用于检测a型流感病毒的基因芯片、其制备方法及应用的制作方法

专利名称：：用于检测a型流感病毒的基因芯片、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种用于检测多A型流感病毒的基因芯片、其制备方法及应用。
背景技术：
：流感是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。流感病毒基因组含有8个单股负链RNA病毒节段，目前分为16个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型，其亚型鉴定主要依靠血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验，这是世界卫生组织(WHO)进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。基因芯片技术是一种快速、并行、高通量的基因水平的诊断技术，可以应用于并行的检测数百个疾病相关分子，它的出现为禽流感病毒的快速检测和分型提供了可能。基因芯片是研究生物大分子功能的新技术，具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。作为一种高通量的基因检测方法，该技术在微生物检测和鉴定方面的应用越来越多，具有巨大的应用潜力。目前流感诊断主要依靠下述方法(1)病原分离和鉴定；(2)血清学方法检测感者的抗体，常用的检测抗体的技术包括血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验、琼脂扩散试验(AGP)、病毒中和试验、神经氨酸酶抑制试验(NI)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等；(3)RT-PCR快速诊断技术。上述技术由于受到其自身特点限制，都不能实现快速、高通量处理样品的要求，不适应大规模检疫、预报预测急性、烈性传染病的需要。目前国际上已有关于基因芯片技术在流感亚型鉴别上应用的报道。张海燕等建立了寡核苷酸芯片检测技术，对甲型流感病毒及登革病毒进行早期检测及分型。方法根据Genebank中病毒基因组序列的保守区域，设计病毒的特异性检测探针，制备病毒检测芯片；利用限制性显示技术标记样品中的病毒靶序列，将标记产物与芯片杂交、清洗、扫描及结果分析。结果发现，该方法可以正确检测到细胞培养所获得的甲型(H1N1，H3N2)流感病毒和登革四型病毒。杨忠苹等研制了可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型及N1、N2神经氨酸酶亚型的基因诊断芯片，结果显示检测探针可特异性地与相应的标记样品进行杂交，呈现较强的杂交信号，且无交叉杂交。同时，用RT-PCR、鸡胚接种和基因芯片方法对H1-H15亚型AIV参考毒株、30份人工感染样品、21份现地疑似样品进行检测的结果发现，对人工感染样品芯片检测方法与鸡胚接种和RT-PCR的符合率分别为100%和96%，现地样品符合率为100%。杨林等根据猪流感病毒(SIV)的M基因序列设计了1对特异性引物M1/M2，扩增出大小为229bp的目的片段。针对这个基因片段，再设计合成4条寡核苷酸探针，其中反向引物的5'端用荧光素Cy3标记。以荧光标记不对称PCR技术为基础，通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对SIV的检测，建立SIV的基因芯片检测方法。利用该方法对39份猪组织样品进行检测，与RT-PCR检测方法相比，本方法具有良好的特异性和敏感性。试验结果表明，用该方法快速检测组织中SIV是可行的，对该病的快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义。GallA等通过RT-PCR方法和结合基因芯片技术，对流感病毒HA16种亚型进行了分型研究，结果显示通过基因芯片方法，加速了对禽流感病毒的分型诊断时间，准确的对HA进行了分型。由Li等研究制备的流感病毒cDNA分型芯片由24条cDNA探针(每个探针大约500mer)构成，这些cDNA探针由4条HA、3条NA、两个MP蛋白基因从五个不同的流感病毒株序列设计组成，将这24条cDNA探针制成cDNA芯片。用三个多重PCR反应扩增靶核酸，每个多重PCR含有24条引物，扩增时用Cy32dCTP进行标记。通过检测荧光信号强度判断杂交情况，由此对这五个流感进行区分。Ivshina等用48条长度为1722mer的oligo探针制成芯片，以两个多重PCR反应扩增流感病毒的8个片段，成功鉴别了流感病毒的B/Beijing/184/93株和B/Shangdong/7/97株。Sengup等用476条21mer的oligo探针制成芯片，此芯片不仅能够准确区分不同的流感病毒型别及其亚型，而且能对流感病毒8个片段的存在情况进行检测。综合检索的相关文献，关于流感病毒分型鉴定研究大多只涉及到了流感病毒的部分亚型，使用的方法有cDNA芯片，寡核苷酸探针芯片等技术，而应用基因组芯片对流感病毒全部HA和NA亚型进行鉴定尚未见报道。
发明内容本发明的目的是提供一种检测A型流感病毒并可对A型流感病毒进行分型的基因芯片，以弥补现有技术的检测方法存在的不足。本发明的更进一步的目的是提供多种亚型流感病毒分型检测基因芯片的制备方法。本发明还有一个目的是提供用于多种亚型流感病毒分型检测的试剂盒。本发明提供一种用于检测A型流感病毒的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，所述寡聚核苷酸探针含有从一种或多种A型流感病毒的HA、NA和/或M基因中选取的DNA片段。其中，寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，所述质量控制探针包括序列5'-cy3-ggtcactcgttacgaacgc-3'和5'_NH2(C6)gcgttcgtaacgagtgacc-3'，对整个芯片制备和杂交过程起到监测作用)。所述固相载体是经醛基化处理的玻璃片或硝酸纤维素膜等载体；所述寡聚核苷酸探针呈阵列式固定于所述固相载体上。另外，基因芯片上还含有对照与空白的点涂层。