流感病毒突变体及其用途

流感病毒突变体及其用途
【专利摘要】本文中公开了与突变体病毒有关的组合物和方法，具体地是突变体流感病毒。本文中公开的突变体病毒包括突变体M2序列，且可用于免疫原性组合物中，例如，作为疫苗。本文中也公开了用于繁殖病毒突变体的方法、组合物和细胞，以及与疫苗接种有关的方法、装置和组合物。
【专利说明】流感病毒突变体及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年6月24日提交的美国临时申请号61/501，034的权益，其内容通过引用整体并入本文。
【背景技术】
[0003]流感是美国成年人死亡的主要原因。每年，约36，000人死于流感，超过200，000人住院。流感是一种高度接触传染的疾病，其通过咳嗽、喷嚏和通过与携带病毒的物体(诸如门把手和电话)的直接物理接触而传播。流感的征状包括发热、极度疲劳、头痛、寒冷和身体疼痛；约50%的受感染者没有征状，但是仍然是接触传染的。免疫接种在65岁以下的健康人中具有70-90%的预防流感的有效性，只要循环病毒株的抗原性与疫苗的抗原性匹配。
[0004]疫苗接种是预防流感的主要方法，并且活的减毒的和灭活的(杀死的)病毒疫苗都是目前可得到的。通常鼻内施用的活病毒疫苗会活化免疫系统的所有阶段，且可以刺激针对多种病毒抗原的免疫应答。因而，活病毒的应用克服了在灭活病毒疫苗的制备过程中可能发生的病毒抗原破坏的问题。另外，与由灭活疫苗诱导的免疫相比，由活病毒疫苗产生的免疫通常更持久、更有效和更有交叉反应性，并且活病毒疫苗的生产成本比灭活的病毒疫苗更低。但是，减毒病毒的突变经常是不太确定的，且恢复是一个问题。

【发明内容】

[0005]在一个方面，本公开内容提供了一种核酸序列，其包含SEQ ID N0:1。
[0006]在一个方面，本公开内容提供了一种核酸序列，其包含SEQ ID N0:2。
[0007]在一个方面，本公开内容提供了一种核酸序列，其包含SEQ ID N0:3。
[0008]在一个方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含与(i)启动子和(ii)转录终止序列可操作地连接的SEQ ID N0:USEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3。
[0009]在一个方面，本公开内容提供了一种重组流感病毒，其包含M基因中的突变。在某些实施方案中，所述重组流感病毒包含SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3。在某些实施方案中，所述M基因中的突变导致病毒表达M2蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。在某些实施方案中，在体外宿主细胞系统中至少10代，所述M基因中的突变不会恢复成野生型或编码功能性M2蛋白的非野生型序列。在某些实施方案中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些实施方案中，所述病毒在被所述病毒感染的哺乳动物中是非致病性的。在某些实施方案中，所述体外细胞系统包含中国仓鼠卵巢细胞。在某些实施方案中，所述体外细胞系统包含VeiO细胞。
[0010]在一个方面，本公开内容提供了一种细胞，其包含权利要求5-10中的任一项所述的重组流感病毒。在某些实施方案中，所述细胞是在体外。在某些实施方案中，所述细胞是在体内。
[0011]在一个方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含:含有M基因中的突变的重组流感病毒。在某些实施方案中，所述组合物包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，所述M基因中的突变导致病毒表达M2蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。在某些实施方案中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些实施方案中，所述组合物对施用所述组合物的哺乳动物是非致病性的。在某些实施方案中，在给哺乳动物施用所述组合物以后约3周内，所述组合物在哺乳动物中引起可检测的免疫应答。
[0012]在一个方面，本公开内容提供了一种疫苗，其包含:含有M基因中的突变的重组流感病毒。在某些实施方案中，所述疫苗包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3。在某些实施方案中，所述M基因中的突变导致病毒表达M2蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。在某些实施方案中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些实施方案中，所述疫苗对施用所述疫苗的哺乳动物是非致病性的。在某些实施方案中，在给哺乳动物施用所述疫苗以后约3周内，所述疫苗在哺乳动物中引起可检测的免疫应答。在某些实施方案中，除了所述重组病毒以外，所述疫苗包含至少2种不同的流感病毒株。在某些实施方案中，所述疫苗包含至少一种乙型流感病毒或乙型流感病毒抗原。在某些实施方案中，所述疫苗包含至少一种丙型流感病毒或丙型流感病毒抗原。在某些实施方案中，所述疫苗包含一种或多种病毒或病毒抗原，所述病毒或病毒抗原包含人甲型流感和得自非人物种的大范围流行流感病毒。在某些实施方案中，所述疫苗包含选自HlNl、H2N2和H3N2的人甲型流感病毒。
[0013]在一个方面，本公开内容提供了一种用于繁殖重组流感病毒的方法，所述方法包括:使宿主细胞与重组流感病毒SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3接触；在适合病毒复制的条件下，温育宿主细胞足够的时间，和分离后代病毒颗粒。
[0014]在一个方面，本公开内容提供了一种用于制备疫苗的方法，所述方法包括:将宿主细胞放入生物反应器中；使所述宿主细胞与重组病毒SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ IDN0:3接触；在适合病毒繁殖的条件下，温育所述宿主细胞足够的时间；分离后代病毒颗粒；和配制所述后代病毒颗粒用于作为疫苗来施用。
