病毒，非结构 基因在其多种血清型中都是趋向于保守的，因此是RNAi技术的良好耙标。 也是良好靶标的其他病毒基因是对于病毒复制和随后的增殖重要或关键的 那些基因。在一方面中，赤羽病毒(Akabanevirus)的结构(S)基因用于制备 siRNAo
在另一方面中，靶标序列是一段短序列，其在禽流感的不同毒林中是 保守的。在一个实施方案中，用于siRNA的序列来自禽流感病毒H5Nl毒 林的基因组l。其非限制性实例显示在图9-12中。黑体的一个或多个核苷 酸指示了当进行同源性分析时检测到的一个或多个碱基对差异的位置。在 另 一实施方案中，用于siRNA的靶标序列来自禽流感病毒H5N1毒林的基 因组5。其非限制性实例显示在图13-16中。在另 一实施方案中，用于siRNA 的靶标序列来自禽流感病毒H5N1毒林的基因组7。其非限制性实例显示 在图1-8中。在另一实施方案中，靶标序列来自H5N1的其他基因组类型。 另外，抵抗禽流感的其他毒林(例如H5N2、 H5N3等)的siRNA也包括在本 发明的范围中并且可以由技术人员根据本文的教导来制备。
在另一方面中，将口蹄疫病毒(FMDV)的保守序列段用作构建siRNA 的靶标序列。在另一方面中，将引起下列疾病的病毒非限制性列表用作 siRNA构建的靶标序列新城疫、西尼罗热、禽痘(fowlpox)、禽源传染性 支气管炎、禽脑脊髓炎、禽类白血病、鸭病毒肝炎、鸭病毒肠炎、皱皮病、 牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻、牛白血病、立夫特山谷热、牛瘟、蓝 舌病、小反刍兽疫(PPR)、绵羊天花和山羊天花、接触性脓疱皮炎(深脓疱)、
边境病、魅敌病、传染性胃肠炎(TGE)、马流感、非洲马疫、委内瑞拉马 脑脊髓炎以及鱼(carp)的春季病毒血症。 编码siRNA的构建体
编码siRNA的构建体包括多种成分，其包括但不限于启动子和将在细 胞中指导siRNA到正确靶标的序列。可以使用的启动子包括但不限于RNA 聚合酶II启动子和RNA聚合酶III启动子。RNA pol III启动子尤其适合 作为启动子用于构建siRNA。可以使用的启动子(pol II和pol III)的非限制 性实例包括5S核糖体(r) RNA、小鼠U6、人U6、小鼠HI、人HI、巨细 胞病毒启动子、鸡泛素C、人7SK启动子、牛U6启动子、鸡U6启动子、 马立克病病毒38 kd磷酸化蛋白(pp38)基因、鸡，人，牛(5-肌动蛋白的1.8-kb mRNA、鸡PRL启动子、鸡SPATA4基因启动子、鸡PolI启动子、马立 克病病毒启动子US1基因、核糖核苷酸还原酶基因的马立克病病毒小亚基、 禽类白血病和肉瘤病毒LTR、 RSV-LTR、合成的痘病毒启动子、痘苗病 毒P11启动子、痘苗病毒P174和P190、禽痘早期/晚期启动子P.E/L、禽 痘病毒胸腺嘧咬核苷激酶启动子、痘苗p7.5启动子和禽痘-PFLl启动子。
使用标准分子生物学技术，将这些启动子有效连接到将靶向病毒基因 并且沉默它们的序列。 一个启动子可以调节一个或多个靶标序列的表达。 将启动子和靶标序列克隆到标准克隆或表达载体中。如本文用到的，"栽体" 是指能够将其他核酸序列递送到细胞的核酸分子。载体可以来自质粒、噬 菌体、植物或其他动物病毒。
制备siRNA构建体从而使得它们能够表达siRNA。本领域的技术人员 将认识到某些类型的启动子在一些脊推动物中比在其他脊推动物中能更好 地调节siRNA的表达，这取决于脊推动物的生理，并且应当设法使用最适 合于该脊推动物的启动子。启动子还可以调节一个或多个siRNA的表达。 载体可以包含编码一个或多个siRNA的序列。还可以使用增强子、选择性 标记和其他标准分子工具，以更方便分子操作。当使用REMI技术时，应 当构建载体从而使其有利于REMI技术的应用。适当的技术指导见WO 99/42569。
