用于核酸杂交的组合物、方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游，其中第一多核苷酸片段的序列和用于检测靶核酸序列的探针的第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸片段的序列和探针的第二探针片段的序列是互补的，其中第二探针片段位于第一探针片段的下游。在检测中可采用核苷酸和双标记探针（DLP）以用来检测靶核酸序列。
【专利说明】用于核酸杂交的组合物、方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及关于核酸杂交的方法和检测的领域。
【背景技术】
[0002]双标记探针(DLP)包含的多核苷酸的一端用突光染料(报告剂)(报告子，reporter)标记并且另一端用猝灭剂分子标记。这种探针通常用于各种杂交试验，包括实时PCR。在使用DLP的方法中，当探针的猝灭剂在物理上接近报告剂时，通过其中最常见的FRET (荧光共振能量转移)的物理化学机制使荧光猝灭。
[0003]通过增加报告剂和猝灭剂之间的距离迅速降低猝灭剂的猝灭效率。在单一游离的(未结合的)完整DLP分子中的猝灭剂和报告剂之间的距离可部分取决于因探针序列而定的DLP的二级结构。那些具有更多二级结构的DLP可存在于超螺旋构象中，其中猝灭剂和报道剂极为接近且猝灭效率很高。预计那些具有很少或没有二级结构的DLP存在于更松弛的构象(relaxed conformation)中，其中粹灭剂和报告剂是进一步分开的且粹灭效率更低。具有较低猝灭效率的DLP可具有高荧光背景，因为报告剂的某些荧光可“逃避”猝灭剂的影响。在实时PCR检测中高荧光背景是不需要的，它会导致，例如引起低检测灵敏度或信号漂移的低信噪比，从而使来自阴性样品的荧光信号突破阈值。当来自研究样品的信号突破阈值时，将Ct赋值给它。在自动数据分析中，其中样品鉴别是基于Ct值进行的，示出信号漂移的阴性样品可分类为阳性从而导致不必要的返工。
[0004]规避具有高荧光背景的DLP的方法之一是使用如文献报道的附加通用双链探针(AUDP)替代DLP。在AUDP中，报告剂和猝灭剂分别和2个不同的彼此相连的探针复合物分子的5’和3’末端连接。因此报告剂和猝灭剂总是极为接近直到将带有猝灭剂的探针置换并释放荧光。然而由于它们的通用性质，AUDP不能提供DLP所提供的用于PCR检测的附加特异性门(specificity gate)。
[0005]人们需要克服上述的常规杂交探针和检测的限制，尤其要提供可有效增强核酸探针特别是双标记核酸探针的性能的组合物、方法和试剂盒。
【发明内容】
[0006]—方面，本发明提供了具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，该第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游，其中第一多核苷酸片段的序列和用于检测靶核酸的探针的第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸的序列和探针的第二探针片段的序列是互补的，其中第二探针片段位于第一探针片段的下游。
[0007]另一方面，本发明提供了一种组合物，包含:
[0008]a)具有与第二核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，该第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游；以及
[0009]b)用于检测靶序列的核酸探针，其中探针包含第一探针片段和位于第一探针片段下游的第二探针片段；[0010]其中第一多核苷酸片段的序列和第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸片段的序列和第二探针片段的序列是互补的。
[0011]在某些方面，本发明提供了一种用于测定样品中存在靶核酸的方法。该方法包括在多核苷酸存在下使样品和探针接触。多核苷酸具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段，该第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游。探针是用于检测靶核酸的核酸探针。探针包含第一探针片段和位于第一探针片段下游的第二探针片段。第一多核苷酸片段的序列和第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸片段的序列和第二探针片段的序列是互补的。