所述的从A型流感病毒M基因中选取的DNA片段具有如SEQIDN0:l-4所示的碱基序列；从H1-16种亚型A型流感病毒HA基因中选取的DNA片段具有如SEQIDNO:5-31所示的碱基序列；从Nl-9种亚型A型流感病毒NA基因中选取的DNA片段具有如SEQIDNO:32-45所示的碱基序列，如表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>其中，SEQIDN06序列为2009年甲型H1N1流感病毒NA基因的特有序列探针，可对2009年甲型H1N1流感病毒进行鉴定。上述述寡聚核苷酸探针以小分子连接臂连接，并在探针5'端加入带氨基的六碳基团(5'NH2C6)，例如小分子连接臂可以是poly(dT)15。本发明还提供制备用于检测A型流感病毒的基因芯片的方法，包括如下步骤1)探针的合成将上述寡核苷酸探针进行人工合成，然后纯化；2)芯片的制备对芯片进行打印点样、水合固定和封闭后处理，即得。本发明还提供包含上述基因芯片的试剂盒。本发明进一步提供用于扩增上述基因芯片的寡聚核苷酸探针的引物，其中，根据A型流感病毒M基因设计的引物选自具有SEQIDNO:46-47所示的碱基序列；根据H1-16种亚型A型流感病毒HA基因设计的引物选自具有SEQIDNO:48-79所示的碱基序列；从Nl_9种亚型A型流感病毒HA基因设计的引物选自具有SEQIDNO:80-97所示的碱基序列，参见表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明还提供一种检测A型流感病毒的方法，包括如下步骤1)使用上述用于扩增基因芯片的寡聚核苷酸探针的引物，对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增；2)将扩增产物与上述制备的基因芯片杂交；3)获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。其中，在检测A型流感病毒的方法中，所述引物的荧光标记物可以是HEX。所述杂交中使用的杂交液按质量体积比(g/dl)包括1-5%甲酰胺、10_60%20XSSC(柠檬酸钠缓冲液)和1-30%的10g/dlSDS(十二烷基磺酸钠缓冲液)。优选地，所述杂交中使用的杂交液包括2%甲酰胺、50%20XSSC和2X的10%SDS。具体而言，本发明制备A型流感病毒(多种亚型流感病毒分型检测基因芯片)基因芯片的方法，包括以下步骤(1)探针的设计应用生物信息学方法对NCBI数据库中的A型流感病毒M基因、1-16种A型流感病毒HA基因、1-9种A型流感病毒NA基因序列比进行分析，选择出种内保守性高、种间特异性高的序列作为探针，它们分别具有上述表1所述的碱基序列；(2)探针的合成将设计的寡核苷酸探针进行人工合成，采用PACE方式纯化；(3)芯片的制备包括芯片打印点样、水合固定、封闭后处理等程序即得芯片。本发明针对流感病毒亚型多、变异性强、传播迅速等瓶颈问题，通过对流感病毒全基因组进行扫描和解析，并通过检索权威数据库，参考国内外流行株新特点，所设计的探针能覆盖HA、NA基因的全部序列，制备全基因组芯片，不仅可以对流感病毒进行分型检领"而且还可以对流感病毒HA、NA基因的变异情况进行准确评估。本发明为流感病毒分型鉴别诊断的研究提供全新思路，在流感病毒快速鉴别诊断和检测方面具有十分广阔的应用前景。本发明具有以下有益效果1)本发明的基因芯片可大规模生产，无污染。其质量、精度、效率，比传统细菌检测方法均有提高，加工、操作，使用简便；2)本发明的检测方法操作方便，克服了现有检测方式单一和费时费力的问题，可有效快速解决A型流感病毒的检测问题，具有高效性、特异性、灵敏性的特点，提高了现有的检测效率。3)本发明方法能在短时间内检测大量感染的临床样本，快速准确地获取样品中的信息，检测效率是传统检测手段的数十倍。图1微阵列；图2基因芯片扫描结果。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1—检测A型流感病毒探针与引物的设计与合成登录NCBI在GenBank检索A型流感病毒M全基因、1_16种亚型A型流感病毒HA全基因、1-9种亚型A型流感病毒NA全基因。借助生物信息学软件针对M基因、1-16种亚型A型流感病毒HA基因、l-9种亚型A型流感病毒NA基因，设计多套特异性引物，建立MRT-PCR检测方法，设计多条特异性寡核苷酸探针。所述的探针，从A型流感病毒M基因的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQIDNO:1_4所示的碱基序列；从Hl-16种亚型A型流感病毒HA基因的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQIDNO:5-31所示的碱基序列；从Nl-9种亚型A型流感病毒NA基因的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQIDNO:32-45所示的碱基序列；所述的从A型流感病毒M基因设计的引物选自具有SEQIDNO:46-47所示的碱基序列。根据Hl-16种亚型A型流感病毒HA基因设计的引物选自具有SEQIDNO:48-79所示的碱基序列；从N1-9种亚型A型流感病毒HA基因设计的引物选自具有SEQIDNO:80-97所示的碱基序列。将设计的寡核苷酸探针，以poly(dT)15作为连接臂，并在探针5'端加入带氨基的六碳基团进行人工合成，将设计引物的5'端加入HEX进行荧光修饰，探针引物均采用PACE方式纯化。二芯片点样将合成好的探针干粉管首先进行溶解。步骤如下12000转/分钟，离心5分钟(注意在离心前不要打开干粉管的盖子)，加入双蒸水，溶解至浓度为60M，用振荡器棍匀后快速离心，将管壁上的液体离下。在室温下放置1小时后，将探针加入到384孔板中相应的位置，每孔加入lOi!L探针同时加入10LDMSO。醛基化玻片购自博奥芯片公司，利用自动点样仪将384孔板中的探针点到醛基玻片上，形成我们所设计好的微阵列，点样后芯片于37t:湿盒中放置12h以上水合，然后芯片用洗涤液(0.2%SDS)洗涤后在封闭液(NaBH4溶液)中封闭5min后用水清洗，离心甩干，即得所述多种亚型流感病毒分型检测基因芯片。三流感病毒基因组的提取取经过预处理的0.25mL待检样品中加入0.75mlTRIZOLLSReagent。用加样器充分混合均匀，室温作用5-10min。