[0015]在一个方面，本公开内容提供了一种用于免疫受试者的方法，所述方法包括:施用包含重组流感病毒的组合物,所述重组流感病毒包含M基因中的突变，其中所述M基因中的突变导致病毒表达M2蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
[0016]在一个方面，本公开内容提供了一种用于降低受试者中的甲型流感病毒感染的可能性或严重程度的方法，所述方法包括:施用包含重组流感病毒的组合物，所述重组流感病毒包含M基因中的突变，其中所述M基因中的突变导致病毒表达M2蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。在某些实施方案中，所述重组流感病毒包含SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3。在某些实施方案中，所述方法包括:提供至少I个加强剂量的组合物，其中在第一次施用以后3周提供所述至少I个加强剂量。在某些实施方案中，所述方法包括:鼻内地、肌肉内地或皮内地施用所述组合物。在某些实施方案中，所述方法包括:皮内地进行施用。在某些实施方案中，所述方法包括:使用微型针递送装置进行施用。
[0017]在一个方面，本公开内容提供了一种用于皮内施用免疫原性组合物的方法，所述方法包括:(a)提供微型针递送装置，其包括(i)穿刺机构；(ii)免疫原性组合物层，其包括多个能够刺穿皮肤和允许免疫原性组合物皮内施用的微型针；和(b)压迫所述穿刺机构；其中所述免疫原性组合物包含含有M基因中的突变的重组流感病毒，且其中所述M基因中的突变导致病毒表达M2蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。在某些实施方案中，所述重组流感病毒包含SEQ ID NOiUSEQ ID NO:2或SEQ ID N0:3。在某些实施方案中，所述微型针阵列最初位于装置壳体的内部，并在杆致动后，允许微型针延伸穿过装置底部并插入皮肤中，由此允许疫苗流体输注进皮肤中。
[0018]在一个方面，本公开内容提供了一种重组流感病毒，其包含M基因中的突变，其中所述病毒不在未修饰的选自以下的宿主细胞中复制:a中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、或Madin-Darby犬肾细胞。在某些实施方案中，所述M基因中的突变导致病毒表达M2蛋白的失败，或者造成病毒表达具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
[0019]在一个方面，本公开内容提供了一种重组细胞，其包含编码流感病毒M2离子通道基因的核酸，其中所述核酸在所述细胞中表达。
[0020]在一个方面，本公开内容提供了一种重组细胞，其包含2，6-唾液酸受体基因。
[0021]在一个方面，本公开内容提供了一种重组细胞，其包含表达(i)病毒的M2离子通道基因和(ii) 2，6-唾液酸受体基因的细胞基因组或表达载体。在某些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述真核细胞是中国仓鼠卵巢细胞或Vero细胞。在某些实施方案中，所述重组细胞进一步包含人流感病毒，其中所述病毒不表达功能性M2蛋白。
[0022]在一个方面，本公开内容提供了一种用于生产重组流感病毒颗粒的方法，所述方法包括:(A)用人流感病毒感染权利要求47-52中的一项所述的细胞，其中所述细胞要么(i)组成型地表达功能性 的M2离子通道蛋白，要么(ii)在病毒感染以后被诱导表达功能性的M2离子通道蛋白，且其中所述病毒仅在有细胞表达的功能性M2离子通道蛋白存在下成功地复制；和(B)分离后代病毒颗粒。在某些实施方案中，所述方法进一步包括:将分离的病毒颗粒配制成疫苗。在某些实施方案中，所述病毒包含人流感病毒，且其中所述病毒不表达功能性M2蛋白。
【专利附图】

【附图说明】
[0023]图1的图描绘了 M2离子通道在流感病毒生命周期中的作用，其中(I)流感病毒附着于细胞表面上的唾液酸受体；(2)病毒被内化进细胞中；(3)M2离子通道在病毒表面上表达；(4)M2离子通道打开以允许质子进入，从而导致进入细胞核的病毒RNA的释放，发生复制，并导致病毒蛋白合成；和(5)病毒组分被包装进病毒粒子中和释放。
[0024]图2是野生型和突变体M2基因的示意图。如下删除A/Puerto Rico/8/1934 (PR8)M区段的M2基因:在Ml蛋白的开放读码框下游插入2个终止密码子，随后删除跨膜结构域中的51个核苷酸以抑制全长M2蛋白的表达。
[0025]图3显示了未加工的Ml和M2的核苷酸序列。
[0026]图4的图显示了正常MDCK细胞和稳定表达M2蛋白的MDCK细胞(M2CK)中的Μ2Κ0(ΛΤΜ)(上图)和野生型PR8(下图)病毒的生长动力学。以10_5的感染复数，用病毒感染细胞。确定细胞上清液中的病毒滴度。野生型PR8在两个细胞类型中生长至高滴度，而M2K0 ( Δ TM)仅在M2CK细胞中生长得较好，在MDCK细胞中根本不生长。[0027]图5的蛋白质印迹表明，Μ2Κ0(ΔΤΜ)病毒在正常细胞中生产病毒抗原，但是不生产M2。用PR8感染的小鼠血清(组Α)或抗-M2单克隆抗体(组B)探测细胞裂解物。泳道1，分子量标志物；泳道2，被PR8感染的MDCK细胞；泳道3，被Μ2Κ0( Λ TM)感染的MDCK细胞；泳道4，未感染的MDCK细胞。
[0028]图6的图显示了接种Μ2Κ0变体以后小鼠体重的变化。
[0029]图7Α的图显示了接种Μ2Κ0变体的小鼠中的抗体应答。
[0030]图7Β的图显示了感染后6周加强的小鼠的血清中的抗_PR8IgG抗体滴度。
[0031]图8的图显示了接种M2K0变体以后，流感攻击以后小鼠体重的变化。
[0032]图9的图显示了接种M2K0变体以后，流感攻击以后的小鼠存活。
[0033]图10的图显示了鼻内地(IN)、真皮内地(ID)或肌肉内地(頂)接种PR8以后小鼠体重的变化。
