专利名称：木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液生产乙醇的方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵领域，具体地，涉及&iccharomyce cerevisiae TO在木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液生产乙醇中的应用。
背景技术：
木质纤维素是自然界广泛存在且廉价的可再生资源，其主要成分纤维素、半纤维素是潜在的燃料乙醇的生产原料。木质纤维素材料中纤维素，半纤维素和木质素三者连接紧密，将纤维素包裹在中间。要利用木质纤维素材料进行乙醇发酵，必须先通过一定的预处理方式，打破这三者之间的紧密结构，去掉木质素，暴露出纤维素与酶结合的位点。虽然利用木质纤维素生产燃料乙醇的技术路线已具有可行性，但存在工艺复杂、生产耗能等局限， 阻碍了规模化生产。蒸汽爆破预处理法是近几年来发展起来的一种高效，低成本的木质纤维素分离技术，它能打破木质素和半纤维素对纤维素的保护作用，有效的实现木质纤维素组分分离，并且对环境无污染，能减少化学药品用量，耗能较低，糖回收率高。但是通过蒸汽爆破预处理后的水解物中除了可发酵糖外，还存在着弱酸(乙酸为主)，糠醛及5-HMF和酚类等，这些物质对纤维素酶或对酵母发酵产生强烈的抑制作用。因此，对蒸汽爆破处理的材料发酵前进行脱毒，包括水洗、物理、化学和生物脱毒等就显得尤为重要。然而上述水洗、物理和化学脱毒方式消耗了水资源，增加了设备投资成本和工艺的复杂性。而生物脱毒方法，例如Yanling Yu利用构巢曲霉(FLZlO)对玉米秸秆蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液进行生物脱毒处理，随后用酿酒酵母进行同步糖化发酵，最后乙醇浓度达到34g/L(Yanling Yu, et al. Onsite bio-detoxification of steam-exploded corn stover for cellulosic ethanol production. Bioresource Technology, 2011,102(8) :5123-5128),乙酉享夕商 it 并未达到工业生产的基准浓度(5%，体积比)，并且该方法同样需要增加培养构巢曲霉 (FLZ10)的设备投资、增加培养该真菌所用培养基化学试剂及能量的消耗、增加了整体系统的复杂性。因此，迫切需要一种木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液生产乙醇的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiaeY5在木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液发酵生产乙醇中的应用。本发明的另一目的在于提供一种木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液生产乙醇的方法。酿酒酵母菌TO已于2008年9月4日保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，邮编100101，其分类命名为 Saccharomyces cerevisiae Y5保藏号为CGMCC No. 2660的酿酒酵母菌。该菌株已在CN 101358175B 中公开。本发明提供了 Saccharomyces cerevisiaeTO在木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液发酵生产乙醇中的应用。本发明提供一种木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液发酵生产乙醇的方法， 是将Saccharomyces cerevisiaeY5接种于含有木质纤维素蒸汽爆破处理未脱毒酶解液 (纤维素酶和葡萄糖苷酶酶解)的发酵培养基中，进行发酵培养。本发明的发酵培养条件为为25 35°C，80 150r/min，培养12 60小时。本发明提供的上述方法可以在发酵培养基中添加氮源。胃Saccharomyces cerevisiaeY5 禾中fi》0. 5g/L 1. Og/L。本发明所述木质纤维素优选为玉米秸秆。本发明所述的氮源优选为玉米浆(CSL)。本发明添加玉米浆的终浓度为0 40mL/L。本发明所述的玉米浆，其固形物含量为10%。