继续加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温作用15min。于4°C不超过12000rpm离心10min，收集上清(勿吸到两液相间的沉淀物)，加入O.5mL异丙醇，颠倒混合均匀，室温作用10minX4t:不超过12000rpm离心10min，小心倒去上清液，重新加入1.5mL75%冷乙醇。7500-10000rpm离心10min，小心到去乙醇，将离心管倒置于超净工作台15min，风干豁附于管底的核酸沉淀。最后加30iiLDEPCH20至核酸沉淀中，55°C_60°C水浴8-15min，之后_201:保存备用。四RT反应体系及多重不对称PCR体系的建立4.1RT反应体系为30iiL条件优化后，采用TaKaRa公司的M_MLV反转录酶建立如下反转录体系提取的RNA6iiL，反转录引物0.5iiL，无RNA酶水8yL，70。C反应5分钟，放于冰上加入5Xbuffer6iiL，dNTP(10Mm)1.5iiL，M-MLV1.OilL，RnaseInhibitorlul，无RNA酶的水6iiL，42。C孵育20分钟，95t:5分钟，进行反转录(引物使用5'-AGCAAAAGCAGG-3')。4.2多重不对称PCR体系为20iiL多重不对称PCR体系为20iiL，共需要使用6组不对称PCR体系。所使用试剂为2.5,1/LdNTP、双蒸水、Ex-Taq酶(5u/iiL)或TaqDNA聚合酶、10XPCRBuffer、引物(HEX修饰)2Q0ng/PL;引物(非HEX修饰)8ng/yL;第一组PCR反应配置(扩增H1、H2、H3、N1、N2亚型)双蒸水2.3iiL10XPCRBuffer2.5mmo1/Ld證1.5iiL引物SEQIDN0481iiL引物SEQIDN0491iiL引物SEQIDN0501iiL引物SEQIDN0511iiL引物SEQIDN0521iiL引物SEQIDN0531iiL引物SEQID簡O1iiL引物SEQID簡l1iiL引物SEQIDN0821iiL引物SEQIDN0831iiLEx-Taq酶0.2iiLcDNA模板总量第二组PCR反应配置(扩增H4、H5、H6、H7、H9亚型)双蒸水2.3iiLlOXPCRBuffer2.5mmo1/Ld證1.5iiL引物SEQIDN0541iiL引物SEQIDN0551iiL引物SEQIDN0561iiL引物SEQIDN0571iiL引物SEQIDN0581iiL引物SEQIDN0591iiL引物SEQIDN0601iiL引物SEQIDN0611iiL引物SEQIDN0641iiL引物SEQIDN0651iiLEx-Taq酶0.2iiLcDNA模板总量第三组PCR反应配置(扩增H8、H10、H11、H12、H13亚型)双蒸水2.3iiL10XPCRBuffer2.5,1/Ld證1.5iiL引物SEQIDN0621iiL引物SEQIDN0631iiL引物SEQIDN0661iiL引物SEQIDN0671iiL引物SEQIDN0681iiL引物SEQIDN0691iiL引物SEQIDN0701iiL引物SEQIDN0711iiL引物SEQIDN0721iiL引物SEQIDN0731iiLEx-Taq酶0.2iiLcDNA模板总量第四组PCR反应配置(扩增H14、H15、H16、N4、N3亚型)双蒸水2.3iiL10XPCRBuffer2.5,1/Ld證1.5iiL引物SEQIDN0741iiL引物SEQIDN0751iiL引物SEQIDN0761iiL引物SEQIDN0771iiL引物SEQIDN0781iiL引物SEQIDN0791iiL引物SEQIDN0841iiL引物SEQIDN0851iiL引物SEQIDN0861iiL引物SEQIDN0871iiLEx-Taq酶0.2iiLcDNA模板总量第五组PCR反应配置(扩增N5、N6、N7、N8、N9亚型)双蒸水2.3iiL0128]10XPCRBuffer2iiL0129]2.5,1/Ld證1.5iiL0130]引物SEQIDN0881iiL0131]引物SEQIDN0891iiL0132]引物SEQIDN0901iiL0133]引物SEQIDN0911iiL0134]引物SEQIDN0921iiL0135]引物SEQIDN0931iiL0136]引物SEQIDN0941iiL0137]引物SEQIDN0951iiL0138]引物SEQIDN0961iiL0139]引物SEQIDN0971iiL0140]Ex-Taq酶0.2iiL0141]cDNA模板0142]总量0143]第六组PCR反应配置(扩增A型流感病0144]双蒸水2.3iiL0145]10XPCRBuffer0146]2.5,1/Ld證1.5iiL0147]引物SEQIDN0461iiL0148]引物SEQIDN0471iiL0149]Ex-Taq酶0.2iiL0150]cDNA模板0151]总量0152]4.3建立循环参数0153]将PCR管置于PCR扩增仪中，按以下程J55。C退火30s，72。C延伸30s，30个循环，最后72。C延伸反应10min，后4。C保存或进行下一步实验。0154]五杂交0155]5.l杂交前准备0156]CR扩增反应结束前，将杂交用仪器预热至45°C。0157]芯片洗涤液根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液I和II。0158]洗涤液I:SSC终浓度为0.3X，SDS终浓度为0.lg/dl。以配制总量200mL为例，取195mL蒸馏水倒入250mL试剂瓶中，加入3mL0159]20XSSC，混匀。再加入2mL10g/dlSDS，混匀。0160]洗涤液II:SSC终浓度为O.06X。以配制总量200mL为例，取199.4mL蒸馏水倒入250mL试剂瓶中，加入0.6mL20XSSC，混匀。若10g/dlSDS产生白色絮状沉淀，请于50°C水浴中融化混匀后配制洗液。蒸馏水冰水混合物5.2杂交反应混合物的配制、变性及冰浴根据样品数目准备200yL离心管并编号。取出杂交缓冲液，5(TC加热使其完全融化。充分混匀后，在微量离心机中瞬时离心，按每份4iiL分装。将PCR产物加热至96t:(置于PCR仪中变性即可)变性5分钟。之后，立即取出，浸入冰水混合物中冰浴3分钟。从同一个样品模板的六个不同扩增体系管中各取2iiLPCR产物加入到对应样品编号的4iiL杂交缓冲液管中，充分混匀并瞬时离心。