基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法，包括：将可能含有过氧化氢酶的测试样品与过氧化氢、辅助催化剂和氯金酸在满足选定液相环境中混合反应，通过观测混合反应体系的颜色和/或可见光吸收强度，实现对样品中所含过氧化氢酶的检测，其中，所述选定液相环境为适于过氧化氢酶催化降解过氧化氢的液相反应环境。本发明方法操作简便，快速灵敏，测试结果采用肉眼或简单仪器即可检测，成本低廉，弥补了现有的检测过氧化氢酶技术的不足。
【专利说明】基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种过氧化氢酶的检测方法，特别是一种基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法，属于化学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]过氧化氢酶(catalase，CAT)广泛存在于哺乳动物的各组织中，是重要的抗氧化酶，能将有毒性的H2O2转化为无毒害的水和氧气，构成机体第一道抗氧化防线。大量研究发现，CAT与肿瘤的发生关系密切，而这些微生物受到外界H2O2的激发，则会加快过氧化氢酶的产生，即使非常少量的微生物也会产生大量的过氧化氢酶，通过这一点，过氧化氢酶被认为是一种乳腺肿瘤标志性的生物分子。患有乳腺炎的奶牛产出的牛奶中细菌总数、体细胞计数明显高于正常牛奶，CAT通过奶牛体细胞出现在牛奶中，而CAT的水平与牛奶的体细胞计数相关。因此，通过检测牛奶中的CAT有助于发现奶牛是否患有乳腺炎，也可以用于判断原料乳是否感染。
[0003]目前国内外有文献报道了一些较快速灵敏的CAT检测方法，如将微流注射结合伏安电化学法、高效液相结合伏安电化学法，利用CAT的活性分解过氧化氢产生的电流信号变化实现CAT的检测。另外亦有文献报道在表面等离子共振生物传感器表面固定CAT的核酸适配体(Aptamer)捕获CAT实现检测。但是，前述方法均需要复杂和昂贵的仪器，检测成本高，限制它们的实际应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提出一种基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法，其能实现对过氧化氢酶进行方便快速的检测，成本低廉，易于操作，从而克服了现有技术中的不足。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案:
[0006]一种基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法，包括:将可能含有过氧化氢酶的测试样品与过氧化氢、辅助催化剂和氯金酸在满足选定液相环境中混合反应，通过观测混合反应体系的颜色和/或可见光吸收强度，实现对样品中所含过氧化氢酶的检测，
[0007]其中，所述选定液相环境为适于过氧化氢酶催化降解过氧化氢的液相反应环境。
[0008]进一步的，所述辅助催化剂包括柠檬酸钠、抗坏血酸或没食子酸。
[0009]作为较为优选的实施方案之一，该方法可以包括如下步骤:
[0010](I)提供浓度为800μΜ的过氧化氢溶液,且所述过氧化氢溶液还含有浓度为
0.5?2mM的2-吗啉乙磺酸，pH值5.0?7.0 ;
[0011](2)取可能含有过氧化氢酶的测试样品与步骤(I)中所述的过氧化氢溶液按照1:1的体积比混合均匀，并在室温下静置IOmin以上；
[0012](3)提供浓度为5?IOmM的氯金酸溶液、浓度为1.0mM的辅助催化剂溶液和浓度为0.5?2mM的MES溶液按照3?6:3:91的体积比混合；[0013](4)取步骤(2)所得混合溶液与步骤(3)所得混合溶液均匀混合反应5min以上，观测混合反应体系的颜色和/或可见光吸收强度，实现对样品中所含过氧化氢酶的检测。
[0014]进一步的，该方法包括:
[0015]1、取一系列不同浓度的过氧化氢酶标准样品与过氧化氢、辅助催化剂和氯金酸在满足选定液相环境中混合反应，并检测每一标准样品最终所形成的混合反应体系的颜色和/或可见光吸收强度，并依据标准样品浓度与混合反应体系颜色和/或可见光吸收浓度的对应关系建立标准图谱；
[0016]I1、取可能含有过氧化氢酶的测试样品与过氧化氢、辅助催化剂和氯金酸在满足选定液相环境中混合反应，并检测最终所形成的混合反应体系的颜色和/或可见光吸收强度，再与标准图谱比对，从而测得测试样品中所含过氧化氢酶的浓度。
[0017]作为较为优选的实施方案之一，所述可见光的波长为540nm。
[0018]与现有技术相比，本发明至少具有如下优点:该基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法依据过氧化氢酶分解过氧化氢，而过氧化氢还原氯金酸，产生得到颜色不同或深浅不同的纳米金，可用肉眼定性分辨结果，并且可以通过测定光吸收强度等定量分析结果，反应快速灵敏，测试结果采用肉眼或简单仪器即可检测，成本低廉，易于操作，弥补了现有的检测过氧化氢酶技术的不足。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明实施例1中CAT可视化检测显色图，图中从左到右所对应过氧化氢酶的浓度(nM)分别为 40、20、7、2.5,0.8,0.25,0.08、0 ；