本发明的&iccharomyces cerevisiaeTO在木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液发酵生产乙醇的应用中，具有很强的葡萄糖代谢能力和耐高浓度乙酸(12.91g/L)的能力；在氮源充足或不添加氮源的情况下都能对未脱毒酶解液进行高效乙醇发酵，接种量 1. Og/L条件下，添加40mL/L玉米浆为氮源的未脱毒酶解液中，24h即能达到乙醇含量最大值44. 55g/L，达到最大理论值的94. 9%，乙醇产率0. 48g/g，乙醇生产速率是1. 86g/L/h ；Y5 在不添加氮源时，也能进行未脱毒酶解液乙醇发酵，接种量为1.0g/L，发酵60h乙醇浓度达到43. 21g/L，为理论值的92. 1 % ；接种量为0. 5g/L，发酵72h，乙醇浓度达到40. 00g/L,为理论值的85.8%。本发明木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液发酵生产乙醇的方法具有如下优点(1)简化木质纤维素生产乙醇的工艺；(2)减少水资源的消耗(3)操作方便，降低设备投资，(4)提高工业产率，降低生产成本。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例11 材料1. 1 菌种 Saccharomyces cerevisiae Y5，保藏编号 CGMCC2660。1. 2蒸汽爆破预处理酶解液本研究所用木质纤维素为玉米秸秆，其蒸汽爆破预处理酶解液，由河南天冠集团提供。制作方法是将玉米秸秆切成2cm大小，含水率为10%，然后在205°C和2. OMpa条件下蒸汽爆破预处理处理5min。预处理完的玉米秸秆未经水洗脱毒，直接用纤维素酶和- β -葡萄糖苷酶进行酶解。1. 3培养基增殖培养基酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。驯化培养基玉米秸秆蒸汽爆破处理未脱毒酶解液，pH 5. 4，121°C灭菌20min，外加氮源。发酵培养基玉米秸秆蒸汽爆破处理未脱毒酶解液，pH 5. 4，121°C灭菌20min。
2 方法2. 1菌株培养从保存菌种的增殖培养基斜面上挑取TO菌落，接入IOOmL增殖培养基中，300C，150/min,培养至对数期，活化菌株。再转接入新鲜液体增殖培养基中，相同条件下培养至对数期，以此作为种子液。最后经测定，得到种子液的细胞干重为6g/L。2. 2最适氮源选择取种子液，分别接种于以YP (10g/L酵母浸粉和20g/L蛋白胨) 和玉米浆(CSL，固形物含量为10%，由河南天冠集团提供)为氮源的IOOmL发酵培养基中， 30150/min培养，每隔1 取样测定残糖量和乙醇含量。2. 3菌株驯化将Y菌株在玉米秸秆蒸汽爆破酶解液中外加氮源的条件下进行驯化，并且逐步减少氮源添加量，从40mL/L减少到20mL/L，再进一步减少到不添加任何氮源， 使菌株减少对外加氮源的依赖，继而探索在氮源添加量减少条件下的发酵性能。2. 4乙醇发酵特性2.4. 1氮源浓度根据2. 2项记载的方法确定玉米浆为最适氮源，选取三个浓度梯度，分别是40mL/L，20mL/L和OmL/L，为玉米浆在培养基中的终浓度。2. 4. 2接种量以玉米浆为氮源，取TO种子液，分别接种于上述三种外加不同氮源浓度的IOOmL发酵培养基中，接种量为1.0g/L和0. 5g/L 30°C，150r/min培养，每隔1 取样测定残糖量和乙醇含量。以上每组试验各三个平行，结果取平均值。2. 5分析方法2. 5. 1乙醇含量及糠醛含量的测定气相色谱仪(安捷伦7890AGC)。乙醇测定条件色谱柱为HJ-PEG-20M，柱温120°C，注射室温度120°C，检测器温度200°C，N2为载气， 流速4mL/min。糠醛测定条件柱温120°C，注射室温度20(TC，检测器温度50°C，进样量 0. 5 μ L02. 5. 2弱酸含量测定气相色谱仪(岛津GCZ001)。色谱柱为玻璃柱，N2为载气，柱前压为IOOkPa,柱温170°C，进样口温度200°C，检测器为FID，检测器温度200°C。2. 5. 3 糖量测定高效液相色谱仪(High liquid chromatography HPLC, Waters 2690)。氨柱 Q00mmX4. 6mm)，柱温 40°C，Waters 410 示差检测器，流动相V(乙腈)V(水)=75 25，流速 lmL/min，进样量 40yL。2. 6计算方法下式浓度单位均为g/L样品中乙醇含量％=(样品峰面积X标准溶液浓度)/标准溶液峰面积X 100%;乙醇产率％=测得乙醇浓度/(糖浓度X0. 51) X 100%样品中糖含量％=(样品峰面积X标准溶液浓度)/标准溶液峰面积X100%3 结果3. 1玉米秸秆蒸汽爆破预处理后的酶解液经测定主要成分和含量如下葡萄糖 102. 