5.3芯片杂交反应用移液器将杂交反应混合物加入到芯片上，16iU/阵列。记录芯片编号、阵列位置及对应的样品编号。放入预热到45t:的杂交用仪器中。计时90分钟。5.4芯片的洗涤与干燥杂交反应结束后，将芯片取出，立即放在盛有平衡至42t:洗涤液I的容器中(如有玻片架，可将玻片架置于盛有洗涤液的容器中，然后将芯片竖直插在玻片架上；如没有玻片架，可将芯片正面向上平放在容器底部)，于预热至42t:的摇床上80rpm洗涤2min。迅速将芯片从洗涤液i中取出放入预热好的平衡至42t:洗涤液n的容器中，42t:摇床80rpm洗涤2min。将芯片放入微阵列芯片离心管，再放入离心机中1000rpm离心2min，甩干后扫描。六扫描将玻片用GenePix4100A扫描仪扫描，PMT与激光强度设置分别设定为650与10，激发波长为532nm:扫描图象用扫描仪自带的图象分析软件或Imagene等专用图像分析软件对扫描结果进行定量分析。七结果分析在进行结果判定前首先比较同一条探针4个重复点的信号值差异，去掉偏离最远的一个信号值，用剩下的三个信号值作为有效数值进行结果判断，分析结果，检测结果信噪比SNR532大于1.5初步判定为阳性信号。其中M基因探针，位点处出现阳性信号判定为A型流感病毒；根据H/N相应探针位点处信号，判定流感病毒亚型；若有多条HA亚型探针出现阳性信号，则将信燥比均值大的探针判定为确诊亚型，其它为弱阳性或假阳性；如果SEQIDN035序列探针出现阳性信号且有M基因探针出现阳性信号则可判定为2009年甲型H1N1流感病毒。实验例l利用本发明制备的基因芯片检测吉林省CDC送检6例临床疑似甲型H1N1流感病毒标本—芯片点样将合成好的H1、H2、H3、N1、N2亚型及M探针干粉管首先进行溶解。步骤如下12000转/分钟，离心5分钟(注意在离心前不要打开干粉管的盖子)，加入双蒸水，溶解至浓度为60iiM，用振荡器棍匀后快速离心，将管壁上的液体离下。在室温下放置1小时后，将探针加入到384孔板中相应的位置，每孔加入10iiL探针同时加入10iiLDMSO。醛基化玻片购自博奥芯片公司，利用自动点样仪将384孔板中的探针点到醛基玻片上，形成我们所设计好的微阵列(参见图一)，点样后芯片于37t:湿盒中放置12h以上水合，然后芯片用洗涤液(0.2%SDS)洗涤后在封闭液(NaBH4溶液)中封闭5min后用水清洗，离心甩干，即得所述多种亚型流感病毒分型检测基因芯片。二流感病毒基因组的提取取经过预处理的O.25mL6例临床疑似甲型H1N1流感病毒待检样品分别加入0.75mlTRIZOLLSReagent。用加样器充分混合均匀，室温作用5-10min。继续加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温作用15min。于4t:不超过12000rpm离心10min，收集上清(勿吸到两液相间的沉淀物)，加入0.5mL异丙醇，颠倒混合均匀，室温作用10minX4t:不超过12000rpm离心10min，小心倒去上清液，重新加入1.5mL75%冷乙醇。7500-10000rpm离心10min，小心到去乙醇，将离心管倒置于超净工作台15min，风干豁附于管底的核酸沉淀。最后加30iiLDEPCH20至核酸沉淀中，55t:-6(TC水浴8-15min，之后-2(TC保存备用。三RT反应体系及多重不对称PCR体系的建立3.1RT反应体系为30iiL条件优化后，采用TaKaRa公司的M-MLV反转录酶建立如下反转录体系提取的RNA6iiL，反转录引物0.5iiL，无RNA酶水8yL，70。C反应5分钟，放于冰上加入5Xbuffer6iiL，dNTP(10Mm)1.5iiL，M-MLV1.OiiL，RnaseInhibitorlul，无RNA酶的水6iiL，42。C孵育20分钟，95t:5分钟，进行反转录(引物使用5'-AGCAAAAGCAGG-3')。3.2多重不对称PCR体系为20iiL多重不对称PCR体系为20iiL，共需要使用两组不对称PCR体系。所使用试剂为2.5mmol/LdNTP、双蒸水、Ex-Taq酶(5u/iiL)或TaqDNA聚合酶、10XPCRBuffer、引物(HEX修饰)200ng/PL;引物(非HEX修饰)8ng/yL;第一组PCR反应配置(扩增H1、H2、H3、N1、N2亚型)双蒸水2.3iiLlOXPCRBuffer2iiL2.5mmol/Ld證1.5iiL引物SEQIDN0481iiL引物SEQIDN0491iiL引物SEQIDN0501iiL引物SEQIDN0511iiL引物SEQIDN0521iiL引物SEQIDN0531iiL引物SEQIDN0801iiL引物SEQIDN0811iiL引物SEQIDN0821iiL引物SEQIDN0831iiLEx-Taq酶0.2iiLcDNA模板4iiL总量20iiL第二组PCR反应配置(扩增A型流感病毒M基因，为通用)双蒸水2.3iiL10XPCRBuffer10iiL2.5mmol/LdNTP1.5iiL引物SEQIDN0461iiL引物SEQIDN0471iiLEx-T叫酶0.2iiLcDNA模板4iiL总量20iiL3.3建立循环参数将PCR管置于PCR扩增仪中，按以下程序进行94t:预变性5min，94t:变性30s，55。C退火30s，72。C延伸30s，30个循环，最后72。C延伸反应10min，后4。C保存或进行下一步实验。四杂交4.l杂交前准备CR扩增反应结束前，将杂交用仪器预热至45°C。芯片洗涤液根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液I和II。洗涤液I:SSC终浓度为0.3X，SDS终浓度为0.lg/dl。以配制总量200mL为例，取195mL蒸馏水倒入250mL试剂瓶中，加入3mL20XSSC，混匀。再加入2mL10g/dlSDS，混匀。洗涤液II:SSC终浓度为O.06X。以配制总量200mL为例，取199.4mL蒸馏水倒入250mL试剂瓶中，加入0.6mL20XSSC，混匀。若10g/dlSDS产生白色絮状沉淀，请于50°C水浴中融化混匀后配制洗液。蒸馏水冰水混合物4.2杂交反应混合物的配制、变性及冰浴根据样品数目准备200L离心管并编号。取出杂交缓冲液，5(TC加热使其完全融化。充分混匀后，在微量离心机中瞬时离心，按每份4iiL分装。