[0034]图1lA的图显示了在接种PR8以后2周从具有1.SxlO'pfu (Lo)或1.8xl04pfu (Hi)的病毒浓度的小鼠收集的血清中的抗体滴度。图1lB的图显示了在接种PR8以后7周从具有1.SxIO1Pfu(Lo)或1.8xl04pfu(Hi)的疫苗浓度的小鼠收集的血清中的抗体滴度。
[0035]图12的图显示了在接种PR8以后，流感攻击以后的小鼠存活。
[0036]图13的图显示了在接种PR8以后，流感攻击以后的小鼠体重的变化。
[0037]图14的图显示了接种后7周从小鼠收集的血清中的抗体滴度，所述小鼠真皮内地接种 1.8xl04pfu PR8。`
[0038]图15的图显示了真皮内地接种1.8x104pfu PR8的小鼠的体重的变化。
[0039]图16的图显示了被杂亚型病毒感染的小鼠在攻击后的存活百分比。
[0040]图17的图显示了得自不同疫苗接种组的小鼠的ELISA滴度。
[0041]图18的图显示了同亚型病毒感染以后小鼠的存活百分比。
[0042]图19的图显示了杂亚型病毒攻击以后小鼠的存活百分比。
[0043]图20的图显示了接种的雪貂(ferret)的体重的变化。给雪貂接种IO7TCID5tl的Μ2Κ0(ΔΤΜ)病毒(组Α)或IO7TCID5tl的A/布里斯班/10/2007 (Η3Ν2)甲型流感病毒(组B)。接种后监测体重3天。
[0044]图21的图显示了接种的雪貂的体温的变化。给雪貂接种IO7TCID5tl的Μ2Κ0( Λ TM)病毒(组Α)或IO7TCID5tl的A/布里斯班/10/2007 (H3N2)甲型流感病毒(组B)。接种后监测体温3天。
[0045]图22的图显示了疫苗接种以后雪貂的体重的变化。给雪貂接种IO7TCID5tl的M2K0 ( Δ TM)病毒[Gl 和 G3]、IO7TCID50 的 FM#6 病毒[G2 和 G4]或 OPT1-MEM? [G5]。在激发疫苗接种以后(组A)和接受加强疫苗以后(组B)，监测体重的变化14天。
[0046]图23的图显示了攻击以后雪貂的体重的变化。用IO7TCID5tl的A/布里斯班/10/2007 (H3N2)甲型流感病毒攻击雪貂。接种后监测体重14天。
[0047]图24的图显示了疫苗接种以后雪貂的体温的变化。给雪貂接种IO7TCID5tl的M2K0 ( Δ TM)病毒[Gl 和 G3]、IO7TCID50 的 FM#6 病毒[G2 和 G4]或 OPT1-MEM? [G5]。在激发疫苗接种以后(组A)和接受加强疫苗以后(组B)，监测体温的变化14天。
[0048]图25的图显示了攻击以后雪貂的体温的变化。用IO7TCID5tl的A/布里斯班/10/2007 (H3N2)甲型流感病毒攻击雪貂。接种后监测体温14天。[0049]图26的图显示了病毒接种以后雪貂的重量的变化。在第O天给供体雪貂接种IO7TCID50 的 M2K0 ( Δ TM)病毒(组 A)或 IO7TCID50 的 A/ 布里斯班/10/2007 (H3N2)病毒(组B)。接种后24小时(第I天)，将供体放入具有直接接触(DC)的笼子中，所述笼子邻近容纳气溶胶接触(AC)的笼子。在供体接种以后，监测体重的变化14天。
[0050]图27的图显示了病毒接种以后雪貂的体温的变化。在第O天给供体雪貂接种IO7TCID50 的 M2K0 ( Δ TM)病毒(组 A)或 IO7TCID50 的 A/ 布里斯班/10/2007 (H3N2)病毒(组B)。接种后24小时(第I天)，将供体放入具有直接接触(DC)的笼子中，所述笼子邻近容纳气溶胶接触(AC)的笼子。在供体接种以后，监测体温的变化14天。
[0051]图28的图表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗会引起体液和粘膜应答。组A显示了施用PR8、皿21(0(八了1)、灭活的？1?8(1队頂)或PBS以后的血清IgG和IgA滴度。组B显示了施用PR8、Μ2Κ0(Δ TM)、灭活的PR8 (IN、IM)或PBS以后肺洗液IgG和IgA滴度。
[0052]图29的图表明，Μ2Κ0(ΔΤΜ)疫苗会保护小鼠免于致命的同亚型和杂亚型病毒攻击。组A显示了同源PR8 (HlNl)攻击以后的小鼠体重变化。组B显示了异源Aichi (Η3Ν2)攻击以后的小鼠存活。
[0053]图30的图表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗会控制呼吸道中的攻击病毒复制。组A显示了PR8 (HlNl)攻击以后的病毒滴度。组B显示了 Aichi(H3N2)攻击以后的病毒滴度。
[0054]图31的图显示了血清中针对Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗的抗体应答的动力学。
[0055]图32的图显示了血清和呼吸道中针对Μ2Κ0( Λ TM)疫苗的粘膜抗体应答。
[0056]图33的图显示了小鼠中响应于Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗的抗_HA IgG的动力学。
[0057]图34的图表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗会诱导与和IVR-147类似的免疫应答。组A显示了施用FIuMistiID, Μ2Κ0(ΛΤΜ)Η3、IVR-147和PBS的动物中的血清病毒滴度。组B显示了施用FluMisftD、Μ2Κ0(ΛΤΜ)Η3、IVR-147和PBS的动物中的肺洗液病毒滴度。组C显示了施用^.爪化^113、厘21(0(八1￥)!13、1￥1?-147和？85的动物中的鼻甲病毒滴度。
[0058]图35的图表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗会保护免于Aichi攻击。组A显示了施用FluMist?H3, Μ2Κ0(Δ TM)Η3,IVR-147和PBS的动物在Aichi攻击以后的体重减轻。组B
显示了施用FluMist:" H3、Μ2Κ0(Δ TM)Η3,IVR-147和PBS的动物在Aichi攻击以后的存活
百分比。
[0059]图36的图表明，Η5Ν1Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗会引起针对HA的IgG抗体滴度。
