益生菌组合物和方法

益生菌组合物和方法
【专利摘要】本发明的特征在于用于调节粘膜免疫系统的组合物和方法。所述组合物包括益生菌微生物，副干酪乳杆菌CBA?L74（国际保藏号LMG?P-24778），所发酵的食品。可选择地，所述组合物可以包含副干酪乳杆菌CBA?L74和生理上可接受的载体。在一些实施例中，副干酪乳杆菌CBA?L74可以是不复制的。所述组合物可以施用于患有免疫系统不成熟相关的胃肠道病症，感染或疾病或者处于免疫系统不成熟相关的胃肠道病症，感染或疾病的风险的受试者。
【专利说明】益生菌组合物和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及益生菌生物，用益生菌生物制备的食物产品和包含益生菌生物的药物组合物。这些组合物可用于刺激粘膜免疫系统并用于治疗与粘膜免疫系统不成熟有关的病症。
【背景技术】
[0002]肠上皮持续暴露于可能对宿主有害或有益的外来物质。因此，肠道免疫系统必须在下列之间找到平衡点:1)由肠道病原体或毒素诱导的保护性免疫应答和2)避免针对食物抗原和通常存在于肠道的IO14种共生有益微生物的免疫反应。无论保护性应答还是耐受性应答的破坏都可导致各种各样的疾病，包括例如感染、炎症、食物变态反应、食物超过敏反应、炎性肠病、克罗恩病、腹腔疾病、牙周疾病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和结肠癌。
[0003]包括肠道免疫系统的免疫调节网络随年龄改变。所述网络在人类新生儿中发育不良并在生命的最初几年逐渐建立。免疫系统的不成熟在婴儿和幼儿中感染和食物相关病症的患病率中起到重要作用。相反，肠道免疫系统响应于新挑战的能力在老年人中下降。
[0004]胃肠道病症例如感染、炎性病症和食物相关病症诸如食物变态反应、食物不耐受或食物超敏反应对儿童和成人的健康和生活质量均有显著影响。传染性胃肠炎是最常见的儿科胃肠道病症。全世界每年有大约十亿次发作，最常见于发展中国家5岁以下儿童。传染性胃肠炎的全世界死亡率在平均每年300至600万儿童的范围内。在美国，每年发生2500至3500万新发病例，造成300至400人死亡。此外，在美国传染性胃肠炎导致估计200，000人住院和150万门诊人次，花费超过十亿美元。食物相关病症例如变态反应也对儿童和成人的健康有重大影响。食物变态反应的症状可以根据变态反应的严重程度而变化并且范围可以从嘴部和嘴唇周围轻微刺痛感到危及生命的过敏反应。据估计，在美国食物变态反应影响1-10%之间的人口。疾病控制中心发现在2007年约300万年龄18岁以下的儿童(3.9%)被报道在之前的12个月患有食物或消化变态反应。对于有些儿童来说，食物变态反应随着年龄变得不太严重，对于其他人，它们成了终生的忧虑。在生命早期患有变态反应的婴儿有可能发展“变态反应推进”。例如，在婴儿期对牛奶有严重变态反应的许多个体随后在儿童期有发展哮喘的风险。种种迹象表明食物变态反应的患病率在世界范围内不断增加。
[0005]无论病因是什么，胃肠道病症不仅对儿童的健康产生不利影响而且可能对家庭经济、社会交往以及学校和家长工作的出勤率具有严重影响。有对于促进胃肠健康(尤其是在有胃肠道病症风险或患有胃肠道病症的个体中)的治疗策略的持续需求。
[0006]发明概沭
[0007]本发明提供包含发酵食物产品的组合物，其中所述食物产品已经被益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P - 24778，所发酵。所述食物产品可以是乳制品或谷物产品。还提供了包含益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBAL74，国际保藏号LMG P - 24778，和生理上可接受的载体的组合物。生理学上可接受的载体可以是食物产品或药学载体。还提供了制造营养组合物的方法，所述方法包括:提供食物产品；将所述食物产品与有效量的益生菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号为LMG P - 24778，以及任选的共接种物组合以形成混合物；以及将所述混合物在足以发生发酵的温度和时间孵育。营养组合物可被干燥。营养组合物可以与一种或多种另外的食物产品组合。对于本文描述的组合物和方法中的任一种，副干酪乳杆菌CBA L74细胞可经受使得它们不复制的处理。组合物中副干酪乳杆菌CBAL74的浓度可根据预期用途而变化，例如，作为营养组合物或药物组合物。有用的范围包括约IXlO2个菌落形成单位每克(“cfu/g”)至约IXlO12个菌落形成单位每克(“cfu/g”)干重的当量
[0008]还提供了治疗有发展胃肠道病症的风险的受试者的方法，所述方法包括:鉴定有发展胃肠道病症的风险的受试者；施用有效量的包含食物产品的组合物，其中所述食物产品已经由益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P-24778，所发酵。胃肠道病症可以是粘膜免疫系统缺陷例如不成熟的免疫系统、食物变态反应、腹泻相关疾病、细菌或病毒感染、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩病、坏死性小肠结肠炎或老化，特别是胃肠道系统老化。
[0009]本发明还提供治疗患有胃肠道病症的受试者的方法。所述方法包括:鉴定患有胃肠道病症的受试者；施用有效量的包含食物产品的组合物，其中所述食物产品已经被益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P-24778，所发酵。在一些实施方案中，所述方法包括:鉴定患有胃肠道病症的受试者；施用有效量的药物组合物，其包含益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P-24778。胃肠道病症可以是粘膜免疫系统缺陷，例如不成熟的免疫系统、食物变态反应、腹泻相关疾病、细菌或病毒感染、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩病或坏死性小肠结肠炎。
[0010]还提供了调节受试者中免疫系统的方法。所述方法包括:鉴定需要免疫系统调节的受试者和施用有效量的包含食物产品的组合物，其中所述食物产品已经被益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P-24778，所发酵。
[0011]还提供制造的物品。这些可以包括包含测定量的包含发酵的食物产品的营养组合物和选自由包装材料、包括使用说明的包装插页、无菌流体和无菌容器组成的组的一项或多项的试剂盒，其中所述食物产品已经被益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P-24778，所发酵。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括测定量的包含副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMGP-24778的药物组合物和选自由包装材料、包括使用说明的包装插页、无菌流体和无菌容器组成的组的一项或多项的。
[0012]本发明的一个或多个实施方案的细节阐述于附图和下文说明中。本发明的其它特征、目的和优点将因说明书描述和附图以及权利要求书而显而易见。
[0013]附图简沭
[0014]本发明的这些和其它特征和优点将更充分地公开于以下本发明的优选实施方案的详细描述或因以下本发明的优选实施方案的详细描述而变得明显，其应当与附图一起考虑，其中相同的数字表示相同的部分并且进一步地其中:
[0015]图1是显示分析副干酪乳杆菌CBA L74对DC细胞表型的影响的表格。
[0016]图2a是描述在与暴露于副干酪乳杆菌CBA L74的Caco2共培养的DC中IL-10产生的图表。图2b是描述在与暴露于副干酪乳杆菌CBA L74的Caco2共培养的DC中IL-12产生的图表。[0017]图3是描述在暴露于与Caco2细胞共培养的DC的T细胞的增殖的图表。
[0018]图4是描述在补充副干酪乳杆菌CBA L74的小鼠的肠粘膜中IL-1 β产生的图表。
[0019]图5是描述在补充副干酪乳杆菌CBA L74的小鼠的肠粘膜中IL_4产生的图表。
[0020]图6是描述在补充副干酪乳杆菌CBA L74的小鼠的肠粘膜中IgA产生的图表。