在本发明的一方面中，可以将载体与对应于病毒基因组上不同靶标的
一些siRNA基因一起使用。由于同时在不同位点切割，此类载体构建将有 效确保实现抑制。另外，即使是一个病毒靶标序列突变或改变，它仍然是 有活性的。对于双链siRNA，可能具有标准的2bp突出端，以及lbp突出 端或完全没有突出端。 构建生殖细胞
如本文用到的，将"生殖细胞，，定义为精子和卵细胞以及它们的前体。 生殖细胞是单倍体并且只具有一套染色体，而其他非生殖细胞具有两套染 色体。本发明提供了包含构建体的非人脊推动物生殖细胞的构建，所述构 建体包含编码针对病毒基因组保守区的siRNA的序列，其中该序列有效连 接启动子。生殖细胞可以包含构建体，所述构建体包含编码针对病毒基因 组的多个siRNA的序列。可以使用的病毒序列的实例在上文所述。在一个 实施方案中，病毒序列是口蹄疫病毒(FDMV)。在另一实施方案中，病毒 序列是禽流感病毒。
本发明提供了产生非人脊推动物生殖细胞的方法，其中生殖细胞包含 构建体，所述构建体包含编码针对病毒基因组保守区的siRNA的序列。为 了实施本发明的方法，本领域的技术人员在使得构建体进入细胞的条件下 将生殖细胞与构建体一起孵育，所述构建体包含编码针对病毒基因组保守 区的siRNA的序列，其中该序列有效连接启动子。在一个实施方案中，使 用REMI技术将构建体整合到宿主细胞基因组中。
在一方面中，生殖细胞包含多个构建体，所述构建体包含针对病毒基 因组保守区的多个siRNA的编码序列，其中该序列有效连接启动子。在另 一实施方案中，非人脊推动物是非人哺乳动物。非人脊推动物的非限制性 实例包括鸡、鸭、鵝、家禽、牛、母牛、猪、鱼、绵羊、山羊和马。在另 一实施方案中，脊推动物是禽类物种。在另一方面中，生殖细胞包含一个 载体，其含有受到不同启动子控制的多个基因。
在一个实施方案中，生殖细胞包含构建体，所述构建体包含耙向口蹄 疫病毒(FMDV)的siRNA的编码序列。此类靶标序列的实例是i)5，CCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGC-3， (SEQIDNO:l)，在第4900位 -第4922位核苷酸，位于3B区；(ii) 5，-GAGATTCCAAGCTACAG ATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGC-3， (SEQ ID NO:2)，在第6934位-第6992位核苷酸，位于3D区；以及(iii) 5，-GACGAGTACCGGCGTCTCT TTGAGCC画3， (SEQ ID NO:3)，在第 6892位-第仍n位核苷酸，位于30区。所有位置是指FMDV血清型Ol (G) 序歹'〗(GenBank登录号AF189157)。
一方面，生殖细胞包含含有序列的构建体，所述序列编码靶向禽流感 的siRNA。在此方面的实施方案中，生殖细胞包含构建体，其中保守序列 选自在图1-16中描述的任意序列。
在另一方面中，生殖细胞包含构建体，所述构建体包含革巴向马立克病 病毒(MDV)的siRNA的编码序列。在上文中，生殖细胞是精子。
转基因动物的构建
然后通过使用任意数目的标准技术例如脂质转染，将上述构建体引入 到动物细胞中。但是， 一些旧的技术如脂质转染只有非常低的成功率。发 明人发现，成功引入这些编码siRNA的构建体的较好方法是使用限制酶介 导的整合("REMI")，如在WO 99/42569中教导的。因此，在一个实施方 案中，使用REMI将编码siRNA的多核苷酸引入到动物生殖细胞(例如精 子)中。使得从使用这些生殖细胞得到的动物对疾病有抗性。可以繁殖这些 转基因动物以产生一整群抗病毒动物。在家禽的情形中，siRNA革巴向的病 毒包括但不限于马立克病、禽肾病(gumboro)和禽流感。