90g/L,木糖 4. 81g/L，乙酸 12. 91g/L，丙酸 0. 15g/L，丁酸 0. 61 g/L 和糠醛 0. 41g/L，pH 4.5。可以发现酶解液中除了含有高浓度葡萄糖外，乙酸含量也相当高，达到了 12.91g/L。一般而言，在低pH和高浓度乙酸条件下，乙酸以结合态存在，这个状态时乙酸是脂溶性的，容易通过扩散作用透过细胞膜进入到细胞质中，对菌株的生长造成强烈的抑制作用。有研究表明培养基中的乙酸含量超过5g/L就会抑制酿酒酵母的生长，降低发酵的乙醇产率。因此在本发明实施例的酶解液中，乙酸成为酿酒酵母对酶解液发酵产乙醇主要抑制剂之一，要在如此高浓度的抑制剂存在的环境进行乙醇发酵并获得高乙醇产率，需要能代谢或耐受乙酸、糠醛等抑制剂的菌种的参与。3. 2不同氮源乙醇发酵结果当以CSL为唯一氮源进行未脱毒酶解液乙醇发酵时， 前1 反应速率较慢，存在一个延滞期，可能是TO菌株从增殖培养基中转到酶解液这个新环境，需要适应期。从1 后J5代谢葡萄糖的速率加快，24h可将葡萄糖代谢完，同时乙醇含量达到最大值44. 55g/L，相当于最大理论值的94. 49%，乙醇产率达到0. 48g/g。以YP为氮源时，前24h葡萄糖代谢速率和CSL的相似，但糖的代谢速率稍慢，在 3 才将葡萄糖消耗完，4 葡萄糖彻底代谢完，同时在3 乙醇含量的最大值为40. 89g/L， 相当于最大理论值的87. 1%，乙醇产率为0. 44g/g，低于以CSL为氮源的数据。以CSL为氮源时的酶解液发酵产乙醇效果好于以YP为氮源的发酵，可能是因为CSL中含有一些氨基酸和维生素类等微量物质，可促进酵母的生长和代谢。可见，CSL比YP更适合作为外源氮源对未脱毒酶解液乙醇发酵。3. 3不同浓度氮源的乙醇发酵结果分别将TO种子液以1. Og/L的接种量接入三个浓度梯度G0mL/L、20mL/L、0mL/L)的以玉米浆为氮源的酶解液中，30°C，150r/min，批式发酵。结果显示，三种条件下的乙醇发酵均存在一个1 的延滞期，发酵至1 后开始启动，可能是由于酶解液中高浓度乙酸的抑制作用。当CSL浓度为40mL/L时，到24h葡萄糖几乎全部代谢完，并且乙醇含量达到峰值 44. 55g/L，乙醇产率是0. 48g/g，相当于最大理论值的94. 9%，乙醇生产速率是1. 86g/L/h， 说明TO在该条件下乙酸对其影响不大。当CSL浓度降低到20mL/L时，24h仅消耗掉一半的葡萄糖，此时乙醇含量仅 27. 12g/L。反应到3 葡萄糖代谢完毕，同时乙醇含量有最大值43. 06g/L,乙醇产率为 0. 46g/g，乙醇生产速率为1. 20g/L/h。当继续降低CSL的浓度，不添加任何氮源时，葡萄糖的消耗速度明显降低，同时乙醇发酵周期明显延长。该条件下TO在60h代谢完葡萄糖，此时乙醇最大值为43. 21g/L，乙醇生产速率降到0. 72g/L/h。可见，氮源添加量对酵母菌的生长及发酵速率有影响，随着氮源浓度的降低，营养物质的缺乏，发酵存在周期延长现象，但是在40mL/LCSL、20mL/L CSL和不加CSL的条件下，最大乙醇含量相差不大，最终乙醇浓度达到了 43g/L-44. 55g/L，均超过了工业生产的基准浓度(5 %，体积比)。这一结果也说明，TO在酶解液中有很强的葡萄糖代谢能力和耐乙酸的能力，同时在氮源充足的条件下能对未脱毒酶解液进行高效乙醇发酵，并且在不添加氮源的条件下也能进行酶解液发酵。3. 4接种量对乙醇发酵的影响从工业上实际生产成本角度出发，本发明实施例选用用小接种量和少量的氮源， 对TO在玉米秸秆蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液中进行乙醇发酵研究。在接种量0. 5g/L时， 选用了 CSL和YP两种不同外源添加氮源进行乙醇发酵，这两组之间的差异性明显比接种量为1. Og/L时大。前12h，发酵几乎没有启动，存在延滞期，该延滞期比接种量1. Og/L时更为明显。1 以后，以CSL为氮源的乙醇发酵开始缓慢启动，到24h葡萄糖代谢速率加快， 48h乙醇含量达到最大值41. 97g/L，葡萄糖到60h才几乎消耗完。而以YP为氮源的前24h几乎都处于延滞状态，到24h后葡萄糖的代谢才加快，葡萄糖到84h完全消耗完，乙醇60h时达到最大值39. 00g/L,这个值比同样条件下以玉米浆为氮源的低，发酵周期也变长。该结果进一步证实了 3. 2项的结论，CSL比YP更适合做蒸汽爆破未脱毒酶解液发酵时的外源添加氮源。在接种量减小到0. 5g/L时，在三种不同氮源浓度下，前12h，由于接种量小，发酵几乎停滞，1 后开始缓慢启动。40mL/L CSL的条件时，4 乙醇含量达到最大值41. 97g/ L，相当于最大理论值的89%。