[0021]图7描述对补充副干酪乳杆菌CBA L74的小鼠的肠粘膜中TLR2、TLR4和TLR9的水平的分析。
[0022]图8描述对补充副干酪乳杆菌CBA L74的小鼠的肠粘膜中PPAR Y的水平的分析。
[0023]图9a是描述在补充副干酪乳杆菌CBA L74的小鼠中血清IL-1 β水平的图表。图9b是描述在补充副干酪乳杆菌CBA L74的小鼠中血清IL-4水平的图表。
[0024]图10是显示分析副干酪乳杆菌CBA L74对补充副干酪乳杆菌CBA L74的小鼠中DC表型的影响的表格。
[0025]图1la是描述补充副干酪乳杆菌CBA L74的小鼠中肠⑶4+淋巴细胞表型的图表。图1lb是描述补充副干酪乳杆菌CBA L74的小鼠中肠CD8+淋巴细胞表型的图表。
[0026]图12是描述在补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶的小鼠的肠粘膜中IL-10产生的图表。
[0027]图13是描述在补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶的小鼠的肠粘膜中IL-1 β产生的图表。
[0028]图14是描述在补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶的小鼠的肠粘膜中IgA产生的图表。
[0029]图15描述对补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶的小鼠的肠粘膜中TLR2、TLR4、TLR9和PPAR Y的水平的分析。
[0030]图16描述对补充用副干酪乳杆菌CBA发酵的奶的小鼠的肠粘膜中pNF-κ B和IKBa的水平的分析。
[0031]图17描述对补充用副干酪乳杆菌CBA发酵的奶的小鼠中副干酪乳杆菌CBA L74对DC细胞表型的影响的分析。
[0032]图18是对补充用副干酪乳杆菌CBA发酵的奶的小鼠中暴露于LPS或CpG后副干酪乳杆菌CBA L74对DC细胞表型的影响的分析。
[0033]图19是描述补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶的小鼠中肠CD4+淋巴细胞表型的图表。
[0034]图20是描述补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶的小鼠中肠CD8+淋巴细胞表型的图表。
[0035]图21显示补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶的小鼠中回肠粘膜的组织学评估。
[0036]图22是描述补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米的小鼠的肠粘膜中IL-1 β和IL-4产生的图表。
[0037]图23是描述补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米的小鼠的肠粘膜中IL-10产生的图表。
[0038]图24是对补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米的小鼠的肠粘膜中TLR2和TLR4水平的分析。[0039]图25a是对补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米的小鼠的肠粘膜中PPAR Y水平的分析。图25b是对补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米的小鼠的肠粘膜中pNF-κ B和IKBa水平的分析。
[0040]图26是显示对补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米的小鼠中副干酪乳杆菌CBA L74对DC表型的影响的分析的表格。
[0041]图27是显示对补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米的小鼠中暴露于LPS或CpG后副干酪乳杆菌CBA L74对DC表型的影响的分析的表格。
[0042]图28是描述补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米的小鼠中肠CD4+淋巴细胞表型的图表。
[0043]图29是描述补充用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米的小鼠中肠CD8+淋巴细胞表型的图表。
[0044]图30是描述对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)存在时人MoDC中副干酪乳杆菌CBA L74细胞和细胞上清液对IL-1O产生的影响的分析的图表
[0045]图31是描述对鼠伤寒沙门氏菌存在时人MoDC中副干酪乳杆菌CBA L74细胞和细胞上清液对IL-12p70产生的影响的分析的图表。
[0046]图32是描述对鼠伤寒沙门氏菌存在时人MoDC中副干酪乳杆菌CBA L74细胞发酵的奶对IL-1O产生的影响和鼠伤寒沙门氏菌存在时人MoDC中副干酪乳杆菌CBA L74的失活对IL-1O产生的影响的分析的图表。
[0047]图33是描述对鼠伤寒沙门氏菌存在时人MoDC中副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶对IL-12p70产生的影响和鼠伤寒沙门氏菌存在时人MoDC中副干酪乳杆菌CBA L74的失活对IL-12p70产生的影响的分析的图表。
[0048]图34是描述对鼠伤寒沙门氏菌存在时肠道组织移植模型中副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米对IL-1 β、TNF-α和IL-1O的影响的分析的图表。
[0049]发明详沭
[0050]本发明基于，部分地，本发明人的经益生菌生物副干酪乳杆菌发酵，菌株CBA L74，所发酵的食物可具有免疫调节特性的发现。这一菌株由发明人分离并且根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约于2008年9月9日保存在LAB0RAT0RIUM voorMicrobiologie (LMG) , Ghent, Belgium的比利时微生物协作保藏中心(BCCM)0由国际保存单位提供的保藏号为LMGP-24778。为了便于阅读，我们不会每次都重复短语“保藏号为LMG P-24778”。但是应当理解的是当我们提及副干酪乳杆菌菌株CBA L74时我们是指具有保藏号LMGP-24778的保藏菌株。
[0051]本发明的组合物包括益生菌生物副干酪乳杆菌CBA L74。世界卫生组织定义益生菌为:“当以足量施用时给予宿主健康益处的活的微生物”。在一些实施方案中，副干酪乳杆菌CBA L74可经受使得它们不复制的处理，例如暴露于热、干燥、Y射线辐照或紫外线辐照。不复制的副干酪乳杆菌CBA L74可以是死细胞或已使得无法细胞分裂的活细胞。不复制的副干酪乳杆菌CBA L74可以是完整的细胞或已经历部分或完全溶解的细胞。在一些实施方案中，不复制的细胞可以包括完整的和溶解的细胞的混合物。
[0052]虽然我们相信我们理解在施用包含使用副干酪乳杆菌CBA L74的发酵物或使用副干酪乳杆菌CBA L74的发酵物制成的组合物时发生某些事件，但本发明的组合物并不限于通过影响任何特定的细胞机制起作用的那些。我们的作用假设是益生菌生物或用益生菌生物发酵的组合物可提供增加的屏障以将细菌和细菌产物易位穿过粘膜，竞争性排除潜在病原体，修改宿主对微生物产品的反应并以抑制病原体生长的方式加强肠内营养。包含不复制的益生菌生物的组合物的有益效果可来自于，例如发酵过程中产生的代谢产物，诸如有机酸例如乳酸、丁酸或乙酸。可选择地或另外地，微生物DNA例如未甲基化的CpG 二核苷酸，细菌细胞壁片段和其他亚细胞细菌成分例如蛋白质、碳水化合物和脂类可发挥对粘膜免疫系统的免疫调节作用。