将PCR产物加热至96。C(置于PCR仪中变性即可)变性5分钟。之后，立即取出，浸入冰水混合物中冰浴3分钟。从同一个样品模板的六个不同扩增体系管中各取2i！LPCR产物加入到对应样品编号的4iiL杂交缓冲液管中，充分混匀并瞬时离心。4.3芯片杂交反应用移液器将杂交反应混合物加入到芯片上，16iU/阵列。记录芯片编号、阵列位置及对应的样品编号。放入预热到45t:的杂交用仪器中。计时90分钟。4.4芯片的洗涤与干燥杂交反应结束后，将芯片取出，立即放在盛有平衡至42t:洗涤液I的容器中(如有玻片架，可将玻片架置于盛有洗涤液的容器中，然后将芯片竖直插在玻片架上；如没有玻片架，可将芯片正面向上平放在容器底部)，于预热至42t:的摇床上80rpm洗涤2min。迅速将芯片从洗涤液I中取出放入预热好的平衡至42t:洗涤液n的容器中，42t:摇床80rpm洗涤2min。将芯片放入微阵列芯片离心管，再放入离心机中1000rpm离心2min，甩干后扫描。五扫描将玻片用GenePix4100A扫描仪扫描，PMT与激光强度设置分别设定为650与10，激发波长为532nm:扫描图象用扫描仪自带的图象分析软件或Imagene等专用图像分析软件对扫描结果进行定量分析(参见图二)。六结果分析有四例疑似样品检测时SEQIDN06序列探针出现阳性信号且有M基因探针出现阳性信号则可判定为2009年甲型H1N1流感病毒。经上述本发明所建立的基因芯片杂交后，检测结果显示，甲型H1N1流感病毒阳性的有4例，阴性有2例。同时对此6例临床疑似甲型H1N1流感病毒标本进行实时荧光定量PCR方法检测，结果相同序列表〈110〉中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所〈120〉用于检测A型流感病毒的基因芯片、其制备方法及应用〈130>KHP09113254.6〈160>97〈170>PatentInversion〈210>1〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1tccgctgcctgttcactc〈210>2〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tctgctgcytgttcrctt〈210>3〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3tccgctgcctgctcactt〈210>4〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4tctgctgcctgctcactt〈210〉5〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5tgtccagtaatagttcattctcc〈210>6〈211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈400>6gtagatggatggtgaatgcc〈210>7〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈400>7aacttcttgctgtatcttgatg￡i〈210>8〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>83tgat肌tecC3gatccagcatt〈210>9<211>21〈212>腿〈213〉人工序列〈400>9tc朋gc3gagtccagtegteg〈210>10<211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉10tgagttgatgattcctgatc〈210>11232023232122〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>11g朋gaatgacggattgccaa〈210〉12〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列<400>12gattgctgcttgagtgctt〈210>13〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13atctgctgcttgtcctgtg〈210>14〈211>21<212>DNA<213>人工序列〈400〉14tgatggaatttctcgttcgtt〈210>15〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉15gttctgaaagggcttagttgtagt〈210>16〈211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈400>16gaactcgccactgttgaata〈210>17〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列说明书17/30页241919212420<400〉17ttccgtttcttacactttccat22〈210〉18<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>18tcctctctgtttagtcttgct21〈210〉19<211〉25〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉19ctctagtctcaatctgtggaacatt25〈210〉20〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉203g3gttcagcattet;agg3c22〈210>21<211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>21ttctgttetggaatctctggtc22〈210〉22<211〉23〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉22ctccactatgtatgaccaacctt23〈210〉23〈211