[0012]在其他方面，本发明提供了一种试剂盒。试剂盒包含具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，该第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游，其中第一多核苷酸片段的序列和用于检测靶核酸的探针的第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸的序列和探针的第二探针片段的序列是互补的，其中第二探针片段位于第一探针片段的下游。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是本发明的“探针包装(probe wrapper)”与探针杂交的一个实施方式的示意图。
[0014]图2是本发明的某些实施方式的示意图:描述了具有如SEQ ID NO:1所给出的序列的探针以及如SEQ ID NO:2所给出的序列的探针包装。荧光团O ;猝灭剂.。
[0015]图3是示出一个实施方式中的探针包装和探针的示意图，其中探针与靶序列杂
交。`
【具体实施方式】
[0016]在一方面，本发明提供了用于检测靶核酸序列的核酸探针的杂交的多核苷酸(在此也称之为“探针包装”)。一般地，在规定条件下，探针包装与核酸探针的上游和下游区域都有杂交。
[0017]图1示意性地示出了探针包装I通过互补碱基对3与DLP2杂交的一个实施方式。在图1中所示的实施方式中，探针包装是具有与第二多核苷酸片段5邻接的第一多核苷酸片段4的单链多核苷酸，其中第二多核苷酸片段5位于第一多核苷酸片段4的下游。第一多核苷酸片段4的序列和定义探针2的第一探针片段6的第一探针序列是互补的，探针2还包含第一探针片段6下游的第二探针片段7，第二探针片段7也包含核酸序列。探针包装I的第二多核苷酸片段5的序列和探针2的第二探针片段7的序列是互补的。在图1中，将探针2描述为进一步包含分别在其5’和3’末端的报告剂8和猝灭剂9。
[0018]一般地，第一探针片段，第二探针片段，或两者都和靶序列是完全或充分地互补的以允许探针以序列特异性的方式与靶标杂交。
[0019]虽然，在某些实施方式中，探针包装的第一和第二多核苷酸片段的序列与探针的第一和第二探针片段的序列是完全互补的，但在其他实施方式中，探针包装与探针的杂交不限于通过完全互补的序列使它们各自的片段退火(annealing)。换言之，只要多核苷酸(即探针包装)与探针特异性结合，退火片段的序列就不必完全互补；可包括一或多个通用碱基，例如，肌苷或5-硝基吲哚；以及可部分包括不互补的碱基或序列。
[0020]在一个实施方式中，探针包装的第一多核苷酸片段的序列和探针的第一探针片段的序列的反向互补序列是同源的。在另一个实施方式中，第一多核苷酸片段的序列和第一探针片段序列的反向互补序列之间的同源性百分比至少约为90%，例如，约90%至约100%，以及约94%至约96%。在某些实施方式中，第一多核苷酸片段的序列是第一探针片段的序列的反向互补序列。
[0021]在另一实施方式中，探针包装的第二多核苷酸片段的序列和探针的第二探针片段的序列的反向互补序列是同源的。在另一实施方式中，第二多核苷酸片段的序列和第二探针片段的序列的反向互补序列之间的同源性百分比至少约为90%，例如，约90%至约100%，以及约94%至约96%。在某些实施方式中，第二多核苷酸片段的序列是第二探针片段的序列的反向互补。
[0022]在优选的实施方式中，探针包装能够与具有报告剂和猝灭剂的DLP杂交。
[0023]例如，在某些实施方式中，DLP是在一端用荧光染料(报告剂)标记以及相对端用猝灭剂分子标记的单链多核苷酸。在不持有任何特定理论的情况下，认为当猝灭剂在物理上接近报告剂时，通过其中最常见的为荧光共振能量转移(FRET)的物理化学机制使荧光猝灭。在规定条件下，本发明的探针包装与DLP的上游和下游的片段都可以杂交，因此报告剂和猝灭剂的定位彼此极为接近(图1)。这种“包装(wrapping)”可提高通过猝灭剂分子猝灭荧光的效率，从而降低例如PCR周期的检测期间的游离形式(即，在靶标检测中无约束或未结合)的DLP的荧光背景。这致使可产生假阳性结果的信号漂移的消除或显著减少。进一步地，DLP和探针包装之间的相互作用是可逆的，例如，在PCR周期中的变性步骤期间使分子分离以确保DLP对于靶 标检测的下一周期的有效性。
[0024]在设计探针包装时，例如，对于使用有相互作用标记(例如，报告剂/猝灭剂)的DLP，在试验条件和检测温度下，探针包装的上游和下游片段(即分别为第一和第二多核苷酸片段)应具有足够长度，当DLP没有与靶标结合时，探针包装和探针是相关联的，并且探针的标记基团保持彼此极为接近。根据使用的检测条件，探针包装的第一和第二多核苷酸片段中的每一个的长度各自可达至少约3个核苷酸，例如，约3至约50个核苷酸，约5至30个核苷酸，约9至约20个，以及约11至约15个核苷酸。在一个实施方式中，每个片段的长度各自为约9至约11个核苷酸。进一步地，也可根据包括探针和/或靶序列的检测条件使用更大长度(例如，大于约50个核苷酸)的探针包装片段。可参考探针和/或靶序列选择探针包装的每个多核苷酸片段的实际长度，如此在检测步骤期间在靶标缺失的情况下探针仍能与探针包装结合。
