专利名称：A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备及使用方法，属生物芯片领域。
背景技术：
流感病毒(influenza virus)根据病毒分类学属正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)。它的基因组是分节段的单股负链RNA。根据病毒核蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原特性及其基因特性不同，把流感分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中A型流感病毒根据其表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白结构及其基因特征可以分为多个亚型，至今A型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-16)，神经氨酸酶有9个亚型 (N1-9)。由于流感病毒基因组RNA是分节段的，因此易产生同型不同株间基因重配。尤其是人A型流感病毒HA基因经常发生点突变，导致其编码的HA蛋白分子上的氨基酸序列发生替换，造成其抗原性经常不断的发生漂移，而每次抗原性漂移常常带来不同程度的流感流行。流行性感冒(influenza)(简称流感)是第一个实行全球性监测的病毒性急性呼吸道传染病，近100年来，已经出现了数次不同亚型的流感病毒全球大流行。1918年西班牙流感(HlNl)，造成5000-6000万人死亡；1957年亚洲流感(H2N2)，至少200万人死亡；1968 年香港流感(H3N2)，死亡人数超过100万；1997年香港禽流感(H5W)，死亡人数虽不比前几次流感，但死亡率高达32%。2009年3月，在墨西哥爆发甲型Hmi流感，并迅速在全球范围流行，截至2010年5月2日，至少造成18001人死亡。随着全球人口流动型的不断增力口，流感病毒交替、混合流行将成为常态。在流感患者的临床治疗过程中和流感的疫情防控中，流感病毒产生耐药性是治疗和防控失败的最主要原因。目前有两类正式上市的药物可以用于治疗流感病毒感染，一类是神经氨酸酶抑制剂，包括磷酸奥司他韦(oseltamivir/Tamiflu /达菲)和扎那米韦 (zanamivir/Relenza /乐感清)；另一类是M2通道阻滞，包括金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)。由于流感病毒为节段型RNA病毒，突变发生率很高；随着抗病毒治疗的展开，药物选择压力等因素导致病毒耐药性不可避免地出现。据调查显示，目前北美地区98%的季节性H3N2流感病毒对金刚烷胺耐药，98%的季节性Hmi流感病毒对达菲耐药；禽流感H5W病毒对达菲的耐药也屡有报道。2009年6月丹麦报告了全球第一例甲型 HlNl流感病毒达菲耐药病例后，截至2010年2月3日，全球已有20个国家报告了达菲耐药的甲型Hmi流感病例至少225例。流感病毒耐药的有效检测技术对于指导流感预防和临床治疗具有重要意义，同时也是流感病毒流行性监测和控制的重要技术支撑。目前流感病毒临床诊断主要依靠的方法有病原分离和鉴定、血清学方法检测感染者抗体、神经氨酸酶抑制试验、RT-PCR诊断技术、基因测序技术。上述技术由于受到其自身特点限制，有的不能实现流感病毒耐药性检测，有的不能达到快速、高通量的临床检测和疾病防控的需求。基因芯片，即DNA微阵列(DNA microarray)，自20世纪80年代末兴起以来，广泛用于医学和生命科学的各个领域。与传统的检测方法相比，具有快速、高灵敏度、高特异、高通量的特点，特别适合于对大量样品进行平行快速高通量的分析。目前已有多种病原微生物的检测使用了基因芯片技术。目前已有使用基因芯片技术检测流感病毒耐药位点突变情况的报道，如Michael B等采用基因芯片技术检测季节性H3N2和季节性Hmi流感病毒金刚烷胺耐药，可以检测病毒M2基因上V27A和S31N位点突变。但是，在一次检测中既可以同时区分患者感染的流感病毒为季节性Hmi、甲型Hmi、季节性H3N2三种亚型的中哪一种或多种，又同时可以检测所感染的流感病毒是否对奥司他韦和金刚胺类药物耐药的基因芯片未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种A流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片，该芯片能同时分析人源季节性Hmi、甲型Hmi、季节性H3N2三种亚型流感病毒是否对奥司他韦和金刚胺类药物耐药。本发明采用了以下技术方案一种A流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片，包含对季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2进行奥司他韦和金刚胺类耐药检测的四条特异性寡核苷酸探针(表1-表幻、一条质控探针(表4)和载体，全部探针均分布在载体上。此外还包括用于奥司他韦耐药相关NA基因和金刚胺类耐药相关M基因耐药突变位点序列扩增的特异性引物9条(表5-表6)。表1对季节性Hmi进行耐药检测的特异性寡核苷酸探针序列
权利要求