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉23teagttccttcagattccagc21〈210>24〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>24ccgttccgaattgtctcca〈210〉25〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列<400>25gtcttctctatcagcctgttc朋t〈210>26〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>26ctgttcaacttggactcctcUc〈210>27〈211>25<212>DNA<213>人工序列〈400〉27atgtttattctgctttccacttctg〈210>28〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>28atcttgacaggctgatgatectcc〈210>29〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400>293g3gatag3gcctgacateagage〈210>30〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列说明书19/30页192423252424〈400>30attacattgcctetctgctgct〈210〉31〈211〉24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>31朋gacaag朋gcagttectccatc〈210〉32〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉32cctgttagttctggatgctg〈210>33<211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>33ccgctatatcctgaccactc<210>34〈211>23〈212〉DNA〈213>人工序列<400>34gaagcaaggtcttatacaatcca〈210>35〈211〉23〈212>DNA<213>人工序列<400>35tettgagaagttattgtctgtec〈210〉36〈211>21<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉36ttccttctctatggtggtgtt〈210>37242020232321〈211〉19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>37ttacattgcggctttgacc〈210〉38〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>38ggatcgc;atgacacataagg20〈210>39〈211>28〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>39cagactcttgagttcttagtatatcctt28〈210>40〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>40attgtcgttgtctataatgtcctgt25〈210>41〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400>41gtccaaccgtcttctatcaatagg24〈210>42<211>24〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>42attattgttgttgttgagttggtt24<210>43〈211〉25〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉43ccagtgatcggattattacagtctc25〈210〉44<211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉44gcatgatgattcctgagttcttaga25〈210>45〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉45cgtagcatgagcattcttcaatatg25〈210>46〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉46gcactacggcaaaggctatg20〈210>47〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉47gcactcccattcgcttctg19〈210>48〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉48朋朋g朋gtcctygtrctetgg22〈210>49〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉49acattyatccattgrtgcatt21〈210>50〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>50gctacccaggcagtttcaatg〈210〉51〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列〈400>51tctccgcttgtgttgttgtatg22〈210>52〈211>22〈212>DNA<213>人工序列〈400>52aaatggttgggagggaatgatg22〈210>53〈211>20〈212>DNA<213>人工序列〈400〉53gcgttgtacgaccagagatc20〈210>54〈211>22<212>DNA〈213〉人工序列〈400>54ttccaatagggtcttgcgttag22〈210