[0053]本发明人已经发现体外和体内测定时分离的副干酪乳杆菌CBA L74调节的促炎性标志物和抗炎性标志物两者的水平。此外，免疫调节作用也在施用已被副干酪乳杆菌CBAL74发酵的食物时观察到。即使在发酵食物已被处理，例如通过热，以使得副干酪乳杆菌CBAL74不复制时，仍注意到这些免疫调节作用。因此，本发明的特征在于可用于刺激肠道免疫系统的组合物和方法。所述组合物可包括已经被副干酪乳杆菌CBA L74发酵的食物产品。食物产品可以是适合于副干酪乳杆菌CBA L74发酵的各种各样食物中的任一种。在一些实施方案中，所述组合物可包括分离的副干酪乳杆菌CBA L74和生理学载体。所述载体可以是食物产品，但本发明并不限于此，并且在一些实施方案中，载体可以是药理学的载体。本发明还提供制造和使用所述组合物的方法。本发明的方法包括产生包含副干酪乳杆菌CBAL74的组合物的方法，用副干酪乳杆菌CBA L74发酵食物产品的方法和施用所述组合物以在受试者中产生免疫调节应答的方法。所述组合物可被施用于具有未成熟免疫系统的受试者、处于患有胃肠道病症风险或患有胃肠道病症的受试者。所述方法可以用于人受试者例如婴儿和儿童或兽医学中。不管受试者(无论人类或非人类)如何，本发明方法中的任一个可以包括鉴定所述受试者的步骤。例如，所述方法可以包括确定受试者是否是需要治疗的步骤。
[0054]组合物
[0055]发酵的食物
[0056]本发明的组合物包括营养组合物，即由益生菌生物，副干酪乳杆菌CBAL74，所发酵的食物。可使用适合于副干酪乳杆菌CBA L74发酵的任何食物产品。所述食物产品可以是乳制品，例如奶或基于奶的产品。示例性奶源包括但不限于牛、绵羊、山羊、牦牛、水牛、马、驴、鹿和骆驼。不论来源如何，奶或奶产品可以是适于副干酪乳杆菌CBA L74发酵的任何形式。例如，奶可以是全脂奶或已处理以除去部分或全部乳脂的奶，例如，2%奶，1%奶或无脂奶。可选择地或另外地，奶可以预先巴氏消毒和或均质化，干燥和重构，冷凝或蒸发。也可使用包括酪蛋白、乳清蛋白或乳糖的乳产品馏分。在一些实施方案中，乳产品可以是从约1%至约30%重构脱脂奶粉，例如约2%、约5%、约7%、约9%、约10%、约12%、约15%、约20%、约25%、约30%的重构脱脂奶粉。发酵前，奶产品可与下列中一种或多种组合:a)碳水化合物(例如二糖诸如葡萄糖或淀粉；b)脂质；c)维生素和d)矿物。例如，脱脂奶粉可与葡萄糖组合至约2%，例如约0.25%、约0.50%、约0.75%、约1.0%、约1.5%或约2.0%。
[0057]所述食物产品可以是谷物产品,例如稻米、小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、高粱、小米或黑小麦。谷物产品可以是整个谷物或者被研磨成粉。所述食物产品可以是单一种类的谷物或两种或更多种谷物的混合物，例如燕麦粉加上发芽大麦面粉。谷物产品可以具有适合人类食用的级别和类型或可以式适于家畜食用的产品。一般地，谷物产品在发酵之前水合。谷物的浓度可以变化，但是可用的范围包括从约5%至约50%重量/体积，例如约8%重量/体积、约10%重量/体积、约12%重量/体积、约15%的重量/体积、约18%重量/体积、约20%重量/体积、约22%重量/体积、约25%重量/体积、约30%重量/体积、约35%重量/体积、约40%重量/体积、约45%重量/体积或约50%重量/体积。示例性浓度包括15%重量/体积的稻或18.5%重量/体积的燕麦粉加上5%重量/体积的发芽大麦面粉的混合物。水合谷物的PH可以使用适合于食用的酸来调节。所述酸可以是例如有机磺酸。有用的有机酸包括乙酸、柠檬酸、乳酸、己二酸、苹果酸和酒石酸。可以使用两种或更多种酸的任何组合。在一些实施方案中，可以使用柠檬酸将PH调节至约4.0。
[0058]食物产品也可以是蔬菜或水果产品，例如果汁、果泥、浓缩液、糊状物、酱、咸菜或ketchup。示例性的蔬菜和水果包括但不限于南瓜类例如西葫芦、黄南瓜、笋瓜、南瓜；土豆类，芦笋，甘蓝，抱子甘蓝，豆类例如绿豆、蜡豆、利马豆、蚕豆、大豆，白菜，胡萝卜，菜花，黄瓜，大头菜，韭菜，大葱，洋葱，蜜糖豆(sugar pea),青豆(English pea)，辣椒，萝卜，芜菁甘蓝，西红柿，苹果，梨，桃子，李子，草莓，覆盆子，黑莓，蓝莓，越橘，波森莓，醋栗，葡萄，红醋栗，橘子，柠檬，葡萄柚，香蕉，芒果，猕猴桃和杨桃。
[0059]所述食物产品也可以是从谷物(大麦、燕麦或斯卑尔脱小麦“奶”)，坚果(杏仁、腰果、椰子、榛子或核桃“奶”)，豆类(大豆、花生、豌豆或扁豆“奶”)或种子(藜，芝麻或葵花籽“奶”)制得的“奶”。
[0060]还预期的是食物产品，其包含动物蛋白，例如肉，诸如香肠、干肉、鱼和干鱼产品。
[0061]无论所用的食物产品的类型如何，产品与副干酪乳杆菌CBA L74组合并以发酵足以发生的温度和的时间孵育。可以使用本领域中已知的任何标准发酵方法。特定发酵条件将根据许多因素变化，包括例如食物产品的类型，食物产品的浓度，所使用的仪器，样品体积，副干酪乳杆菌CBA L74接种物的初始浓度，共同接种物(如果有)的存在，所发酵的食物的感官特性和所发酵食物的预期用途。
[0062]仪器和底物(S卩，有待发酵的食物产品)在用副干酪乳杆菌CBA L74接种之前灭菌以便降低存活细菌和/或真菌和/或感染性的病毒的水平或者消除存活细菌和/或真菌和/或感染性的病毒。所述仪器可使用标准方法或根据制造商的说明进行灭菌。对底物灭菌的特定方法的选择将取决于，部分地，所述底物对灭菌方法的稳定性。例如，底物可以通过蒸汽和压力灭菌，例如通过高压灭菌、加热和冷却的重复循环(例如间歇灭菌)、暴露于高压力(例如超高压灭菌(pascalization))、超滤或福射(例如，反复循环暴露于Y _、X_，电子束和 / 或紫外线(IOnm 至 320nm,例如 50nm 至 320nm、IOOnm 到 320nm、150nm 到 320nm、180nm至320nm或200nm至300nm的波长))。底物的等份试样可进行下列处理并且和铺板在合适的培养基上以确认没有细菌和/或真菌污染物存在。如果底物已通过暴露于高温来灭菌，它应该在用副干酪乳杆菌CBA L74接种前冷却到至少37°C下。.[0063]底物可以按照标准方法用副干酪乳杆菌CBA L74接种，例如来自新鲜液体培养物或在接种前已重新悬浮在水介质中很短时间的冷冻干燥的培养物。通常，副干酪乳杆菌 CBA L74 以约 0.5X IO6 至约 I X 106cfu/ml，例如，约 I X 106cfu/ml、约 2X 106cfu/ml、约5X 106cfu/ml,7X 106cfu/ml,8X 106cfu/ml的浓度加至底物。培养物应被充分地搅拌以产生菌和底物的相对均匀的分布但不会过度，因为副干酪乳杆菌CBA L74是厌氧细菌。例如，五升的培养物可在约150rpm下进行搅拌。发酵温度一般在37°C。各种参数，例如pH值、O2的局部压力、搅拌速度、温度、气体的混合、发泡水平和底物浓度，在发酵过程中可以被监测并相应调整。副干酪乳杆菌CBA L74的生长可以使用标准的微生物学方法进行监测。进行发酵直到副干酪乳杆菌CBA L74的浓度为约108/ml和约109/ml之间。根据底物和其它条件，所述浓度可以在接种后约10至约30小时，例如约12小时、约15小时、约18小时、约24小时、约30小时达到。
[0064]底物的样品可以使用标准的微生物学方法在发酵之前、期间和之后进行测定以确保质量。示例性的方法包括但不限于，Rogosa琼脂上副干酪乳杆菌CBAL74的生长、平板计数琼脂(PCA)上总需氧菌的生长、McConkay琼脂上大肠菌类的生长、强化的梭菌琼脂(RCM)上梭菌的生长，除了菌落计数，还可以观察菌落形态并与参考样本比较。
[0065]在一些实施方案中，共接种物可随副干酪乳杆菌CBA L74—起加入以帮助起始发酵。对奶产品发酵有用的共接种物包括，例如但不限于嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、副干酪乳杆菌、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarious)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosu)、干酿乳杆菌(Lactobacillus casei )、乳酸乳杆菌(Lactobacillus Iactis)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii )、保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)或明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。通常，共接种物的浓度将低于副干酪乳杆菌CBA L74的浓度，例如，约I X IO 4/ml X 105/ml。嗜热链球菌的最终浓度可在约0.5 X 108/ml至约2.5 X IO8/ml的范围内。