引入动物细胞(例如生殖细胞)的siRNA数量可以改变。在一个实施方 案中，引入一个siRNA构建体。在另一实施方案中，引入一个或多个siRNA 构建体。技术人员将认识到基于靶向的病毒疾病，可以引入siRNA的不同 组合。
本发明提供了生成抗病毒疾病的非人脊推动物，其中该脊推动物的大 部分细胞包含针对引发疾病的病毒基因组保守区的siRNA的编码序列，其 中该序列有效连接到启动子。病毒序列的实例如上所讨论。在一个实施方
案中，构建体包含针对病毒基因组保守区的多个siRNA的编码序列。在另 一实施方案中，细胞包含多个构建体，所述构建体包含针对病毒基因组保 守区的多个siRNA的编码序列。在另一实施方案中，非人脊推动物是非人 哺乳动物。
在一个实施方案中，非人脊推动物的大部分细胞包含构建体，所述构 建体包含编码耙向口蹄疫病毒(FMDV)的siRNA的序列。此类乾标序列的 实例是i) 5'-CCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGC國3， (SEQ ID NO:l)，在 第4900位-笫4922位核苷酸，位于3B区；(ii) 5，-GAGATTCCAAGCTAC AGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGC -3， (SEQ ID NO:2)，在第6934位-第6992位核苷酸，位于3D区；以及(iii) 5'-GACGAGTAC CGGCGTCTCTTTGAGCC-3， (SEQ ID NO:3)， 在， 第6892位-第6917位核苷酸，位于3D区。所有位置是指FMDV血清型 Ol (G)序列(GenBank登录号AF189157)。
非人脊推动物的非限制性实例包括鸡、鸭、鹅、禽类、牛、母牛、猪、 鱼、绵羊、山羊和马。在另一实施方案中，脊推动物是禽类物种。在另一 实施方案中，非人脊推动物具有含有编码siRNA的构建体的细胞，其中保 守序列选自图1-16中描述的任意序列。在另一实施方案中，非人脊推动物 对MDV有抗性。
本发明提供了产生抗病毒疾病的非人脊推动物的方法，其包括步骤 (a)在形成二倍体细胞的条件下培育上述生殖细胞；以及(b)在形成非人脊推 动物的条件下培育(a)的二倍体细胞。
本发明还设想通过克隆方法产生抗病毒疾病的非人脊推动物。在此类 情形中，可以将一个或多个siRNA插入到待克隆的细胞基因组中。此类技 术的多种方法是可商购的，例如Advanced Cell Technology的核移植方案。
应用
本发明在此提供了制备抗病毒疾病的家禽的方法。这些疾病包括但不 限于新城疫、西尼罗热、禽痘、禽源传染性支气管炎、禽脑脊髓炎、禽 类白血病、鸭病毒肝炎和鸭病毒肠炎。
本发明在此提供了制备抗病毒疾病的牛的方法。这些疾病包括但不限
于皱皮病、牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻、牛白血病、立夫特山谷 热、牛瘟和蓝舌病。
本发明在此提供了制备抗病毒疾病的绵羊和山羊的方法。这些疾病包 括但不限于小反刍兽疫(PPR)、绵羊天花和山羊天花、接触性脓疱皮炎(深 脓疱)、边境病、蓝舌病、魅敌病和立夫特山谷热。
本发明在此提供了制备抗病毒疾病的马的方法。这些疾病包括但不限 于马流感、非洲马疫和委内瑞拉马脑脊髓炎。
本发明在此提供了制备抗病毒疾病的鱼的方法。这些疾病包括但不限 于鱼的春季病毒血症。