[0025]如图2中所述的探针包装/探针，探针包装的第一和第二多核苷酸片段表示为每个具有11个核苷酸的长度，与探针的各自的片段是完全互补的，探针是具有总长为30个核苷酸的单链核苷酸。
[0026]在某些实施方式中，探针包装与具有单对的标记基团的DLP结合。在其他实施方式中，DLP具有多于一对的标记基团。进一步地，不必将标记对的成员之间对应的分子一一对应，尤其是其中一个成员可影响其他成员的多于一个分子或被其影响。标记基团可相互作用，使得至少一个基团可以邻近相关的方式改变另一标记基团的至少一种可物理度量的特征。可根据探针是否与探针包装或靶标结合检测标记对的特征信号的不同。在某些实施方式中，标记对包含与两个或更多猝灭基团配对的一个荧光基团。
[0027]例如，参见图1，优选的标记基团是单个FRET对，更优选的是荧光团8和猝灭剂9。在该实施方式中，特征信号是特定波长的荧光。当探针与探针包装结合时，猝灭剂基团能够猝灭来自报告剂基团的荧光，其中若通过适当频率的光激发报告剂基团，则测定相对较低或约为O的在第一水平(级，level)的荧光信号。当探针没有与探针包结合时，猝灭剂基团不能像其中探针和探针包装彼此结合一样有效猝灭来自报告剂基团的荧光，其中若通过适当频率的光激发报告剂基团，可测定优选大于第一水平的第二水平的荧光信号。进一步地，若存在靶序列，可测定在第三水平的信号，其中第三水平大于第一水平和第二水平的任一个。
[0028]在某些实施方式中，在检测条件期间，在没有靶序列的检测条件下探针包装足够强的可逆结合至探针，但探针与其靶序列的杂交足够弱，如果存在的话，在热力学上优于探针包装与探针的相互作用。
[0029]在某些实施方式中，荧光染料包括但不限于FAM、BODIPY FL、Cy3?、Cy3.5TM、Cy5?、Cy5.5?、EDANS、荧光素、HEX、IAEDANS、JOE、俄勒冈绿 ? (Oregon Green?)、(LC)Red640、(LC)Red705、ROX, TAMRA, TET,四甲基罗丹明、德克萨斯红? (Texas Red?),或它们的组合。
[0030]在其他实施方式中，猝灭剂染料包括但不限于BHQ-l?、BHQ-2?、BHQ-3?、DABCYL,诸如金纳米颗粒的金属簇和QSY7?。
[0031]在一个实施方式中，相互作用标记包括但不限于供体/受体对，例如，FAM/BHQ-1、荧光素/四甲基罗丹明、荧光素/荧光素、荧光素/QSY7、荧光素/LC RED640、荧光素/LCRed705IAEDANS/ 荧光素、EDANS/DABCYL、BODIPY FL/BODIPY FL、TET/BHQ-1、J0E/BHQ-1、HEX/BHQ-1、俄勒 R绿 /BHQ-1、TAMRA/BHQ-2、R0X/BHQ-2、Cy3/BHQ-2、Cy3.5/BHQ-2、德克萨斯红 /BHQ-2、德克萨斯红 /BHQ-2、Cy5/BHQ-3 和 Cy5.5/BHQ-3。
[0032]其他有用的标记对包括报告剂`酶和合适的抑制剂。
[0033]在另一实施方式中，探针包装能够分别与具有用FAM和BHQl标记的5’和3’末端的DLP杂交。
[0034]虽然第二片段与第一片段邻接并直接在其下游，如图1所示，在其他实施方式中，探针包装可进一步包含在第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段之间的间隔子。
[0035]本文中术语“间隔子”是指具有连接到探针包装的第一多核苷酸片段的第一末端和连接到其第二多核苷酸片段的第二末端的分子。因此，间隔分子将第一和第二片段隔离但与两者相连。间隔子可直接合成或优选的是作为整体连接到探针包装上的特定位置。间隔子内的结合可包括但不限于碳-碳单键、碳-碳双键、碳-氮单键或碳-氧单键。本发明中适用的间隔子包括例如含有腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶作为碱基以及脱氧核糖作为结构元件的核苷酸。进一步地，然而，核苷酸也可包含本领域内公知的任何人工碱基，它能够利用上述碱基中的至少一个(例如肌苷)进行碱基配对。优选的间隔子也包含可具有可变长度的胸苷间隔子。间隔子还可具有合适的活性基团，优选的位于用于连接到第一和第二片段的每个末端。例如，这种活性基团可包含羟基、巯基、醛基、酰胺基和硫代酰胺基团。此外，间隔子可具有侧链或其他取代基。活性基团可通过本领域公知的合适的方法发生反应，例如，优选地，间隔子和探针包装片段之间的共价键可形成具有在第一和第二探针包装片段之间的间隔子的单一连续探针包装分子。[0036]在一个实施方式中，探针包装具有3’末端，其被修饰以防止由聚合酶的聚合酶延伸。在另一个实施方式中，探针包装包含用磷酸基团、磷酸酯或反向3’一3’键修饰的3’末端。其他的阻断方法和类型已为本领域技术人员熟知并可利用探针包装容易的实施以阻止它的3’末端的聚合酶延伸。
[0037]探针包装和DLP的非限制性实例在表1中提供。
[0038]表1:DLP和包装的序列的实例
[0039]
【权利要求】