[0066]食物产品
[0067]一旦已经达到副干酪乳杆菌CBA L74的适合浓度，可将发酵食物进一步加工以供使用。在一些实施方案中，发酵食物产品的PH值可以通过加入NaOH或KOH来调节，例如从约3.0至接近中性诸如6.5。在一些实施方案中，可干燥发酵食物产品。发酵食物产品可以通过本领域已知的任何方法进行干燥，这将导致对发酵食物免疫调节特性的保持。示例性的干燥方法包括喷雾干燥、冷冻干燥例如冻干或转鼓干燥。发酵食物产品的最终含水量可以变化但可以在约1%至约10%之间或更多。在一些实施方案中，干燥加工可以使副干酪乳杆菌CBA L74不复制。
[0068]干燥的发酵食物可在使用前水合。取决于水合中使用的液体的量，发酵食物产品可含有约IO2和1012cfu/ml当量的副干酪乳杆菌CBA L74。干燥后的副干酪乳杆菌CBA L74不形成菌落，所以可以理解的是这一量是基于干燥步骤前发酵食物中存在的活细菌的数目计算的。在一些实施方案中，发酵食物产品可以包括约IO7到约1012cfu/g，例如约5X IO7Cfu/g,约 I X 108cfu/g,约 5 X 108cfu/g,约 I X 109cfu/g,约 5 X 109cfu/g,约 I X IO10Cfu/g,约5X101Qcfu/g，约 lX10ncfu/g，约 5X10ncfu/g 的干重的当量。
[0069]本发明的方法制备的两种或更多种发酵食物产品可在施用前组合。例如，发酵的奶产品可与发酵的谷类产品组合。可选择地，所述发酵食物产品可以与其它食物产品例如非发酵食物产品或使用其它菌株发酵的食物产品组合。可以使用任何组合，只要保留发酵食物的免疫调节特性。示例性的食物产品包括但不限于，奶制品，例如奶、酸奶、凝乳、奶酪、基于干奶酪的产品、发酵乳、基于奶的发酵产品、基于奶的粉末、婴幼儿配方奶粉、基于奶的去渣婴幼儿食物、雪糕、冰淇淋、布丁、汤、酱汁、果泥或调味品、老年人营养配方；谷物产品，例如pablum、基于谷类的去渣婴幼儿食物、燕麦片、谷粉、小麦粉、玉米粥、面条、饼干、薄脆饼干、能量条；蔬菜产品，例如菜泥，基于蔬菜的去渣婴幼儿食物，腌制蔬菜包括黄瓜、白菜、胡萝卜、豆角、辣椒，或调味品；水果产品，例如基于水果的去渣婴幼儿食物、番茄产品、果浆、酱汁剂、糊剂、ketchup、果泥；或基于蛋白的产品，例如豆类、香肠、午餐肉、热狗或肉泥。在一些实施方案中，发酵食物可与宠物食物或动物饲料组合。
[0070]在一些实施方案中，所述组合物可以包含副干酪乳杆菌CBA L74的发酵物，已经从其除去所有或基本上所有的副干酪乳杆菌CBA L74细胞。从生长培养基中分离细胞的方法是本领域众所周知的并且可以依靠物理方法例如离心以产生细胞沉淀和培养上清液、过滤、超滤、切向流过滤、正常流动过滤或反渗透。可选择地或另外地，所述分离方法可以是基于配体的并包括，例如与副干酪乳杆菌CBA L74特异性结合的抗体。所述抗体可以被偶联到固相支持物例如磁性珠上。
[0071]所分离的副干酪乳杆菌CBA L74
[0072]在一些实施方案中，本发明的组合物包括从它们生长的培养基部分或基本上分离的副干酪乳杆菌CBA L74。副干酪乳杆菌CBA L74可以是活的或是不复制的，例如灭活的，诸如通过热处理。所述细胞可以在维持细胞生存力的条件下被冻干或冷冻干燥。冻干的方法是本领域内熟知的。
[0073]生理学载体
[0074]在一些实施方案中，本发明的组合物可包括与生理上可接受的载体的组合的分离的副干酪乳杆菌CBA L74。副干酪乳杆菌CBA L74可以是活的或是不复制的，例如灭活的，诸如通过热处理。剂量可变化但范围可以在约102cfu/g约至约1012cfu/g,例如IXlO2Cfu/g、5X 102cfu/g、l X 103cfu/g、5X 103cfu/g、lX 104cfu/g、5X 104cfu/g、l X 105cfu/g、5X 105cfu/g、lX 106cfu/g、5X 106cfu/g、lX 107cfu/g、5 X 107cfu/g、I X 108cfu/g、5X 108cfu/g、lX 109cfu/g、5X 109cfu/g、lX 10lclcfu/g、5X 101Qcfu/g、lX 10ucfu/g、5 X 10ncfu/g、I X 1012cfu/g 的干重的当量。
[0075]生理学上可接受的载体可以是食物或食物产品。分离的副干酪乳杆菌CBAL74可在包装或加工之前添加到食物或食物产品。可选择地或另外地，分离的副干酪乳杆菌CBAL74可在食用前添加到食物或食物产品。例如，分离的副干酪乳杆菌CBA L74可以与上述食物或食物产品中的任一种组合。食物产品可以是发酵食物产品或未发酵食物产品，例如，分离的副干酪乳杆菌CBA L74可被添加到未发酵的奶制品或谷物产品，在一些实施方案中，副干酪乳杆菌CBA L74可以添加到食物或食物产品以包括约IO7的到约1012cfu/g，例如约 5X107cfu/g、约 I X 108cfu/g、约 5X108cfu/g、约 I X 109cfu/g、约 5 X 109cfu/g、约lX101Qcfu/g、约 5X1010cfu/g、约 lX10ncfu/g、约 5X10ncfu/g 的干重的当量。.[0076]药物载体
[0077]所述组合物还包含药学上可接受的载体。我们使用的术语“药学上可接受的”(或“药理学上可接受的”)是指，适当地，施用于动物或人时不产生不利的、变应性的或其它不良反应时的分子实体和组合物。术语“药学上可接受的载体”，如本文所用，包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶齐U、表面活性剂等，其可以作为介质用于药学上可接受的物质。
[0078]本发明还包括含有与一种或多种药学上可接受的载体组合的作为活性成分的本文所描述的副干酪乳杆菌CBA L74的药物组合物。在一些实施方案中，副干酪乳杆菌CBAL74可在其与药学上可接受的载体组合之前或之后用常规灭菌技术进行灭菌。在制造本发明的组合物时，副干酪乳杆菌CBA L74通常与赋形剂混合，用赋形剂稀释或包封在例如胶囊、片剂、囊剂，纸或其他容器形式的载体内。当赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体，半固体或液体材料(如生理盐水)，其起到活性成分的赋形剂、载体或介质的作用。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉末、锭剂、囊剂、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、软膏、软的和硬的明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液和无菌包装粉末的形式。如本领域已知的，稀释剂的类型可以根据施用的预期途径而变化。所得到的组合物可以包括另外的剂，例如防腐剂。赋形剂或载体在施用模式和途径的基础上选择。合适的药物载体以及用于在药物制剂中使用的药剂必需品描述于Remington’s PharmaceuticalSciences (E.ff.Martin),本领域熟知的参考文本,和 USP/NF (United States Pharmacopeiaand the National Formulary)。适合的赋形剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、鹿糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。所述制剂可以另外包括:润滑剂例如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂例如甲基-和丙基羟基-苯甲酸酯；增甜剂以及调味剂。可以配制所述药物组合物以便通过使用本领域已知的程序施用于患者后提供活性组分的快速、持续或延迟释放。