[0060]图37 的图显示了施用 Μ2Κ0 (ATM)CAO7、WT CA07 和 FluiVlisC CA07 疫苗以后的体重。
[0061]图38的图表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒不会在小鼠的呼吸道中复制。
[0062]图39的图表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗表现出快速的抗体动力学。
[0063]图40的图表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗会保护免于Η3Ν2病毒、A/Aichi/2/1968的异源攻击。
[0064]图41的图表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗会激发在攻击后恢复的细胞应答。[0065]图42的图表明，Μ2Κ0( Λ TM)病毒会产生与M2的野生型病毒类似的mRNA水平。
[0066]图43的琼脂糖凝胶显示了 pCMV-PR8-M2表达质粒的限制酶切消化。泳道 I 和 5 ;lKb DNA 梯型剂(Promega, Madison, WI, USA)，泳道 2-4 ；Eco Rl 消化的PCMLV-PR8-M2:0.375 μ g (泳道 2)、0.75 μ g (泳道 3)和 1.5 μ g (泳道 4)。
[0067]图44的图显示了 pCMV-PR8-M2与流感M2基因的开放读码框的序列比对。
[0068]图45的图显示了雪貂呼吸道中的Μ2Κ0( Λ TM)和FIuiVHsL病毒复制。
[0069]图46的图显示了用A/布里斯班/10/2007 (Η3Ν2)病毒鼻内攻击以后鼻洗液中的Μ2Κ0(δτμ)和 FluMisf 病毒滴度。
[0070]图47的图显示了仅用Μ2Κ0(ΛΤΜ)和FluMisK激发组疫苗接种以后雪貂中的IgG滴度。 [0071]图48的图显示了用Μ2Κ0(ΔΤΜ)和FluMist?激发_加强组疫苗接种以后雪貂中的IgG滴度。
[0072]图49的图显示了从用Μ2Κ0(ΛΤΜ)或FluMist °疫苗接种至攻击后，雪貂血清中的ELISA IgG滴度的总结。
[0073]图50的图显示了传播研究中得自雪貂的鼻洗液中的病毒滴度。Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒没有传播(没有检测到病毒)，而对照布里斯班(Brisb)/10病毒确实传播。
[0074]图51的图显示了用A/加利福尼亚、A/拍斯(Perth)和B/布里斯班(brisbane)病毒鼻内地(IN)、肌肉内地(IM)和真皮内地(ID FGN)接种疫苗的受试者中的IgG滴度。
[0075]图52的图显示了肌肉内地(IM)或真皮内地(ID FGN)施用激发剂量或激发和加强剂量的A/珀斯(H3N2)疫苗的受试者中的IgG滴度。
[0076]图53的图显示了在接种后O、30和60天在通过肌肉内(IM)和真皮内(ID)递送接种 FluLaval:A/ 加利福尼亚 /7/2009NYMC X_181、A/ 维多利亚 /210/2009NYMC X-187 (A/珀斯/16/2009-样病毒)和B/布里斯班/60/2008的豚鼠中的病毒滴度。
[0077]图54的图显示了免疫接种越南/1203/2004病毒以后5个月攻击的、Η5Ν1Μ2Κ0(Δ TM)接种疫苗的受试者的存活百分比。
[0078]图55的图显示了免疫接种越南/1203/2004病毒以后4周攻击的、Η5Ν1Μ2Κ0( Λ TM)接种疫苗的受试者的存活百分比。
【具体实施方式】
[0079]1.定义
[0080]在本文中使用以下术语，提供所述术语的定义用于引导。
[0081]除非明确地阐明仅表示单数，否则本文中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”表示单数和复数。
[0082]术语“约”和一般范围的应用(不论是否用术语约限定)是指，包括的数字不限于在本文中阐述确切数字，且意图表示在不脱离本发明的范围的情况下基本上在举例的范围内的范围。本文中使用的“约”会被本领域的普通技术人员理解，且在一定程度上随它所应用的上下文而变化。如果本领域的普通技术人员在它所应用的上下文下不清楚该术语的应用，“约”是指特定术语的至多加或减10%。
[0083]本文中使用的“受试者”和“患者”互换使用，且表示动物，例如，任意脊椎动物物种的成员。本文公开的主题的方法和组合物对于温血脊椎动物(包括哺乳动物和禽类)而言是特别有用的。示例性的受试者可以包括:哺乳动物诸如人类，以及由于将要绝种而重要的、经济上重要的(在农场中饲养的动物，用于人类消费)和/或对于人类在社会上重要的(作为宠物或在动物园中饲养的动物)哺乳动物和禽类。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者不是人。
[0084]本文中使用的术语“有效量”或“治疗有效量”或“药学有效量”表示，足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如，导致疾病、病症和/或其征状的预防的量。在治疗或预防应用的背景下，施用给受试者的组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，诸如一般健康、年龄、性别、体重和对组合物药物的耐受性。还将取决于疾病或病症的程度、严重程度和类型。技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当的剂量。在某些实施方案中，施用多次剂量。额外地或可替换地，在某些实施方案中，施用多个治疗组合物或化合物(例如，免疫原性组合物，诸如疫苗)。
[0085]本文中使用的术语“分离的”和/或“纯化的”表示核酸(例如，载体或质粒)、多肽、病毒或细胞的体外制备、分离和/或纯化，使得它不伴有不希望的体内物质，或者从通常与其一起存在的不希望的体内物质中基本上纯化。例如，在某些实施方案中，通过体外培养和繁殖得到分离的病毒制品，且其基本上不含有其它感染性病原体。本文中使用的“基本上不含有”是指，使用该化合物或试剂的标准检测方法，低于特定化合物(诸如不希望的核酸、蛋白、细胞、病毒、感染性病原体等)的检测水平。