[0020]图2是本发明实施例1中CAT检测校正曲线，其中，B:加入过氧化氢酶(0.08，0.25，0.8，2.5，7，20，40nM)所对应的 A540 ；B0:加入过氧化氢酶(OnM)所对应的 A5400
【具体实施方式】
[0021]如前所述，鉴于现有技术中的不足，本发明提供了一种基于纳米金形成的过氧化氢酶检测方法，其通过过氧化氢酶分解过氧化氢，利用柠檬酸钠、抗坏血酸或没食子酸作为辅助催化剂，过氧化氢还原氯金酸，而过氧化氢还原氯金酸的量不同，所显示的光吸收强度及颜色的不同，从而实现可视化检测过氧化氢酶的含量，该检测方法操作简便，快速灵敏，为检测牛奶等液态饮料中过氧化氢酶的含量提供了 一项可视化的检测方法。
[0022]在本发明的一较为优选的实施方案中，该方法可以包括
[0023](I)配制MES(2_吗啉乙磺酸)缓冲溶液，用0.0lM碳酸钾调节pH值。吸取100 μ L不同浓度(如40，20, 7，2.5，0.8，0.25，0.08, OnM)的过氧化氢酶溶液到96微孔板中，每个孔中加入100 μ L800 μ M的过氧化氢溶液,振荡混匀后,静置10?15min。
[0024](2)移取6μ L氯金酸溶液(5?10πιΜ)，3μ L1.0mM柠檬酸钠、抗坏血酸或没食子酸溶液，以及91 μ L1.0mM MES溶液到96微孔板中，再加入上述(I)中100 μ L混合液，振荡混匀，反应IOmin后，观察显色结果，检测540nm处光吸收强度。
[0025]进一步的，在前述步骤(I)中，所述MES溶液的pH值还可以为6.0?7.0，浓度还可以为0.5mM?2mM。
[0026]前述步骤(2)中所使用的氯金酸溶液体积还可以为3?6μ L，浓度还可以为5?10mM。
[0027]更为具体的，该实施方案中的方法还可以为:
[0028](I)配制浓度为0.5mM~2mM的MES缓冲溶液，用0.0lM碳酸钾调节pH值为6.0~
7.0。吸取100 μ L不同浓度(如40，20，7，2.5，0.8，0.25，0.08，OnM)的过氧化氢酶溶液到96微孔板中，每个孔中加入100 μ L800 μ M的过氧化氢溶液，振荡混匀后，静置10~15min。
[0029](2)移取3~6μ L浓度为5~IOmM氯金酸溶液，3 μ L1.0mM柠檬酸钠、抗坏血酸或没食子酸溶液，以及91 μ L MES溶液到96微孔板中，再加入上述(I)中100 μ L混合液，振荡混匀，反应5min后,观察显色结果,或检测540nm处光吸收强度(A54tl)。
[0030]以下结合若干较佳实施例及附图对本发明的技术方案作更为具体的说明。
[0031]实施例1该过氧化氢酶的检测方法原理如下式所示:
[0032]
【权利要求】
1.一种基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法，其特征在于，包括:将可能含有过氧化氢酶的测试样品与过氧化氢、辅助催化剂和氯金酸在满足选定液相环境中混合反应，通过观测混合反应体系的颜色和/或可见光吸收强度，实现对样品中所含过氧化氢酶的检测， 其中，所述选定液相环境为适于过氧化氢酶催化降解过氧化氢的液相反应环境。
2.根据权利要求1所述的基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述辅助催化剂包括柠檬酸钠、抗坏血酸或没食子酸。
3.根据权利要求1所述的基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法，其特征在于，包括如下步骤: (O提供浓度为800 μ M的过氧化氢溶液,且所述过氧化氢溶液还含有浓度为0.5?2mM的2-吗啉乙磺酸，pH值5.0?7.0 ； (2)取可能含有过氧化氢酶的测试样品与步骤(I)中所述的过氧化氢溶液按照1:1的体积比混合均匀，并在室温下静置IOmin以上； (3)提供浓度为5?10mM的氯金酸溶液、浓度为1.0 mM的辅助催化剂溶液和浓度为0.5?2mM的MES溶液按照3?6:3:91的体积比混合； (4)取步骤(2)所得混合溶液与步骤(3)所得混合溶液均匀混合反应5min以上，观测混合反应体系的颜色和/或可见光吸收强度，实现对样品中所含过氧化氢酶的检测。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法，其特征在于，包括: 1、取一系列不同浓度的过氧化氢酶标准样品与过氧化氢、辅助催化剂和氯金酸在满足选定液相环境中混合反应，并检测每一标准样品最终所形成的混合反应体系的颜色和/或可见光吸收强度，并依据标准样品浓度与混合反应体系颜色和/或可见光吸收浓度的对应关系建立标准图谱； I1、取可能含有过氧化氢酶的测试样品与过氧化氢、辅助催化剂和氯金酸在满足选定液相环境中混合反应，并检测最终所形成的混合反应体系的颜色和/或可见光吸收强度，再与标准图谱比对，从而测得测试样品中所含过氧化氢酶的浓度。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的基于纳米金形成的可视化检测过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述可见光的波长为540 nm。
【文档编号】G01N21/78GK103472055SQ201310430745
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】彭池方, 段小慧, 刘丽强, 宋珊珊 申请人:江南大学