[0079]本发明方法中使用的药学上可接受的组合物，包括其中副干酪乳杆菌CBAL74被包埋在用于口服递送的胶体中的那些，可以根据标准技术来制备。副干酪乳杆菌CBA L74可被干燥并通过研磨或粉碎压制，并插入胶囊用于口服施用。在一些实施方案中，副干酪乳杆菌CBA L74可与一种或多种赋形剂组合，例如崩解剂、填充剂、助流剂或防腐剂。适合的胶囊包括硬胶囊壳或软壳胶囊两者。任何基于脂质或基于聚合物的胶体可被用于形成胶囊。对胶体制品有用的示例性的聚合物包括明胶、植物多糖或它们的衍生物例如卡拉胶和修饰形式的淀粉和纤维素诸如羟丙甲纤维素。任选地，其它组分可以被添加到所述胶凝剂溶液，例如增塑剂诸如甘油和/或山梨糖醇以减少胶囊的硬度、着色剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂和表面处理。在一些实施方案中，所述胶囊不包括明胶。在其它实施方案中，胶囊不包括植物多糖或它们的衍生物。
[0080]不论它们的原始来源或获得它们的方式如何，本发明的副干酪乳杆菌CBAL74可以根据它们的用途来配制。这些组合物可以以制药领域中熟知的方式来制备并且可以是通过各种途径施用，其取决于是否需要局部或全身治疗以及有待治疗的区域。施用可以是口服或局部的(包括眼部和粘膜，包括鼻内、阴道和直肠递送)。在一些实施方案中，施用可以是肺部的(例如，通过粉末或气雾剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮)或经眼的。用于经眼递送的方法可包括局部施用(滴眼液)，结膜下、眼周或玻璃体内注射，或通过手术放置在结膜囊中的气囊导管或眼用插入物引入。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如鞘内或脑室内施用。胃肠外施用可以是单次推注剂量的形式或者可以是例如通过连续灌注泵。用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉末等。常规的药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可能是必要的或期望的。
[0081]所述组合物可以以单位剂型配制，每个剂型含有例如约0.005mg至约2000mg的副干酪乳杆菌CBA L74每每日剂量。术语“单位剂型”指适于作为单一剂量用于人类受试者和其它哺乳动物的物理上分离的单位，每个单位含有经计算产生所期望的治疗效果的预定量的活性物质，与适合的药物赋形剂相关。对于制备固体组合物例如片剂，将主要的活性成分与药物赋形剂混合以形成含有本发明的化合物的均匀混合物的固体预制剂组合物。当提及这些预制剂组合物为均匀的时，活性成分通常均匀地分散在整个组合物中以使得所述组合物可以容易地细分成等效的单位剂型如片剂、丸剂和胶囊剂。这种固体预制剂之后细分成上述类型的单位剂型，其含有例如0.005mg至约IOOOmg的本发明的副干酪乳杆菌CBA L74。
[0082]组合物可以单位剂型配制，每个剂量含有例如约0.1mg至约50mg、约0.1mg至约40mg、约 0.1mg 至约 20mg、约 0.1mg 至约 10mg、约 0.2mg 至约 20mg、约 0.3mg 至约 15mg、约0.4mg 至约 10mg、约 0.5mg 至约 Img ;约 0.5mg 至约 lOOmg、约 0.5mg 至约 50mg、约 0.5mg 至约 30mg,、约 0.5mg 至约 20mg、约 0.5mg 至约 10mg、约 0.5mg 至约 5mg ；约 Img 至约 50mg、约Img至约30mg,、约Img至约20mg、约Img至约10mg、约Img至约5mg ;约5mg至约50mg、约5mg至约20mg、约5mg至约IOmg ;约IOmg至约lOOmg、约20mg至约200mg、约30mg至约150mg、约40mg至约lOOmg、约50mg至约IOOmg的活性成分。
[0083]在一些实施方案中，本发明的片剂或丸剂可以被包被或以另外方式混合以提供给予延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内部剂量和外部剂量组分，后者是包裹整个前者的形式，这两个组分可被抵抗在胃中崩解和允许内部组分完整通过进入十二指肠或延迟释放的肠溶层分开。各种材料可用于这样的肠溶层或包衣，这些材料包括许多聚合酸以及聚合酸与例如紫胶、十六烷醇和乙酸纤维素的材料的混合物。
[0084]其中可掺入本发明的组合物用于口服或注射施用的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆、水性或油性悬浮液和用食用油例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油调味的乳液以及酏剂和类似的药物媒介物。
[0085]药物组合物中本发明的组合物的比例或浓度可以随许多因素变化，包括剂量、化学特性(例如疏水性)和施用途径。例如，本发明的副干酪乳杆菌CBA L74可以提供在胶囊中，其含有约0.005mg克至约IOOOmg用于口服施用。可选择地或另外地，所述剂量可以表示为cfu/g干重。剂量可以变化，但是范围可在约IO2至约1012cfu/g，例如IXlO2Cfu/g、5X 102cfu/g、l X 103cfu/g、5X 103cfu/g、lX 104cfu/g、5X 104cfu/g、l X 105cfu/g、5X 105cfu/g、lX 106cfu/g、5X 106cfu/g、lX 107cfu/g、5 X 107cfu/g、I X 108cfu/g、5X 108cfu/g、lX 109cfu/g、5X 109cfu/g、lX 10lclcfu/g、5X 101Qcfu/g、lX 10ucfu/g、5 X 10ncfu/g、I X 1012cfu/g 的干重。
[0086]使用方法
[0087]本文所公开的组合物通常并且不同地用于刺激粘膜免疫系统的免疫调节应答。这些刺激有益的受试者包括具有粘膜免疫系统缺陷的那些例如具有不成熟免疫系统的那些诸如婴儿或年幼儿童；具有受到抑制的免疫系统的那些例如老年人，接受免疫抑制药物，辐射或化疗的患者；具有归因于变态反应或自身免疫性病症的超激活免疫系统的那些和患有胃肠道病症的那些。胃肠道病症可包括感染，其归因于病毒例如轮状病毒，致病性细菌例如沙门氏菌(Salmonella)、耶尔森氏菌(Yersinia)、志贺氏菌(Shigella)、李斯特氏菌(Listeria)、梭菌(Clostridium)、大肠杆菌(E.coli)、坂崎肠杆菌(E.sakazaki)、幽门螺旋杆菌(H, pylori);或致病原生动物,例如,溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica),隐孢子虫属(Cryptosporidium spp),弯曲杆菌属(Campylobacter spp)。胃肠道病症也可包括，例如食物变态反应、食物超过敏反应、过敏性肠综合征、肠易激综合征、炎性肠病、结肠袋炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、腹腔疾病、坏死性小肠结肠炎和老化，特别是胃肠系统的老化。
[0088]无论临床上有利的结果随后何时发生受试者都是被有效治疗的。这可能意味着，例如与粘膜免疫系统缺陷有关的症状完全消退，与粘膜免疫系统缺陷有关的症状的严重程度的降低或与粘膜免疫系统缺陷有关的症状的进行的缓解。这些方法可以进一步包括下列步骤:a)识别患有粘膜免疫系统缺陷的受试者(例如，患者并且更具体地人类患者)；和b)向受试者提供包含本文所描述的副干酪乳杆菌CBA L74的组合物，例如在生理学上可接受的载体中包含副干酪乳杆菌CBA L74的任何发酵的食品产品或组合物。向受试者提供导致与粘膜免疫系统缺陷有关的症状完全消退，与粘膜免疫系统缺陷有关的症状的严重程度的降低或与粘膜免疫系统缺陷有关的症状的进行的缓解的这样的组合物的量被认为是治疗上有效的量。本发明的方法还可以包括监测步骤以帮助优化给药和时间安排以及预测的结果O
[0089]本文公开的方法可应用于广泛范围的物种，例如人类，非人类的灵长类(例如猴)，马、猪、牛或其它家畜，作为宠物饲养的狗、猫或其他哺乳动物，大鼠、小鼠或其它实验室动物。本文所述的组合物是治疗性组合物和治疗方案中或用于在本文描述的病况(例如，归因于不成熟的粘膜免疫系统缺陷、老化、感染、食物变态反应、炎性或自身免疫性病症)的治疗中使用的药物的制造中。
[0090]本文所述的营养组合物可以作为受试者的普通的日常饮食的一部分口服施用。食品组合物可以作为营养支持施用给儿童和成人。当配制成药物时，所述组合物可以施用于宿主身体的任何部分以便随后递送至靶细胞。组合物可被递送到，但不限于哺乳动物的脑、脑脊液、关节、鼻腔粘膜、血液、肺、肠、肌肉组织、皮肤或腹膜腔。在递送路线方面，组合物可通过静脉内、颅内、腹膜内、肌内、皮下、肌肉内、直肠内、阴道内、鞘内、气管内、皮内或经皮注射施用，经口或经鼻施用，或通过随时间逐步灌注，在另外的实例中，组合物的气雾剂制品可以通过吸入提供给宿主。