[0086]本文中使用的术语“重组病毒”表示这样的病毒:其已经经过体外操作(例如,使用重组核酸技术)，以将 变化引入病毒基因组和/或以将变化引入病毒蛋白。例如，在某些实施方案中，重组病毒可以包括野生型、内源、核酸序列和突变体和/或外源核酸序列。额外地或可替换地，在某些实施方案中，重组病毒可以包括修饰的蛋白组分，诸如突变体或变体基质、血凝素、神经氨酸酶、核蛋白、非结构蛋白和/或聚合酶蛋白。
[0087]本文中使用的术语“重组细胞”或“修饰的细胞”表示这样的细胞:其已经经过体外操作(例如，使用重组核酸技术)，以将核酸引入细胞中和/或以修饰细胞的核酸。重组细胞的例子包括:携带外源性质粒、表达载体等的原核或真核细胞，和/或包括对它们的细胞核酸的修饰(例如，在细胞基因组中的置换、突变、插入、缺失等)的细胞。一种示例性的重组细胞是，已经经过体外操作以表达外源性蛋白(诸如病毒M2蛋白)的细胞。
[0088]本文中使用的术语“突变体”、“突变”、和“变体”互换使用，且表示与野生型序列不同的核酸或多肽序列。在某些实施方案中，突变体或变体序列是天然存在的。在其它实施方案中，重组地和/或化学地引入突变体或变体序列。在某些实施方案中，核酸突变包括:对RNA和/或DNA序列的修饰(例如，添加、缺失、置换)。在某些实施方案中，稀释包括化学修饰(例如，甲基化)，且也可以包括天然的和/或非天然的核苷酸的置换或添加。核酸突变可以是沉默突变(例如，一个或多个核酸变化，其编码与野生型序列相同的氨基酸)，或者可以导致编码的氨基酸的变化，产生终止密码子，或者可以引入剪接缺陷或剪接改变。对编码序列的核酸突变也可以导致保守的或非保守的氨基酸变化。
[0089]本文中使用的术语“vRNA”表示这样的RNA:其包含病毒基因组，包括分段的或未分段的病毒基因组，以及正链和负链病毒基因组。vRNA可以是完全内源的和“野生型”，和/或可以包括重组体和/或突变体序列。
[0090]本文中使用的术语“宿主细胞”表示，诸如病毒等病原体可以在其中复制的细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是体外培养的细胞(例如，CHO细胞、VeiO细胞、MDCK细胞等)。额外地或可替换地，在某些实施方案中，宿主细胞是体内的(例如，被感染的脊椎动物诸如禽或哺乳动物的细胞)。在某些实施方案中，可以修饰宿主细胞，例如，以增强病毒生产，诸如通过增强宿主细胞的病毒感染，和/或通过增强病毒的生长速率。作为例子，但是不作为限制，示例性的宿主细胞修饰包括:在宿主细胞的细胞表面上重组表达2-6-连接的唾液酸受体，和/或在已经被造成病原体或病毒缺失或无效的宿主细胞中重组表达蛋白。
[0091]本文中使用的术语“感染”表示，携带疾病或病原体，诸如病毒。感染可以是故意的，诸如通过施用病毒或病原体(例如，通过疫苗接种)，或非故意的，诸如通过病原体从一个生物体向另一个生物体的自然转移，或从被污染的表面向生物体的自然转移。
[0092]如本文中使用的，与病毒结合使用的术语“减毒的”表示这样的病毒:其与未减毒的相应物相比具有降低的毒力或致病性，但是仍然是可存活的或活的。通常，与未减毒病毒相比，减毒会使得感染性病原体(诸如病毒)对受感染的受试者的有害性或毒力更低。这不同于杀死的或完全灭活的病毒。
[0093]如本文中使用的，与病毒结合使用的术语“型”和“株”互换使用，且用于泛指具有不同特征的病毒。例如，甲型流感病毒是与乙型流感病毒不同类型的病毒。同样地，甲型流感HlNl是与甲型流感H2N1、H2N2和H3N2不同类型的病毒。额外地或可替换地，在某些实施方案中，可以将不同类型的病毒(诸如甲型流感H2N1、H2N2和H3N2)称作“亚型”。
[0094]本文中使用的 “M2K0”或“Μ2Κ0(ΛΤΜ)”表示 SEQ ID NO: 1、含有 SEQ ID NO:1 的病毒、或包含含有SEQ ID NO:1的病毒的疫苗，取决于它所应用的上下文。例如，在描述本文中证实的M2基因的突变时，“Μ2Κ0”或“Μ2Κ0(ΛΤΜ)”表示SEQ ID NO:1。在描述疫苗的病毒组分时，“Μ2Κ0”或“Μ2Κ0(ΛΤΜ) ”表示这样的重组流感病毒:其具有PR8的内部6个基因(核蛋白(NP)、聚合酶基因(ΡΑ、ΡΒ1、ΡΒ2)、非结构(NS)、基质(M))，但是其不表达功能性M2蛋白。在描述疫苗时，“Μ2Κ0”或“Μ2Κ0(ΛΤΜ)”表示包含Μ2Κ0(ΛΤΜ)重组病毒的疫苗。
[0095]本文中使用的“Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒”包括这样的重组流感病毒:其具有PR8的内部6个基因(核蛋白(NP)、聚合酶基因(ΡΑ、ΡΒ1、ΡΒ2)、非结构(NS)、基质(M))，但是其不表达功能性M2蛋白，无论是单独的还是与其它病毒组分和/或编码其它病毒组分的基因相组合。在某些实施方案中，所述Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒包含其它流感病毒的基因。在某些实施方案中，所述病毒包含甲型流感/布里斯班/10/2007-样A/乌拉圭/716/2007 (Η3Ν2)的HA和NA基因。在某些实施方案中，所述Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒包含A/越南/1203/2004 (Η5Ν1)病毒的HA和NA基因。在某些实施方案中，所述Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒包含A/加利福尼亚/07/2009 (CA07)(HlNlpdm)病毒的HA和NA基因。
[0096]I1.甲型流感病毒
[0097]A.概述