>55〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>55gccttgccagccattctc18<210>56〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>56acgac朋ggtccgactecag20〈210>57〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>57gattgccagtgctagggaac20〈210>58<211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>58gccacatgccagactattgc20〈210>59〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>59tcattccagtccatcctccttc22<210>60〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>60gggaagttaaaccggctcatag22〈210>61〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列〈400>61cagttgtctcctcactcttteg22〈210〉62〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>62caccattggaactgegagae20〈210>63〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>63ggattgaccacctgttgatgc〈210>64<211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>64gcsigtggaag3tggg朋;agg〈210>65<211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>653t朋caagagatgaggcgacag〈210>66〈211>19〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>66tggtcaggctgcggattac〈210>67〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>67gttgcttcctcaccctttcg<210>68〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>68gacggatgctg朋3g3t朋tgc〈210>69〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列i兑明书25/30页212022192022〈400>69tgctgccaacacaagactac〈210>70〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>70agtggctggctggtatgg〈210>71<211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>71tcc朋cagaac朋gc朋ttc〈210>72〈211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>72朋cgg3gttaatcgcacctec<210>73〈211〉19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>73ttcctcgcctcgtcttcag〈210>74〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列〈400>74gcttcttctcccgactaaactg〈210〉75〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>75tgcttatcctgccgctctg〈210>7620182221192219〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>76tg朋gtgg3gC3gC卿t3gg〈210〉77〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>77ttccatcctcctcggcattc〈210>78〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>78c朋tggtgaactecggcatctc〈210>79〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>79tctgtgtctgggtggtgaatc〈210>80〈211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400>80cagtggagttttyggwgac〈210>81<211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>81accc3g3arc朋ggtcttetrc〈210>82〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列212022211922〈400〉82gacc朋cacc3ccwtegag3〈210〉83〈211〉20〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>83gggiycgcEiyg，c;ateagg〈210〉84<211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉84agg卿tatgtgttgcttggtc〈210〉85〈211>19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉85gc;actettegccgcaggac〈210>86〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>86tggg朋gggEi卿tetggagtg〈210〉87〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉87cctgttgtctcacctcteatgc<210〉88〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉88agggagtgggacg朋caac〈210>892220221922221930<211〉21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉89〈210〉90〈211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉90gccacaggaatgacactatcg21〈210>91〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>91cttcacatagaggcttggtcag22〈210〉92〈211〉21〈212>DNA〈213>人工序列<400〉92gccagacacatagaggaatgc21<210〉93〈211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉93cactatccaggaagccgaatc21〈210>94<211〉18〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>94aggcagtagcgtggtcag18〈210〉95〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列[0810[0811[0812[0813:[0814:[0815:[0816:[0817[0818[0819[0820[0821[0822:[0823:〈400>95ttgctggtccatctgtcattac22〈210>96〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>96tctgaatgcgtatgccacaac21〈210>97〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列<400>97tgagccctgccaattetccc20权利要求一种用于检测A型流感病毒的基因芯片，其特征在于，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，所述寡聚核苷酸探针含有从一种或多种A型流感病毒的HA、NA和/或M基因中选取的DNA片段。2.根据权利要求l所述的用于检测A型流感病毒的基因芯片，其特征在于，所述固相载体是经醛基化处理的玻璃片或硝酸纤维素膜；所述寡聚核苷酸探针呈阵列式固定于所述固相载体上。3.根据权利要求1所述的用于检测A型流感病毒的基因芯片，其特征在于，所述的从A型流感病毒M基因中选取的DNA片段具有如SEQIDNO:1_4所示的碱基序列；从Hl-16种亚型A型流感病毒HA基因中选取的DNA片段具有如SEQIDNO:5-31所示的碱基序列；从N1-9种亚型A型流感病毒NA基因中选取的DNA片段具有如SEQIDNO:32-45所示的碱基序列。4.根据权利要求1-3任一项所述的用于检测A型流感病毒的基因芯片，其特征在于，所述寡聚核苷酸探针以小分子连接臂连接，并在探针5'端加入带氨基的六碳基团。5.制备权利要求1-4任一项用于检测A型流感病毒的基因芯片的方法，包括如下步骤1)探针的合成将权利要求1-4所述寡核苷酸探针进行人工合成，然后纯化；2)芯片的制备对芯片进行打印点样、水合固定和封闭后处理，即得。6.包含权利要求l-5任一项所述基因芯片的试剂盒。7.用于扩增权利要求l-6任一项所述的基因芯片的寡聚核苷酸探针的引物，其中，根据A型流感病毒M基因设计的引物选自具有SEQIDNO:46-47所示的碱基序列；根据Hl-16种亚型A型流感病毒HA基因设计的引物选自具有SEQIDNO:48-79所示的碱基序列；从Nl-9种亚型A型流感病毒HA基因设计的引物选自具有SEQIDNO:80-97所示的碱基序列。8.—种检测A型流感病毒的方法，包括如下步骤1)使用权利要求7所述的用于扩增基因芯片的寡聚核苷酸探针的引物，对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增；2)将扩增产物与权利要求1所述的基因芯片杂交；3)获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。9.根据权利要求8所述的检测A型流感病毒的方法，其特征在于，所述引物的荧光标记物是HEX;所述杂交中使用的杂交液按质量体积比(g/dl)包括1_50%甲酰胺、10-60%20XSSC、和l-30X的10g/dlSDS。10.根据权利要求9所述的检测A型流感病毒的方法，其特征在于，所述杂交中使用的杂交液为2%甲酰胺、50%20XSSC、和2%的10%SDS。全文摘要本发明涉及一种A型流感病毒分型的基因芯片、其制备方法，检测方法和检测试剂盒，其中基因芯片包括固相载体和固定在该载体上的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针含有从一种或多种A型流感病毒的HA、NA和/或M基因选取的DNA片段。本发明具备极高的灵敏度和特异性。本发明的芯片采用多重PCR扩增方式，可同时用于对多组A型流感病毒基因检测和组别鉴定，具有阔的应用前景，可鉴别到具体的血清型，且其检测和分析方法高效快捷，可用于生命科学、医学检验、食品安全、环境监督、进出口检验检疫、生物恐怖防范、流行病学监控等领域。文档编号C12N15/11GK101701266SQ200910250409公开日2010年5月5日申请日期2009年11月27日优先权日2009年11月27日发明者南文龙,孙珊珊,张金双,李昌,李霄,田明尧,谭磊,赵翠青,金宁一,金扩世,颜雯,鲁会军申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所