专利名称：一种体外重组神经氨酸酶的细胞定位方法
技术领域：
本发明涉及重组蛋白在细胞中的分布及功能分析领域，具体涉及一种体外重组神 经氨酸酶的细胞定位方法。
背景技术：
神经氨酸酶(neuraminidase，ΝΑ)是构成流感病毒胞膜刺突的一个重要蛋白成 分。蛋白质的亚细胞定位是蛋白质功能研究的重要方面，研究发现，NA蛋白在细胞水平上 的抗病活性与其亚细胞定位有关。研究NA蛋白的细胞亚定位对该蛋白抗病功能及其抗病 机理的研究具有重要的意义。从目前蛋白定位研究来看，方法主要是免疫组织化学染色技术，它是应用免疫学 基本原理-抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或者抗体物质定性和定位的组织化学技 术。但该技术是一种多步骤、多因素决定的实验方法，有很多干扰因素，无论是组织取材、固 定、制片、抗原暴露及修复、液体及抗体的配制、修复温度、显色等等因素都会影响免疫组织 化学染色，对试验结果造成直接的影响。而绿色荧光蛋白目前作为一种荧光标记基因，利用 基因工程技术，将该基因整合于感兴趣蛋白cDNA—端使其融合表达蛋白，应用荧光显微镜 可方便、快捷的检测到目的基因的表达，从而减少了实验步骤，加快了实验进展。
发明内容
本发明目的是提供一种体外重组神经氨酸酶的细胞定位方法，该方法能简捷、直 观检测外源基因在细胞水平上的表达位置。本发明所说的体外重组神经氨酸酶的细胞定位方法，可通过以下三个具体步骤来 实现步骤一将神经氨酸酶基因的cDNA(Genebank登录号EU429718. 1，具体序列如 SEQ NO. 1所示)。连接进真核表达载体pcDNA3. 0,构建pcDNA3. O-NA载体，然后再将增强 型绿色荧光蛋白(EGFP)基因连接至pcDNA3.0-NA载体上，构建融合表达载体pcDNA3.0/ EGFP-NA ；步骤二 将含有绿色荧光蛋白(EGFP)基因与神经氨酸酶的融合表达载体 pcDNA3. 0/EGFP-NA 转染 NIH-3T3 细胞；步骤三转染细胞48h后，荧光倒置显微镜下可观察绿色荧光在细胞水平上的表 达位置，以此可确定神经氨酸酶在细胞中亚定位情况。由于神经氨酸酶具有酶切活性，可以酶切去掉细胞表面的唾液酸受体，使细胞免 受粘病毒(如禽流感病毒、新城疫病毒等)的侵染。把某一亚型的NA基因cDNA构建表达 载体导入小鼠3T3(NA_)细胞系中构建能够永久表达NA基因的转基因细胞系，细胞水平上 的抗病毒实验表明，NA具有一定的抗病毒活性。NIH-3T3细胞株是从小鼠胎儿里得到培养建立的，由于它显示出强烈的接触抑制 作用，所以能明确地识别已发生转染的细胞。该细胞自身不能合成并表达NA蛋白，同时能在体外环境中长期的稳定培养，因此能够作为一种重要的细胞材料满足于生物医学研究的 需要。并且经实验表明，连接在一起的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因-NA蛋白基因能在 NIH-3T3细胞中正常翻译，因此，本发明利用增强型绿色荧光蛋白基因与NA基因构建融合 表达载体pcDNA3. 0/EGFP-NA,该载体在NIH-3T3细胞获得表达，通过检测融合表达蛋白在 细胞水平上的表达位置，建立了快速、简捷定位神经氨酸酶的方法。
图1 :pMD-19T-NA载体构建 2 :pcDNA3. O-NA 载体结构3 融合表达载体pcDNA3. 0/EGFP-NA结构4 荧光倒置显微镜下观察EGFP-NA融合蛋白在NIH-3T3细胞中明场(a)、暗场 (A)分布