[0091]不论组合物配制成食物产品还是药品，所需的剂量将取决于施用途径，制剂的性质，受试者病况例如免疫系统的不成熟或胃肠道病症的性质，受试者的大小、重量、表面积、年龄和性别，施用的其他药物和主治医生的判断。适合的剂量是在0.01-1, 000mg/kg的范围内。一些典型的剂量范围是从约I μ g/kg至约lg/kg体重每天。在一些实施方案中，剂量范围是从约0.01mg/kg到约100mg/kg体重每天。在一些实施方案中，剂量可以是,例如，lmg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg 或 100mg/kg。剂量可能取决于例如疾病或病症的进行的类型和程度，具体患者的总体健康状况，所选择的化合物的相对生物效能，赋形剂的制剂以及其施用途径的变量。
[0092]有效剂量可以从来自于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推断。例如，经由外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子产生的体外分析可以分别对测定促炎性响应和抗炎性响应例如IL-1 β、IL-12、IL-4、TNF-α或IL-10的分泌有用的。也可分析组合物在动物模型中对例如IgA产生，经由派伊尔淋巴集结外植体的细胞因子产生以及树突状细胞和T细胞响应的作用。
[0093]鉴于各种细胞靶和各种施用途径的不同效率，所需剂量的巨大变化是可以预期的。如本领域公知的，在这些剂量水平的变化可以使用标准的实验程序调整以便优化。施用可以是单次或多次的(例如，2-或3-、4-、6-、8-、10-、20-、50-、100-、150-或更多倍)。合适的递送媒介物(例如聚合物微粒或植入装置)中化合物的封装可以提高递送效率。
[0094]用本文所提供的任一种组合物治疗的持续时间可以是时间从短至一天到长至宿主的生命周期(例如许多年)的任何时间长度。例如,组合物可以每周施用一次(例如,4周至多个月或多年)；每月一次(例如，三到十二个月或多年)，或每年一次为期5年、十年或更长的时间。还应当注意，治疗的频率是可变的。例如，本发明组合物可以每日、每周、每月或每年施用一次(或两次、三次等)。当将组合物配制成食品产品时，例如，所述组合物可以每天每餐施用。
[0095]任何本领域技术人员已知的方法都可以被用于确定特定的响应是否被诱导。可评估的特定疾病状态的程度的临床方法可以用来确定响应是否被诱导。例如，可以监测受治疗者的症状缓解，例如从绞痛、腹泻、便秘、恶心、呕吐、腹痛、痉挛、胃灼热、腹胀、胀气或失禁缓解。可选择地或另外地，血清标志物、成像技术例如超声、X射线和内窥镜方法都可以使用。
[0096]所述组合物也可与其他治疗模式组合施用。其他治疗方法将根据具体病症而变化，但可包括，例如抗腹泻药、止吐药、抗胆碱能剂、消炎剂、抗生素抗组胺和其他饮食治疗，例如低变应原婴幼儿配方奶粉。两种或多种治疗剂同时施用不需要的有待施用的剂同时或通过相同的途径施用，只要在药物发挥它们治疗作用器件在时间段上有重叠。同时或顺序施用是预期的，正如在不同天或周施用。
[0097]制造的物品
[0098]本文描述的组合物也可以连同使用说明书一起组装在套件中。因此，包装的产品(例如，包含本文所描述副干酪乳杆菌CBA L74组合物中的一个或多个并被包装以便以浓缩或随时可用的浓度储存、运输或销售的容器)和包括本发明的至少一种化合物和使用说明的试剂盒也在本发明的范围之内。在包装的产品或试剂盒中任一种中，副干酪乳杆菌CBAL74组合物可包括已经使得不复制的副干酪乳杆菌CBA L74。例如，所述试剂盒可包括测定量的营养组合物，其包括副干酪乳杆菌CBA L74发酵的一种或多种食物产品。使用说明可以通过任何合适的介质来传达。例如，它们可以以一种或多种语言印刷在纸插页上或者可听或可视地(例如，在光盘上)提供。包装材料可包括包装材料，例如小瓶、包、容器。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括测定量的组合物，其包括在生理上可接受的载体中的副干酪乳杆菌CBA L74以及包装材料和上述格式中任一种的使用说明。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括容器，其包含一种或多种副干酪乳杆菌CBA L74组合物，例如副干酪乳杆菌CBA L74和药用载体，以及适合的稳定剂、载体分子、调味剂和/或类似物中的一种或多种，如适于预期的用途的。产品可以包括含有一种或多种副干酪乳杆菌CBA L74组合物的容器(例如，小瓶、罐、瓶、袋或类似物)。此外，制造的物品可进一步包括，例如包装材料、使用说明书、注射器、缓冲剂或其他对照试剂，以便治疗或监测需要预防或治疗的病况。所述产品还可以包括图例(例如描述该产品的用途的印刷标签或插页或其他介质(例如音频或录像带))。图例可与容器相关联(例如，固定于容器)，并且可以描述其中的化合物应当被施用的方式(例如频率和施用途径)，其适应症和其它用途。所述试剂盒的组件可以适合于直接使用。所述化合物可以是随时施用的(例如，以适合剂量的单位存在)，并且可包括药学上可接受的佐剂、载体或其他稀释剂和/或其它治疗剂。然而，本发明包括试剂盒包括可能需要在使用前稀释的浓缩的制剂和/或材料。可选择地，所述化合物可以以浓缩的形式与稀释剂和稀释说明一起提供。所述试剂盒的组件可以适合于直接使用。然而，本发明包括试剂盒包括可能需要在使用前稀释的浓缩的制剂和/或材料。
实施例
[0099]实施例1:副干酪乳杆菌CBA-174的分离和表征
[0100]我们分析了乳杆菌不同菌株的发酵含有不同浓度的稻米粉或面粉的含水悬浮液的能力。基于低pH值和高CFU计数选出副干酪乳杆菌CBA L74进一步分析。所述菌株根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约于2008年9月9日保存在LAB0RAT0RIUMvoor Microbiologie (LMG)，Ghent, Belgium的比利时微生物协作保藏中心(BCCM)。由国际保存单位提供的保藏号为LMGP-24778。
[0101]实施例2:副干酪乳杆菌CBA L74发酵奶的制备
[0102]条件
[0103].底物9%重构的脱脂奶粉，以0.25%添加葡萄糖
[0104].底物加热处理:UHT - 135°C 3S或当量H)
[0105].共接种物:5X IO6的副干酪乳杆菌CBA-L74
[0106]5 X IO4 的嗜热链球菌(为发酵状态)(as starter of the fermentation)
[0107].发酵温度:37°C
[0108].发酵时间:15小时
[0109]?发酵期间的pH:未调节
[0110].发酵结束时用NaOH溶液将pH调节至6.5
[0111]?以190°C的进口温度和90°C的出口温度喷雾干燥。.[0112].分析:对发酵物细胞计数以确定嗜热链球菌和副干酪乳杆菌CBA-L74
[0113]铺板:乳酸杆菌选择性琼脂(LBS)被用于检测副干酪乳杆菌CBA-L74。L-M17琼脂用于嗜热链球菌计数。两者都于37°C厌氧。平板计数琼脂(PCA)被用于检测的污染物并在30°C需氧孵育。
[0114]发酵:副干酪乳杆菌CBA L74和嗜热链球菌1773共接种物作为新鲜培养物加入。进行发酵15小时至以108cfu/mL的副干酪乳杆菌CBA-L74浓度。初始pH为6.6。在发酵结束时的pH为5.1。pH通过加入2.5N NaOH调节至6.5。副干酪乳杆CB-74的初始浓度为5X106CFU/mL ;最终浓度高于108CFU/mL。嗜热链球菌的初始浓度为5X 104CFU/mL ;最终浓度为I X 108CFU/mL。接种之前以及在TO奶中PCA上最初的细菌计数为O而15小时发酵期后菌落太少而无法计数(TFTC)。为5X 104CFU/mL ;最终浓度为I X 108CFU/mL。
[0115]干燥:将发酵物以190°C的进口温度和90°C的出口温度干燥。喷雾干燥后粉末的含湿量为4.87%。
[0116]实施例3:副干酪乳杆菌CBA L74发酵的燕麦和大麦面粉的制备