本发明可以用于猪以产生对猪瘟、非洲猪瘟、传染性肠炎(TGE)和口 蹄疫的抗性。 一般而言，本文的教导通常可以应用于对病毒疾病易感的任 意动物。
在疾病会导致持续大量经济损失的大规模家禽工业情形中，实际的解 决方案在于实施siRNA技术以制备抗禽流感和马立克病、传染性法嚢氏病 和其他禽类病毒的家畜和家禽(broiler and layer breeders)。本文^^开的发 明的用途为消费者和一般人群提供了安全的禽类来源，因为来自鸟类的禽 类病毒的传播对人是有害的。
提供以下实施例以说明本发明，而不是限制本发明。
实施例
实施例1:制备抗口蹄疫的动物
通过将从口蹄疫病毒(FMDV)的病毒序列构建的siRNA插入动物的生 殖细胞来生成对口蹄疫易感的转基因动物。通常对FMDV易感的动物为偶 蹄动物。
构建口蹄疫siRNA
为了构建siRNA，首先鉴定靶标病毒序列。此一种方式为通过对来自 不同毒林或血清型的FMDV序列进行局部同源性分析，并且鉴定有序列同
源性的一段短序列。在一个实施方案中，同源性是100%，即在所有血清 型中是完全一样的序列。在另一实施方案中，观察到1或2个碱基对的差 异。同源性分析通过使用公共可用的或商购的程序(例如GCG包中的 PILEUP和PRETTY程序)来实现。使用PILEUP和PRETTY程序或 FASTA程序，任选的用公共可用的序列(例如Genbank)进行同源性搜索 (Pearson等人,/W^S 85: 2444-2448 (1988))。
一旦鉴定了短同源序列，使用可商购的服务合成siRNA。以不同的长 度合成siRNA。 一些siRNA长为19bp,而其他长为20、 21、 22、 23、 24、 25、 26或27bp。这些siRNA中的每个既可以是在血清型中100%保守的， 也可以是在每个siRNA中有l-2bp的差异。将这些保守序列在适合于递送 到生殖细胞的载体中有效连接到至少一个启动子上。另一种选择是使用已 经合成好的siRNA，见例如在Kahana等人/. WVW. 85: 3213-3217
(2004)中公开的siRNA。
然后使用在WO 99/42569中公开的REMI技术，将这些siRNA构建 体插入到偶蹄动物的生殖细胞(例如精子或卵)中，以产生稳定整合了 siRNA的生殖细胞。然后4吏用该生殖细胞通过本领域已知的方法(例如体外 受精、人工受精)产生转基因动物，以产生抗口蹄疫的动物。
实施例2生成包含赤羽病毒的siRNA的精子
通过在使得构建体进入细胞的条件下孵育精子和构建体来生成非人脊 推动物的精子系，所述构建体包含编码针对赤羽病毒保守区的siRNA的序 列，其中该序列有效连接启动子。非限制性实例包括使用脂质转染或类似 的机制、氯化钙或鱼精蛋白。备选的，使用REMI技术将构建体稳定整合 到宿主细胞基因组中。根据两个标准设计siRNA:在不同的隔离群中具有 高度同源性的区域，以及siRNA靶向发现程序确定的沉默活性的高度似然 性。耙向保守序列的siRNA分子的使用应当确保这些分子切割相同毒株的 大部分病毒(即使不是全部)，而不管它们的来源。另一个和更重要的原因 是序列的保守性指示了对抗改变的强的选择性压力。将期望选择性压力保
证这些靶标序列不改变，因为如果它们改变了，它们将可能阻抑siRNA分 子的抗病毒活性。
实施例3生成包含口蹄疫病毒的siRNA的精子
通过在使构建体进入细胞的条件下孵育精子与构建体来生成非人脊推 动物的精子系，所述构建体包含编码针对口蹄疫病毒保守区的siRNA的序 列，其中该序列有效连接启动子。非限制性实例包括使用脂质转染或类似 的机制，氯化钙或鱼精蛋白。备选的，使用REMI技术将构建体稳定整合 到宿主细胞基因组中。
实施例4生成包含禽流感病毒siRNA的精子