具体实施例方式1.设计含有EcoR I与Not I两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物上游引物 Fl :5，-CCGCCGGAATTCATGAATCCAAATCAAAAG-3’,下游引物 Rl :5，-ATTTGCGGCCGCCTACTTGTCA ATGGTGAAT-3，。以神经氨酸酶(NA)基因cDNA为模板，扩增的NA基因克隆至pMD_19T (TaKaRa 公司)载体中，构建pMD-19T-NA(如图1)。从构建成功的pMD19_T_NA载体上利用EcoR I与Not I两个限制性内切酶将NA基因酶切回收后定向插入到已经商品化的表达载 pcDNA3. Odnvitrogen公司)的多克隆位点区中，构建的载体命名为“pcDNA3. O-NA”(如图 2)。同时设计含有Hind III和EcoR I的酶切位点的特异性引物(剔除下游引物中的终止 子)上游引物 F2 :5，-GTAAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3，，下游引物 R2 :5，-TCAGAAT TCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3‘。以质粒 PEGFP-N1 (Clontech 公司)为模板，亚克隆 EGFP 基 因至PMD-19T (TaKaRa公司)载体中，构建pMD_19T_EGFP。Hind III和EcoR I两个限制性 内切酶分别酶切PMD-19T-EGFP和pcDNA3. O-NA,将EGFP基因片段与线性化的pcDNA3. O-NA 连接。双酶切与测序鉴定正确，构建载体命名为“pcDNA3. 0/EGFP-NA”(如图3)。2.利用电转染方法介导pcDNA3. 0/EGFP-NA真核表达载体转染NIH-3T3细胞。取 生长良好的NIH-3T3，用0. 25%胰酶适当消化，含10% FBS的DMEM培养液终止消化，200g 离心6 8min，弃上清，加入Eppendorf低渗缓冲液悬浮细胞，细胞计数板计数，调整细胞 浓度为1 X IO6个/mL。吸取370 μ L细胞悬液，小心注入2mm电极杯(容积为400 μ L)中。 将30 μ L质粒pcDNA3. 0/EGFP-NA (浓度为1 μ g/ μ L)加入电极杯中，混合均勻。将电极杯 装入电极槽内，静置lmin，在电压为270V条件下作用80 μ s进行电穿孔实验。操作完毕后， 将电极杯4°C中静置lOmin，小心将细胞转移至6孔板中进行培养。3. 24h后观察细胞贴壁情况。转染48h以后，在荧光倒置显微镜下观察细胞荧光， 以此来分析NA蛋白在活细胞水平的定位(如图4所示)。结果显示NA蛋白主要在胞质近 胞膜表达，而在细胞核内不表达。加入终浓度至500 μ g/mL的G418对细胞进行筛选，每3 天更换一次筛选培养液。持续筛选8天后，获得转基因细胞系。
权利要求
一种体外重组神经氨酸酶的细胞定位方法，包括以下步骤步骤一将神经氨酸酶基因的cDNA连接进真核表达载体pcDNA3.0，构建pcDNA NA载体，然后再将增强型绿色荧光蛋白基因连接至pcDNA NA载体，构建融合表达载体pcDNA3.0/EGFP NA；步骤二将融合表达载体pcDNA3.0/EGFP NA转染NIH 3T3细胞；步骤三转染细胞培养48h后，荧光倒置显微镜下观察绿色荧光在细胞水平上的表达位置，确定神经氨酸酶在细胞中亚定位分布。
全文摘要
本发明涉及一种体外重组神经氨酸酶的细胞定位方法，该方法利用增强型绿色荧光蛋白基因与神经氨酸酶基因构建融合表达载体pcDNA3.0/EGFP-NA，使融合表达载体在NIH-3T3细胞获得表达，然后通过检测融合表达蛋白在细胞水平上的表达位置，建立快速、简捷定位神经氨酸酶的方法。
文档编号C12N15/85GK101899462SQ20101018762
公开日2010年12月1日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者任丽伟, 孙敏, 常国斌, 徐琪, 李碧春, 王霄燕, 田智泉, 陈国宏 申请人:扬州大学