1.一种具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，所述第二多核苷酸片段位于所述第一多核苷酸片段的下游，其中，所述第一多核苷酸片段的序列和用于检测靶核酸的探针的第一探针片段的序列是互补的，其中，所述第二多核苷酸片段的序列和所述探针的第二探针片段的序列是互补的，其中，所述第二探针片段位于所述第一探针片段的下游。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述第一多核苷酸片段和所述第二多核苷酸片段的序列分别为所述第一探针片段和所述第二探针片段的序列的反向互补。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸进一步包含位于所述第一多核苷酸片段和所述第二多核苷酸片段之间的间隔子。
4.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸具有如在SEQID NO: 2中给出的序列。
5.一种组合物，包含: a)具有与第二核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，所述第二多核苷酸片段位于所述第一多核苷酸片段的下游；以及 b)用于检测靶序列的核酸探针，其中，所述探针包含第一探针片段和位于所述第一探针片段下游的第二探针片段； 其中，所述第一多核苷酸片段的序 列和所述第一探针片段的序列是互补的，其中，所述第二多核苷酸片段的序列和所述第二探针片段的序列是互补的。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段的序列分别为所述第一探针片段和所述第二探针片段的序列的反向互补。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述多核苷酸进一步包含位于所述第一多核苷酸片段和所述第二多核苷酸片段之间的间隔子。
8.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述核酸探针进一步包含FRET对。
9.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述FRET对是荧光团和猝灭剂。
10.一种用于测定样品中存在靶核酸的方法，所述方法包括: 在多核苷酸存在的情况下使所述样品与探针接触，其中，所述多核苷酸具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段，所述第二多核苷酸片段位于所述第一多核苷酸片段的下游，其中，所述探针是用于检测所述靶核酸的核酸探针，其中，所述探针包含第一探针片段和位于所述第一探针片段下游的第二探针片段，其中，所述第一多核苷酸的序列和所述第一探针片段的序列是互补的，其中，所述第二多核苷酸片段的序列和所述第二探针片段的序列是互补的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述探针进一步包含FRET对。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述FRET对是荧光团和猝灭剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，当所述多核苷酸与所述探针杂交时所述荧光团具有在第一水平的荧光信号，其中，在所述样品中存在所述靶核酸的情况下，所述荧光信号大于所述第一水平。
14.根据权利要求10所述的方法，进一步包括在检测温度下测定所述探针的荧光信号的变化。
15.一种试剂盒，包含具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，所述第二多核苷酸片段位于所述第一多核苷酸片段的下游，其中，所述第一多核苷酸片段的序列和用于检测靶核酸的探针的第一探针片段的序列是互补的，其中，所述第二多核苷酸片段的序列和所述探针的第二探针片段的序列是互补的，其中，所述第二探针片段位于所述第一探针片段的下游。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，进一步包含所述探针。
17.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，所述第一多核苷酸片段和所述第二多核苷酸片段的序列分别为所 述第一探针片段和所述第二探针片段的序列的反向互补。
18.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，所述多核苷酸具有如SEQID NO: 2中所给出的序列。
【文档编号】C12Q1/68GK103781908SQ201280040788
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年7月31日 优先权日:2011年8月24日
【发明者】达努塔·夫龙斯卡, 凯瑟琳·舒斯特 申请人:盖立复治疗公司