[0117]我们用185克燕麦粉和9.25克大麦麦芽粉制备了 18.5% (w/vol)燕麦粉+5% (w/w)麦芽粉的一升溶液。用0.5M柠檬酸将面粉与水的混合物调节至pH4.00。在发酵罐通过高压灭菌灭菌。然后将面粉+水+柠檬酸的混合物加入到发酵罐中。[0118]将混合物在80°C加热处理30分钟，然后冷却至37°C。测试了三组不同的发酵条件。16小时后终止所有发酵，这一时间与对数期生长的结束一致。
[0119]试验# 1:将副干酪乳杆菌CBA L74加入到热处理过的谷物溶液至2.3X106CFU/ml的最终浓度并和在37°C下伴随搅拌孵育。16小时后MRS中计数板为7.6X 108UFC/ml(乳酸菌)，在PCA、MC和SB中测量到的污染物均低于1000UFC/ml。最终的pH为3.8。20小时后MRS中计数板为1.2X 108UFC/ml(乳酸菌);无污染物。24小时后MRS中计数板为5 X IO8UFC/ml (乳酸菌)；无污染物。因为16小时后对数生长期结束，因此优选在16小时停止发酵。
[0120]试验# 2 (pH值稳定化)通过用2N NaOH将pH保持在4进行这一发酵。将副干酪乳杆菌CBA L74加入到热处理过的谷物溶液至2.1 X 106CFU/ml的终浓度并在37°C伴随搅拌孵育。16小时后MRS中计数板为7.5X108UFC/ml (乳酸菌)，在PCA、MC和SB中测量到的污染物均低于1000UFC/ml。
[0121]试验# 3 (pH值稳定化)通过用2N NaOH将pH保持在4进行这一发酵。将副干酪乳杆菌CBA L74加入到热处理过的谷物溶液至5.1 X 106CFU/ml的终浓度并在37°C伴随搅拌孵育。16小时后MRS中计数板为2.1 X 109UFC/ml (乳酸菌)，在PCA、MC和SB中测量到的污染物均低于1000UFC/ml。.[0122]实施例4:副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米和小麦粉的制备
[0123]我们通过将150g稻米和900ml水混合制备15%重量/体积的稻米的一升溶液。在室温下制备混合物并通过在1000-1300rpm振荡数分钟混合。稻米混合物通过在70°C下加热仪器内部的混合物间歇灭菌，每20-30分钟在70°C饥饿，冷却至30-37°C，每20-30分钟在30-37 V饥饿，70 V加热，，每20-30分钟在70 V饥饿，在发酵温度(37°C )冷却同时以150-600rpm振荡来处理。
[0124]加入来自冷冻干燥样品的副干酪乳杆菌CBA L74至I X 106CFU/ml的终浓度。将冷冻干燥样品重悬于水中并在37°C短暂孵育以活化细菌。接种后将混合物通过在300-600rpm短暂振荡来均质化；发酵期间以150rpm振荡溶液。发酵反应在〈15%的p02于37°C进行24小时。在接种时间(T0)、16时(Τ16)、18小时(Τ18)、21小时(Τ21)和24小时(Τ24)收集等份试样.发酵后，谷物伴随连续搅拌加热至50°C。加热的谷物然后在T空气人口 80°C，T空气出口 210°C喷雾干燥。最终的含水率为6%。
[0125]在Rogosa琼脂(+万古霉素12微克/ml) (48小时于37°C )上分析样品的副干酪乳杆菌CBA-174定量，PCA上(24小时于37°C )的总需氧菌，McConkay琼脂上的大肠杆菌和RCM琼脂上的梭菌。
[0126]这一发酵的结果如下:
[0127]接种物(副干酪乳杆菌CBA-174):1 X IO6 (+/_l/21og) CFU/ml (在仪器上)发酵24小时后副干酪乳杆菌CBA L74浓度:1 X IO8 (+/-l/21og) CFU/ml
[0128]接种前PCA上的污染物:〈104CFU/ml
[0129]接种前McConkay 上的污染物:〈104CFU/ml
[0130]接种前RCM上的污染物:〈10CFU/ml
[0131]接种后上的污染物PCA:<104CFU/ml
[0132]发酵24小时后PCA上的污染物:〈104CFU/ml
[0133]加入接种物之前的pH:6 (+/-0.20)[0134]16-18 小时的 pH:3.70(+/-0.20)
[0135]24 小时的 pH: 3.60 (+/-Ο.20)。
[0136]实施例5:在CAC02细胞共培养系统中副干酪乳杆菌CBA对树突状细胞的影响L74
[0137]我们分析了肠上皮细胞(Caco2细胞)和人树突状细胞(DC)的共培养物中活的和不复制的副干酪乳杆菌CBA L74的作用。Caco2细胞接种于Transwell膜并且在约3周后，当跨膜电阻抗足够时，补充副干酪乳杆菌CBA L7496小时。人DC是从外周血单核细胞分化的并接种在共培养腔室的基底室中。实验过程中跨膜电阻抗保持不变。
[0138]为了表征DC表型，我们通过细胞荧光分析监测共刺激分子(⑶80和⑶86)、MHC-1I和粘附分子(⑶40)的DC细胞表面表达。为了确定与肠上皮细胞共培养的DC产生的细胞因子谱暴露于副干酪乳杆菌CBA L74，我们收集培养基并通过ELISA量化IL-1O和IL-12p70。为了验证暴露于副干酪乳杆菌CBA L74的Caco2细胞调节DC以促进T细胞增殖的能力，我们进行FACS分析并且混合淋巴细胞培养物。
[0139]如图1的表所示，将Caco2细胞与活的或失活的(热灭活)副干酪乳杆菌CBA L74孵育24小时改变共培养的树突状细胞的表型。此外副干酪乳杆菌CBA L74的存在调节DC表型中LPS介导的变化。
[0140]之后我们将从与用副干酪乳杆菌(活的或灭活的)处理的Caco2细胞共培养的DC释放的细胞因子定量。如图2a中所示，与暴露于活的或灭活的副干酪乳杆菌CBA L74的Caco2共培养的DC显示统计学上显著的IL-1O产生的增加。在没有LPS时，我们并没有观察到IL-12产生的显著增加(图2b)。然而，DC保留经由增强IL-12产生响应于LPS激发的能力，这表明暴露于副干酪乳杆菌CBA L74并没有影响DC响应于病原体的整体能力。
[0141]然后，我们进行了功能测定来验证暴露于在培养基或补充副干酪乳杆菌的培养基存在时培养的Caco2细胞的DC调节T细胞在混合淋巴细胞反应后增殖的能力的能力。如图3所示，我们没有观察到与CaCo2细胞共培养的DC在改变T细胞增殖的能力上的显著差
巳升。
[0142]综合来看，在体外数据表明，副干酪乳杆菌CBA L74，活的或者热失活的，影响肠道上皮细胞所产生的环境，其反过来调节其他免疫细胞例如DC的活性。总体情况表明,暴露于Caco2处理的培养基的DC降低活化标记的表达，产生抗炎细胞因子例如IL-10，同时保留通过增强IL-12产生响应于LPS的能力。
[0143]实施例6:副干酪乳杆菌CBA L74对整个肠粘膜中形态学，细胞因子的表达和先天性免疫性的影响
[0144]我们通过作为小鼠中的膳食补充施用副干酪乳杆菌CBA L74 (活的和热失活的)来检测体内影响。补充两周后，将动物处死并分析整个肠粘膜。
[0145]粘膜形态:我们进行石蜡包埋的回肠切片的苏木精和曙红染色。补充剂中无一对肠结构有显著作用或引起炎性细胞浸润。
[0146]细胞因子和IgA的表达:之后我们确定副干酪乳杆菌CBA L74 (活的或失活的)的施用是否会影响肠粘膜中抗炎性细胞和促炎性细胞因子的水平。如图4所示，活的或失活的副干酪乳杆菌CBA L74的施用显著降低小鼠肠粘膜中IL-1 β，一种强效的促炎介质，的水平。正如图5所示，我们还观察到施用活的或失活的副干酪乳杆菌CBA L74之后基底粘膜IL-4水平的减少。最后，我们确定了不同方案的补充对粘膜IgA水平的影响。饮食补充副干酪乳杆菌CBA L74两周后，处死动物并收集和匀浆化肠粘膜。然后通过ELISA测量总IgA并将值对总粘膜蛋白标准化。如图6中所示，加热杀死的副干酪乳杆菌CBA L74显著增加粘膜 IgA。
[0147]先天免疫:我们分析了饮食补充对Toll样受体2、4和9水平的影响。这些受体参与识别保守的细菌结构并因此在调节免疫和非免疫细胞对微生物保守结构的反应性中起到关键作用。如图7所示，饮食补充活的或热失活的副干酪乳杆菌CBA L74增加TLR2和TLR4的蛋白表达水平。我们也测定了饮食补充对粘膜中PPARy水平的影响。如图8所示，活的副干酪乳杆菌CBA L74显著增加PPAR Y的水平。
[0148]实施例7:副干酪乳杆菌CBA L74对循环细胞因子水平的影响
[0149]为了测定饮食补充是否能改变循环细胞因子的水平，我们测量所述菌株(活的或失活的)的饮食施用对血清中抗炎细胞因子和促炎细胞因子水平的影响。如图9A和9b所示，活的副干酪乳杆菌CBA L74分别诱导IL-1 β统计学上显著的减少和循环IL-4的适度增加。