[0098]流感是美国成年人死亡的主要原因。流感的致病菌是正粘病毒科的病毒，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中甲型流感是在人类中最常见的和最有毒的。[0099]甲型流感病毒是有包膜的负链RNA病毒。甲型流感病毒的基因组被包含在8个单独的(未成对的)RNA链上，其补体编码11种蛋白(HA、NA、NP、Ml、M2、NSl、NEP、PA、PBl、PB1-F2、PB2)。总基因组大小为约14，000个碱基。该基因组的分段性质允许在细胞同居过程中在不同病毒株之间交换整个基因。8个RNA区段如下。I)HA编码血凝素(需要约500个血凝素分子才能构成I个病毒粒子)；2)NA编码神经氨酸酶(需要约100个神经氨酸酶分子才能构成I个病毒粒子)；3)NP编码核蛋白；4)M使用得自相同RNA区段的不同读码框编码2种蛋白(Ml和M2)(需要约3000个Ml分子才能构成I个病毒粒子);5)NS使用得自相同RNA区段的不同读码框编码2种蛋白(NSl和NEP) ;6)PA编码RNA聚合酶；7)PBl使用得自相同RNA区段的不同读码框编码RNA聚合酶和PB1-F2蛋白(诱导细胞凋亡)；8)PB2编码RNA聚合酶。
[0100]存在几种甲型流感亚型，它们根据H数目(对于血凝素型)和N数目(对于神经氨酸酶型)命名。目前，存在16种不同的已知H抗原(Hl至H16)和9种不同的已知N抗原(NI至N9)。每个病毒亚型已经突变成具有不同致病特性的多种株；一些对一个物种是致病性的，但是其它不是致病性的，一些对多个物种是致病性的。已经在人类中证实的示例性的甲型流感病毒亚型包括、但不限于=HlNl，其造成“西班牙流感”和2009年的猪流感爆发；H2N2，其造成二十世纪50年代后期的“亚洲流感” ;H3N2，其造成二十世纪60年代后期的香港流感；H5N1，通过它在2000年中期的传播，造成全球流感大范围流行威胁；H7N7 ;H1N2，其目前在人类和猪中流行；和H9N2，H7N2, H7N3, H5N2, H10N7。
[0101]鉴定了一些甲型流感变体，并如下命名:根据它们的最类似的已知分离物，且因而假定共享谱系(例如，福建流感病毒-样)；根据它们的典型宿主(例如人流感病毒)；根据它们的亚型(例如H3N2);和根据它们的致病性(例如LP，低致病性的)。因而，与分离物A/福建/411/2002 (H3N2)类似的病毒引起的流感可以被称作福建流感、人流感和H3N2流
感。
[0102]另外，有时根据所述株在其中流行或适应的物种(宿主)来命名流感变体。使用该惯例命名的主要变体是:禽流感、人流感、猪流感、马流感和犬流感。还已经根据它们在家禽(特别是鸡)中的致病性来命名变体，例如，低致病性的禽流感(LPAI)和高致病性的禽流感(HPAI)。
[0103]B.生命周期和结构
[0104]流感病毒的生命周期通常包括:与细胞表面受体结合，进入细胞和病毒核酸脱壳，随后病毒基因在细胞内复制。合成病毒蛋白和基因的新拷贝以后，这些组分装配成后代病毒颗粒，所述颗粒随后离开细胞。不同的病毒蛋白在这些步骤的各步中起作用。
[0105]甲型流感颗粒由包囊病毒核心的脂质包膜构成。包膜的内侧衬有基质蛋白(M1)，而外表面的特征在于2类糖蛋白刺突:血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。M2(—种跨膜离子通道蛋白)也是脂质包膜的一部分。参见例如，图1。
[0106]HA蛋白(一种三聚体I型膜蛋白)负责结合宿主细胞表面糖蛋白或糖脂上的唾液酸寡糖(含有与半乳糖连接的末端唾液酸的寡糖)。该蛋白也负责在通过胞吞而内化病毒粒子以后病毒和宿主细胞膜之间的融合。
[0107]神经氨酸酶(NA)(—种四聚体II型膜蛋白)是从宿主细胞与HA和NA的糖缀合物切割末端唾液酸残基的唾液酸酶，且因而被公认为受体破坏酶。该唾液酸酶活性是后代病毒粒子从宿主细胞表面的有效释放以及后代聚集的阻止(由于病毒的HA与其它糖蛋白的结合活性)所必需的。因而，HA的受体结合活性和NA的受体破坏活性可能作为抗衡起作用，从而允许流感的有效复制。
[0108]基因组区段被包装进病毒颗粒的核心。RNP (RNA+核蛋白，NP)是呈螺旋形式，3个病毒聚合酶多肽与每个区段结合。
[0109]流感病毒生命周期起始于HA与宿主细胞表面上的含唾液酸受体的结合，其后是受体介导的胞吞。图1。晚期核内体的低pH会触发HA的构象转换，由此暴露出HA2亚基的N端(所谓的融合肽)。融合肽启动病毒和胞内体膜的融合，并且基质蛋白(Ml)和RNP复合物释放到细胞质内。RNP由将vRNA壳体化的核蛋白(NP)以及由PA、PBl和PB2蛋白形成的病毒聚合酶复合物组成。RNP被转运到细胞核中，在此发生转录和复制。RNA聚合酶复合物催化3个不同的反应:(I)合成具有5'帽和3'聚腺苷酸结构的mRNA、(2)合成全长互补RNA(cRNA)，和(3)使用cDNA作为模板合成基因组vRNA。随后，将新合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白装配成RNP，从细胞核输出，转运到质膜，在此发生后代病毒颗粒的出芽。神经氨酸酶(NA)蛋白如下在感染后期起作用:从唾液酸寡糖除去唾液酸，由此从细胞表面释放出新装配的病毒粒子，并阻止病毒颗粒的自我聚集。尽管病毒装配涉及蛋白-蛋白相互作用和蛋白-vRNA相互作用，但是这些相互作用的性质很大程度上还是未知的。
[0110]C.M2蛋白的作用
[0111]如上所述,3种蛋白跨病毒膜:血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和M2。HA和NA的细胞外结构域(胞外结构域)是高度可变的，而M2的胞外结构域在甲型流感病毒中是基本上不变的。不希望受理论的约束，在甲型流感病毒中，认为M2蛋白(其具有离子通道活性)在病毒生命周期的早期阶段 在宿主细胞穿透和病毒RNA脱壳之间起作用。一旦病毒粒子经过胞吞作用，认为病毒粒子-相关的M2离子通道(一种同源四聚体螺旋束)会允许质子从核内体流到病毒粒子内部，以破坏酸不稳定的Ml蛋白-核糖核蛋白复合物(RNP)相互作用，从而促进RNP释放到细胞质中。另外，在其HA被细胞内切割的某些流感株(例如A/禽瘟疫/Rostock/34)中，认为M2离子通道会升高跨高尔基体网络的pH，从而避免在此隔室中由低PH条件引起的HA的构象变化。还证实了 M2跨膜结构域自身可以充当离子通道。认为M2蛋白离子通道活性在流感病毒的生命周期中是必不可少的，因为已经证实，阻断M2离子通道活性的盐酸金刚烷胺会抑制病毒复制。但是，尚未直接证实该活性在甲型流感病毒复制中的必要条件。M2蛋白的结构显示在图2中。M2蛋白的核酸序列以及Ml序列显示在图3中。