同样时间点，20mL/L CSL发酵产生的乙醇含量与它相同，两条曲线几乎重合。而不添加氮源的条件下，TO在48h乙醇含量低于前两者，达到34. 24g/L, 随着发酵时间的延长，7 时不添加氮源的情况发酵产乙醇含量达到最大值40. 00g/L，相当于最大理论值的85.8%。0. 5g/L TO接种量条件下的乙醇发酵情况与前面1.0g/L相比，仅发酵周期有所延长，最大乙醇含量相差不大，都在40mL/L以上，达到了纤维素发酵乙醇工业生产的要求。通过在不同氮源条件下，对TO进行玉米秸秆蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液乙醇发酵的研究，得出以下结论(I)S. cerevisiae TO发酵不经过脱毒处理的玉米秸秆蒸汽爆破预处理的酶解液时，添加CSL为氮源比YP为氮源进行乙醇发酵效果要好。(2) S. cerevisiae TO在酶解液中能耐受高浓度的乙酸(12. 91g/L)，并且具有高效代谢葡萄糖产乙醇的能力。接种量1.0g/L条件下，添加40mL/L玉米浆为氮源的未脱毒酶解液中，24h即能达到乙醇含量最大值44. 55g/L，达到最大理论值的94. 9%，乙醇产率0. 48g/ g，乙醇生产速率是1. 86g/L/h。C3H5在不添加氮源时，也能进行未脱毒酶解液乙醇发酵。接种量为1. Og/L，发酵 60h乙醇浓度达到43. 21g/L，为理论值的92. 1 % ；接种量为0. 5g/L，发酵72h，乙醇浓度达到40. 00g/L,为理论值的85. 8%。本发明提供的生产乙醇的方法是将S. cerevisiae TO应用于木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液生产乙醇，能简化木质纤维素生产乙醇的工艺、降低设备投资、减少水消耗、降低生产成本，值得推广应用。
权利要求
1.一种保藏号为 CGMCC No. 2660 的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) Y5 在木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液发酵生产乙醇中的应用。
2.一种木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液生产乙醇的方法，其特征在于，将 Saccharomyces cerevisiaeY5接种于含有木质纤维素蒸汽爆破处理未脱毒酶解液的发酵培养基中进行发酵培养。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养条件为25 35°C，80 150r/min，培养12 60小时。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在木质纤维素蒸汽爆破处理未脱毒酶解液的发酵培养基中添加氮源。
5.如权利要求2 4之一所述的方法，其特征在于，发酵培养基接种Saccharomyces cerevisiaeY5 _禾中fi》0. 5g/L 1· Og/L。
6.如权利要求2 4之一所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素为玉米秸秆。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的氮源为玉米浆。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的玉米浆其添加发酵培养基后的终浓度为0 40mL/L。
9.如权利要求7或8的方法，其特征在于，所述的玉米浆其固形物含量为10%。
全文摘要
本发明涉及生物发酵领域，具体涉及Saccharomyce cerevisiae Y5在木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒酶解液生产乙醇中的应用。采用能代谢糠醛并且耐受乙酸的菌株Saccharomyce cerevisiae Y5，对木质纤维素蒸汽爆破预处理未脱毒的酶解液进行乙醇发酵，结果表明在外加氮源或不加氮源的条件下，菌种Y5在上述发酵生产乙醇的工艺中，具有代谢或耐发酵抑制剂高效生产乙醇的能力。本发明提供的生产乙醇的方法能够简化玉米秸秆纤维素生产乙醇的工艺，减少设备投资，降低水消耗量，减少营养物的加入，对降低木质纤维素生产乙醇的成本具有重要意义。
文档编号C12P7/10GK102277390SQ201110220479
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者杨秀山 申请人:杨秀山