1. 一种A型流感病毒流行毒株耐药检测的基因芯片，其特征是它包括对季节型H1N1、 甲型H1N1、季节型H3N2三种1流感亚型进行奥司他韦及金刚胺类耐药检测的四条特异性寡核苷酸探针、1条质控探针和载体，全部探针均分布于载体上；用于NA基因和M基因耐药突变位点序列扩增的通用引物9条。对季节型Hmi进行耐药检测的特异性寡核苷酸探针序列
2.根据权利1所述A型流感流行毒株耐药检测基因芯片，其特征是所述的载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
3.一种A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备方法，包括以下步骤步骤一,探针的设计根据NCBI网站中Genbank中的hf luenza Virus Resource数据库，对大量的季节性Hmi、甲型Hmi、季节性H3N2流感亚型序列进行比对，确定检测的耐药位点，然后设计四条特异性寡核苷酸探针以及1条片基质控探针；步骤二，探针的合成，每条探针的3’端加入12个T且末端T进行氨基修饰，以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；质控探针除3’端加入12个T且末端T进行氨基修饰外，5’ 端同时标记CY3 ；步骤三，芯片的制备将合成后的探针用去离子水稀释成100 μ Μ,分别取10 μ L，和 IOuL体积芯片点样液混勻，使探针点样终浓度为50 μ Μ,装于384孔板，将芯片表面贴上10 样品孔膜，用Pixsys 5500芯片制备仪(Catesian Technologies)将探针点于载体上，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，使探针和芯片表面醛基脱去1分子水后共价结合，点制好的芯片常温干燥保存。
4.根据权利要求3所述的A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备方法，其特征是步骤一中四条特异性寡核苷酸探针以及1条片基质控探针，探针长度在17-21nt，每条探针之间的Tm值相差在5 °C之内。
5.根据权利要求3所述的A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备方法，其特征是步骤二种所述的载体为醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
6.一种A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤步骤一，流感病毒RNA的提取，使用市售商品化病毒基因组RNA提取试剂盒提取病毒RNA ；步骤二，RT-PCR 使用市售的一步法RT-PCR试剂，使用权利要求1中所述的特异性引物进行NA基因、M基因含耐药突变位点片段扩增。步骤三，杂交将基因芯片分别置0. 2% SDS和双蒸水中各清洗30S，离心或氮气吹干备用；将步骤二得到的RT-PCR产物在95°C变性5min后立即置于冰浴中5min，分别取同一模板NA基因、M基因扩增产物各2. 5 μ L与5 μ L杂交液混勻，加于芯片加样孔使其均勻覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内，45°C杂交lh。步骤四，杂交后清洗基因芯片基因芯片杂交完成后，将芯片依次在洗液l*SSC+0.2% SDS,0. 2*SSC和0. 1*SSC中各清洗30S，最后将基因芯片表明液体离心或氮气吹干。步骤五，扫描将步骤五中清洗后的基因芯片通过荧光扫描仪进行扫描，同时保存扫描图像数据；步骤六，数据分析根据扫描图像，根据相应野生型探针与耐药型探针信号的比值大小来确定所检测样本中流感病毒的亚型及耐药情况。
7.根据权利要求6所述的A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤二中使用的NA基因、M基因扩增的反相引物5 ’端进行修饰。
8.根据权利要求7所述的反向引物5’端修饰分子可以是CY3、CY5、生物素、纳米金。
9.根据权利要求6所述的A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤三中使用的杂交液组分为8*SSC，0. 6% SDS, 10%甲酰胺，10*Denhardt。
全文摘要
本发明涉及一种A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备和使用方法。本发明基因芯片包括对季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2三种流感亚型进行奥司他韦和金刚胺类耐药检测的29条特异性寡核苷酸探针及1条质控探针、9条RT-PCR扩增用特异性引物和载体，全部探针分布在载体上。本发明还包括了基因芯片的制备方法，包括1.引物探针的设计；2.探针的合成；3.芯片的制备。本发明还包括了基因芯片的使用方法，包括1.流感病毒基因组RNA的提取；2.两组RT-PCR扩增；3.芯片杂交；4.杂交后清洗；5.芯片扫描；6.数据分析。本发明具有快速、准确、高通量、高灵敏度、高特异性的特点。
文档编号C12Q1/68GK102251060SQ201110220760
公开日2011年11月23日 申请日期2011年8月3日 优先权日2011年8月3日
发明者刘琪琦, 张英杰, 王升启, 陈苏红 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所