[0112]尽管乙型和丙型流感病毒在结构上和在功能上类似于甲型流感病毒，但是存在一些差异。例如，乙型流感病毒没有具离子通道活性的M2蛋白。相反，NB蛋白(NA基因的产物)可能具有离子通道活性，且因而具有甲型流感病毒M2蛋白的类似功能。类似地，丙型流感病毒也没有具离子通道活性的M2蛋白。但是，丙型流感病毒的CMl蛋白可能具有该活性。
[0113]II1.M2病毒突变体
[0114]在一个方面，公开了携带突变体M2vRNA序列的甲型流感病毒。通常，这样的突变体不具有M2离子通道活性，表现出减弱的体内生长性能，不可产生感染性后代，且在受感染的受试者中是非致病性的或表现出减少的发病机制。突变体病毒是免疫原性的，并且当用作疫苗时，会提供对抗相应野生型和/或其它致病性病毒的感染的保护。另外，不论使用何种宿主细胞，本文中公开的M2突变体是稳定的，且不会突变以表达功能性的M2多肽。额外地或可替换地，在某些实施方案中，在没有可检测地改变它的功能的情况下，产生这些突变体的Ml蛋白。在某些实施方案中，携带突变体M2核酸序列的病毒不可在宿主细胞中复制，而对应的野生型病毒可以在所述宿主细胞中繁殖。作为例子，但是不作为限制，在某些实施方案中，所述野生型病毒可以在培养的MDCK细胞、CHO细胞和/或VeiO细胞中生长、繁殖和复制，而携带突变体M2序列的对应病毒不可在相同类型的细胞中生长、繁殖或复制。
[0115]如上面所指出的，在某些实施方案中，所述M2突变体病毒是稳定的，且不会在宿主细胞中突变或恢复成野生型或编码功能性M2蛋白的非野生型序列。例如，在某些实施方案中，所述M2突变体病毒可在宿主细胞中稳定2代、3代、5代、10代、12代、15代、20代、25代或超过25代。在某些实施方案中，所述宿主细胞是未修饰的宿主细胞。在其它实施方案中，所述宿主细胞是经修饰的宿主细胞，诸如表达M2蛋白的MDCK细胞。
[0116]在某些实施方案中，所述M2突变体包括一个或多个核酸置换和/或缺失。在某些实施方案中，所述突变局部化在编码以下的一个或多个的核酸中:M2蛋白的细胞外结构域，M2蛋白的跨膜结构域，和/或M2蛋白的细胞质尾巴。额外地或可替换地，在某些实施方案中，一个或多个核酸突变会产生M2肽的剪接变体、一个或多个终止密码子和/或一个或多个氨基酸缺失。在某些实施方案中，
[0117]携带突变体M2核酸的病毒产生无功能的M2多肽。在某些实施方案中，携带突变体M2核酸的病毒不产生M2多肽。在某些实施方案中，携带突变体M2核酸的病毒产生截短的M2多肽。在某些实施方案中，截短的M2多肽具有氨基酸序列MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD。
[0118]在下面的表1-3中提供了 3个示例性的、非限制性的M2病毒突变体(M2_l、M2-2和M2-3)。在所述表中，小写字母对应于M2序列；大写字母对应于Ml序列；用粗体下划线显示突变体序列(例如，终止密码子、剪接缺陷)。M2-2突变体中标有下划线的(小写字体)字母指示在M2-1和M2-3突变体中缺失的区域。
[0119]
【权利要求】
1.一种核酸序列，其包含SEQ ID N0:lo
2.—种核酸序列，其包含SEQ ID N0:2。
3.一种核酸序列，其包含SEQ ID N0:3。
4.一种组合物，其包含与(i)启动子和(ii)转录终止序列可操作地连接的SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3。
5.一种重组流感病毒，其包含M基因中的突变。
6.根据权利要求5所述的重组流感病毒，所述重组流感病毒包含SEQID NO: 1、SEQ IDNO:2 或 SEQ ID NO:3。
7.根据权利要求5或6所述的重组流感病毒，其中所述M基因中的突变导致所述病毒表达M2蛋白的失败，或者造成所述病毒表达具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
8.根据权利要求5-7中的任一项所述的重组流感病毒，其中所述M基因中的突变不会恢复成野生型或编码功能性M2蛋白的非野生型序列在体外宿主细胞系统中至少10代。
9.根据权利要求5-8中的任一项所述的重组病毒，其中所述病毒是甲型流感病毒。
10.根据权利要求5-9中的任一项所述的重组病毒，其中所述病毒在被所述病毒感染的哺乳动物中是非致病性的。
11.根据权利要求8所述的重组病毒，其中所述体外细胞系统包含中国仓鼠卵巢细胞。
12.根据权利要求8所述的重组病毒，其中所述体外细胞系统包含Vero细胞。
13.一种细胞，其包含根据权利要求5-10中的任一项所述的重组流感病毒。
14.根据权利要求13所述的细胞，其中所述细胞是在体外。
15.根据权利要求13所述的细胞，其中所述细胞是在体内。
16.—种组合物，其包含:含有M基因中的突变的重组流感病毒。
17.根据权利要求16所述的组合物，所述组合物包含SEQID NO: 1、SEQ ID N0:2或SEQID N0:3。
18.根据权利要求16或17所述的组合物，其中所述M基因中的突变导致所述病毒表达M2蛋白的失败，或者造成所述病毒表达具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
19.根据权利要求16-18中的任一项所述的组合物，其中所述病毒是甲型流感病毒。
20.根据权利要求16-19中的任一项所述的组合物，其中所述组合物对施用所述组合物的哺乳动物是非致病性的。
21.根据权利要求16-20中的任一项所述的组合物，其中在给哺乳动物施用所述组合物以后约3周内，所述组合物在所述哺乳动物中引起可检测的免疫应答。
22.—种疫苗，其包含:含有M基因中的突变的重组流感病毒。
23.根据权利要求22所述的疫苗，所述疫苗包含SEQID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ IDN0:3。
24.根据权利要求22或23所述的疫苗，其中所述M基因中的突变导致所述病毒表达M2蛋白的失败，或者造成所述病毒表达具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
25.根据权利要求22-24中的任一项所述的疫苗，其中所述病毒是甲型流感病毒。