通过在使构建体进入细胞的条件下孵育精子与构建体来生成非人脊推 动物的精子系，所述构建体包含编码针对禽流感病毒保守区的siRNA的序 列，其中该序列有效连接启动子。非限制性实例包括使用脂质转染或类似 的机制，氯化钙或鱼精蛋白。备选的，使用REMI技术将构建体稳定整合 到宿主细胞基因组中。
权利要求
1.包含构建体的非人脊椎动物的生殖细胞，所述构建体包含针对病毒基因组保守区的siRNA的编码序列，其中所述序列有效连接启动子。
2. 权利要求1的生殖细胞，其中构建体包含针对病毒基因组的多个 siRNA的编码序列。
3. 权利要求l的生殖细胞，其中细胞包含多个构建体，所述构建体包 含针对病毒基因组保守区的多个siRNA的编码序列，其中所述序列有效连 接启动子。
4. 权利要求1、权利要求2或权利要求3的生殖细胞，其中脊推动物 是非人哺乳动物。
5. 权利要求4的生殖细胞，其中病毒是口蹄疫病毒(FMDV)。
6. 权利要求5的生殖细胞，其中保守序列选自SEQIDNO:l、 SEQID NO:2和SEQ ID NO: 3。
7. 权利要求1、权利要求2或权利要求3的生殖细胞，其中脊推动物 是禽类物种。
8. 权利要求7的生殖细胞，其中病毒是禽流感病毒。
9. 权利要求8的生殖细胞，其中保守序列选自图1-16中的序列。
10. 权利要求7的生殖细胞，其中病毒是马立克病病毒(MDV)。
11. 权利要求l、权利要求2、权利要求3、权利要求4、权利要求5、 权利要求6、权利要求7、权利要求8、权利要求9或权利要求10的生殖 细胞，其中生殖细胞是精子。
12. 抗病毒疾病的非人脊推动物，其中脊推动物的大部分细胞包含针 对引发疾病的病毒基因组保守区的siRNA的编码序列，其中所述序列有效 连接启动子。
13. 权利要求12的非人脊推动物，其中构建体包含针对病毒基因组保 守区的多个siRNA的编码序列。
14. 权利要求12的非人脊推动物，其中细胞包含多个构建体，所述构建体包含针对病毒基因组保守区的多个siRNA的编码序列。
15. 权利要求12、权利要求13或权利要求14的非人脊推动物，其中 脊推动物是非人哺乳动物。
16. 权利要求15的非人脊推动物，其中病毒疾病是FMDV。
17. 权利要求16的非人脊推动物，其中保守序列选自SEQIDNO:l、 SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3。
18. 权利要求12、权利要求13或权利要求14的非人脊推动物，其中 脊推动物是禽类物种。
19. 权利要求18的非人脊推动物，其中病毒是禽流感病毒。
20. 权利要求19的非人脊推动物，其中保守序列选自图1-16中的序列。
21. 权利要求12的非人脊推动物，其中病毒是MDV。
22. 产生非人脊稚动物生殖细胞的方法，其中生殖细胞是根据权利要 求l的生殖细胞，所述方法包括在使得构建体进入细胞的条件下培育生殖 细胞与构建体，所述构建体包含针对病毒基因组保守区的siRNA的编码序 列，其中所述序列有效连接启动子。
23. 权利要求22的方法，其中将构建体整合到宿主细胞基因组中。
24. 产生根据权利要求12的非人脊推动物的方法(a) 在形成二倍体细胞的条件下培育权利要求l、权利要求2、权利要 求3、权利要求4、权利要求5、权利要求6、权利要求7、权利要求8、权 利要求9、权利要求10或权利要求11的生殖细胞；以及(b) 在形成非人脊推动物的条件下培育(a)的二倍体细胞。
全文摘要
本发明涉及抗病毒感染的遗传修饰的动物。本发明同样提供了制备抗病毒感染的动物的方法。
文档编号C12N15/113GK101184842SQ200680019164
公开日2008年5月21日 申请日期2006年3月31日 优先权日2005年3月31日
发明者荣恩·卡哈纳 申请人:荣恩·卡哈纳