26.根据权利要求22-25中的任一项所述的疫苗，其中所述疫苗对施用所述疫苗的哺乳动物是非致病性的。
27.根据权利要求22-26中的任一项所述的疫苗，其中在给哺乳动物施用所述疫苗以后约3周内，所述疫苗在所述哺乳动物中引起可检测的免疫应答。
28.根据权利要求22-27中的任一项所述的疫苗，所述疫苗包含除了所述重组病毒以外的至少2种不同的流感病毒株。
29.根据权利要求22-28中的任一项所述的疫苗，所述疫苗包含至少一种乙型流感病毒或乙型流感病毒抗原。
30.根据权利要求22-29中的任一项所述的疫苗，所述疫苗包含至少一种丙型流感病毒或丙型流感病毒抗原。
31.根据权利要求22-30中的任一项所述的疫苗,所述疫苗包含一种或多种病毒或病毒抗原，所述一种或多种病毒或病毒抗原包含人甲型流感和得自非人物种的大范围流行流感病毒。
32.根据权利要求22-31中的任一项所述的疫苗，其中所述人甲型流感病毒选自H1N1、H2N2 和 H3N2。
33.一种用于繁殖重组流感病毒的方法，所述方法包括:使宿主细胞与重组流感病毒SEQ ID NOiUSEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3接触；在适合病毒复制的条件下，温育所述宿主细胞足够的时间，和分离后代病毒颗粒。
34.一种用于制备疫苗的方法，所述方法包括:将宿主细胞放入生物反应器中；使所述宿主细胞与重组病 毒SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3接触；在适合病毒繁殖的条件下，温育所述宿主细胞足够的时间；分离后代病毒颗粒；和配制所述后代病毒颗粒用于作为疫苗来施用。
35.一种用于免疫受试者的方法，所述方法包括:施用包含重组流感病毒的组合物，所述重组流感病毒包含M基因中的突变,其中所述M基因中的突变导致所述病毒表达M2蛋白的失败，或者造成所述病毒表达具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
36.一种用于降低受试者中的甲型流感病毒感染的可能性或严重程度的方法，所述方法包括:施用包含重组流感病毒的组合物,所述重组流感病毒包含M基因中的突变，其中所述M基因中的突变导致所述病毒表达M2蛋白的失败，或者造成所述病毒表达具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述重组流感病毒包含SEQID NO: 1、SEQID NO:2 或 SEQ ID NO:3。
38.根据权利要求35-37中的任一项所述的方法，所述方法包括:提供至少I个加强剂量的所述组合物，其中在第一次施用以后3周提供所述至少I个加强剂量。
39.根据权利要求35-38中的任一项所述的方法，所述方法包括:鼻内地、肌肉内地或皮内地施用组合物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中皮内地进行施用。
41.根据权利要求40所述的方法，其中使用微型针递送装置进行施用。
42.一种用于皮内施用免疫原性组合物的方法，所述方法包括: (a)提供微型针递送装置，所述微型针递送装置包括(i)穿刺机构；(ii)免疫原性组合物层，所述免疫原性组合物层包括多个能够刺穿皮肤和允许免疫原性组合物皮内施用的微型针；和(b)压迫所述穿刺机构； 其中所述免疫原性组合物包含含有M基因中的突变的重组流感病毒，且其中所述M基因中的突变导致所述病毒表达M2蛋白的失败，或者造成所述病毒表达具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述重组流感病毒包含SEQID NO: 1、SEQ IDNO:2 或 SEQ ID NO:3。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述微型针阵列最初位于装置壳体的内部，并在杆致动后，允许所述微型针延伸穿过所述装置底部并插入皮肤中，由此允许疫苗流体输注进皮肤中。
45.一种重组流感病毒，其包含M基因中的突变，其中所述病毒不在未修饰的选自以下的宿主细胞中复制:中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、VeiO细胞或Madin-Darby犬肾细胞。
46.根据权利要求45所述 的重组病毒，其中所述M基因中的突变导致所述病毒表达M2蛋白的失败，或者造成所述病毒表达具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
47.一种重组细胞，其包含编码流感病毒M2离子通道基因的核酸，其中所述核酸在所述细胞中表达。
48.一种重组细胞，其包含2，6-唾液酸受体基因。
49.一种重组细胞，其包含表达(i)病毒的M2离子通道基因和(ii) 2，6-唾液酸受体基因的细胞基因组或表达载体。
50.根据权利要求47-49中的任一项所述的重组细胞，其中所述细胞是真核细胞。
51.根据权利要求47-50中的任一项所述的重组细胞，其中所述真核细胞是中国仓鼠卵巢细胞或VeiO细胞。
52.根据权利要求47-51中的任一项所述的重组细胞,所述重组细胞进一步包含人流感病毒，其中所述病毒不表达功能性M2蛋白。
53.一种用于生产重组流感病毒颗粒的方法，所述方法包括:(A)用人流感病毒感染根据权利要求47-52中的一项所述的细胞，其中所述细胞要么(i)组成型地表达功能性的M2离子通道蛋白，要么(ii)在病毒感染以后被诱导表达功能性的M2离子通道蛋白，且其中所述病毒仅在有所述细胞表达的功能性M2离子通道蛋白存在下成功地复制；和(B)分离后代病毒颗粒。
54.根据权利要求53所述的方法，所述方法进一步包括:将分离的病毒颗粒配制成疫苗。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述病毒包含人流感病毒，且其中所述病毒不表达功能性M2蛋白。
【文档编号】C12N15/33GK103781901SQ201280040857
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年6月21日 优先权日:2011年6月24日
【发明者】帕穆克·比尔赛尔, 八田靖子 申请人:复尔健有限公司