[0150]实施例8:副干酪乳杆菌CBA L74对树突状细胞和T淋巴细胞活性的影响
[0151]接下来，我们专注饮食补充副干酪乳杆菌CBA L74对与粘膜相关免疫系统的活性有关的免疫细胞，即树突状细胞和淋巴细胞，的影响。我们评估了派伊尔淋巴集结(PP)中DC的表型，因为这些细胞在确立抗原命运上有帮助并有助于将决定适应性免疫应答的性质的环境。
[0152]如图10中的表所示，副干酪乳杆菌CBAL74补充剂(活的或失活的)降低了共刺激分子CD80和粘附分子CD40的表达而MHCII表达上调，这些数据显示来自补充副干酪乳杆菌CBA L74的动物的DC似乎并未准备好与T细胞相互作用并发动免疫反应，但它们加工和呈递抗原的能力被保留。
[0153]之后，我们确定饮食补充副干酪乳杆菌CBA L74改变DC对促炎刺激(例如细菌LPS和CpG)的反应性的能力。来自对照小鼠的DC对LPS或CpG的暴露在对照DC中诱导⑶80的强烈上调。补充热失活副干酪乳杆菌CBA L74没有改变DC对炎症刺激的反应性。补充活细菌显著降低LPS和CpG诱导的⑶80上调。
[0154]最后，我们研究饮食补充副干酪乳杆菌CBA L74 (活的或失活的)是否影响肠道T-淋巴细胞(⑶4+和⑶8+)朝Thl或Th2表型的极化。为了这些研究，将派伊尔淋巴集结暴露于PHA，一种强的非特异性刺激物，并且之后通过对IL-4和IFN- Y的内部因子(intrakine)染色评价淋巴细胞极化。如图1la所示，⑶4+淋巴细胞中不存在PHA (“基础条件”)时，IL-4和IFN几乎处于平衡状态。约10-12%的细胞对于这些细胞因子是阳性的。如图1lb所示，对于基础条件下的⑶8+淋巴细胞，IL-4对IFN表达细胞有轻微优势。⑶4+或⑶8+淋巴细胞暴露于PHA导致偏向IFN- Y产生的IL-4和IFN- Y的细胞内染色的强劲增加。
[0155]在⑶4+细胞中，饮食补充活的副干酪乳杆菌CBA L74增加基础条件的IFN- Y水平。PHA暴露之后，补充的组中无响应上的显著差异(图11a)。在⑶8+淋巴细胞中，口服补充失活的副干酪乳杆菌CBA L74有利于IL-4产生超过IFN- Y产生的Th2概况(图1lb)抗炎概况进一步得到对PHA的迟钝响应的支持。类似的趋势在从补充活的副干酪乳杆菌CBA-L74的小鼠中分离的⑶8+淋巴细胞中也是明显的，虽然不是显著的。[0156]实施例9:通过副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶对肠粘膜中免疫系统标志物的影响
[0157]小鼠每日两次补充下列之一两周:1)对照(PBS) ;2)脱脂奶(未发酵的)；3)用副干酪乳杆菌CBA L74 (lX108cfu/ml)发酵的脱脂奶；4)用嗜热链球菌(6.7xl06cfu/ml)发酵的脱脂奶；5)用副干酪乳杆菌CBAL74 (lX108cfu/ml)和嗜热链球菌(1.18xl07cfu/ml)发酵的脱脂奶；6)用副干酪乳杆菌CBA L74 (1.9X 108cfu/ml)和嗜热链球菌(2.2xl08cfu/ml)发酵的脱脂奶。在处理结束时处死动物并收集和加工肠粘膜和派伊尔淋巴集结以便如下所述进行分析。
[0158]肠粘膜中的细胞因子水平。如图12所示，补充副干酪乳杆菌CBA L74发酵的脱脂奶导致肠粘膜中显著增加的IL-10水平。施用嗜热链球菌发酵的脱脂奶诱导与对照相比轻微的减少。以较高剂量施用两种菌株发酵的奶诱导粘膜IL-10的2.1倍的增加。没有处理对粘膜IL-1 β有任何显著作用，尽管补充副干酪乳杆菌CBA L74发酵的脱脂奶引导致这一细胞因子粘膜水平的轻微增加。
[0159]肠粘膜中髓过氧化物酶活性。测定肠粘膜组织匀浆中的髓过氧化物酶(MPO)活性。施用未发酵的或用不同的细菌发酵的奶没有诱导髓过氧化物酶活性的统计学上显著的差异，尽管在接受非发酵奶的动物的粘膜中观察到MPO活性轻微增加。
[0160]肠粘膜中的IgA水平。如图14所示，补充未发酵脱脂奶导致肠粘膜IgA的显著增力口。补充用副干酪乳杆菌CBA L74或嗜热链球菌单独发酵的脱脂奶的动物中没有观察到这一增加。以较高剂量施用两种菌株发酵的奶诱导粘膜IgA的增加。
[0161]肠粘腊中TLR2、TLR4、TLR9和PPAR Y的水平。梓下来我们通i寸免疮印迹(TO)确定先天免疫系统的关键受体的粘膜水平。如图15所示，没有一种处理对TLR4受体表达有任何显著影响。未发酵的奶引起TLR2的适度增加。以较低剂量施用副干酪乳杆菌CBA L74或嗜热链球菌单独或组合发酵的脱脂奶的防止这种作用。与单独的奶相比，TLR2的适度增长在以较高剂量接受两种菌株发酵的奶的小鼠中也是明显的。施用仅脱脂奶对TLR9水平产生很大影响，而施用两种菌株发酵的奶与对照相比重新确立粘膜水平。如图15所示，施用未发酵的奶本身导致粘膜PPARy的强劲增长，类似的作用在补充副干酪乳杆菌CBAL74发酵的脱脂奶和低剂量的两种菌株发酵的奶的小鼠中是明显的。
[0162]肠粘膜中PNF-K B和IKB的水平。我们测定NF-K B，参与肠道炎症和上皮细胞存活两者的一种关键转录因子，的活化状态。如图16所示，在对照，正常粘膜，中活化的NF-K B(pNF-κΒ)是可检测的。不同的处理后，我们仅观察到pNF-κ B的水平在用副干酪乳杆菌CBA L74或嗜热链球菌单独发酵的脱脂奶处理的小鼠的粘膜中轻微增加，而在接受用两种菌株发酵的脱脂奶的小鼠中，PNF-K B与对照相当。pNF-κ B的增加与在补充用副干酪乳杆菌CBA L74或嗜热链球菌单独发酵的脱脂奶的小鼠的粘膜中是不可检测的NF-κ B的抑制性亚基，IKB，的消失平行。接受用两种菌株发酵的脱脂奶的小鼠表现出与对照相当的IKB水平。
[0163]实施例10:用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶对肠粘膜中树突状细胞表型的影响
[0164]树突状细胞的表型是从派伊尔淋巴集结提取的。我们研究了饮食补充对肠道DC表型的影响。这一分析的结果示于图17。于对照小鼠相比以较低和较高剂量施用用副干酪乳杆菌单独以及副干酪乳杆菌和嗜热链球菌发酵的奶产生统计学上显著的CD80和CD86表达的减少(*表示P〈0.05对比对照组)，而HLAII和⑶40水平总体保持稳定。图17中的数据表示为三个独立实验的平均值土标准偏差。
[0165]暴露于LPS/CpG的树突状细胞的响应。我们测定饮食补充改变DC对促炎刺激(例如细菌LPS和CpG)的反应性的能力。如图18所示，分离自对照动物的分离的DC暴露于LPS和CpG导致⑶80表达显著增加(*表示P〈0.05对比来自对照小鼠的未刺激的DC)。在从接收用未发酵的奶处理的小鼠纯化的DC中观察到的类似的作用(°表示P〈0.05对比来自用未发酵的奶处理的小鼠的未刺激的DC)。施用用副干酪乳杆菌CBA L74单独发酵的脱脂奶完全阻止了未发酵的奶处理的小鼠中LPS介导的作用，但是它对CpG诱导的⑶80表达上调不太有效。用嗜热链球菌单独发酵的脱脂奶阻止LPS和CpG的作用，并减少⑶80表达。最后，施用用两种菌株发酵的脱脂奶抑制LPS和CpG诱导的CD80上调和将CD80表达维持在基底水平。在图18中的数据表示为三个独立实验的平均值土标准偏差。
[0166]实施例11:用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶对肠粘膜中T淋巴细胞表型的作用
[0167]暴露于PHA的肠道淋巴细胞⑶4+e⑶8+的反应。我们想知道饮食补充奶(发酵或不发酵的)是否会影响肠道T淋巴细胞(⑶4+和⑶8+)朝向Thl或Th2表型的极化。派伊尔淋巴集结来源的淋巴细胞暴露于PHA，然后通过细胞内IL-4和IFN-Y的染色评价淋巴细胞极化。
[0168]如图19中所示，暴露于PHA显著增加来自对照小鼠的⑶4+淋巴细胞中IL_4和IFNy的产生(*表示P〈0.05，对比来自对照小鼠的未刺激的淋巴细胞)。这种诱导在用未发酵或发酵的奶处理的小鼠中均未观察到。补充未发酵的奶之后，与对照动物相比CD4+淋巴细胞显示IL4和IFN-Y的提高的基础水平(°表示P〈0.05，对比来自对照小鼠的未刺激的淋巴细胞)。这些数据表明，补充发酵的奶阻止非特异性活化并且将IL4和IFN-Y产生保持在基础水平。
[0169]如图20中所示，来自对照小鼠的⑶8+肠道淋巴细胞中暴露于PHA增加IL4和IFNy的产量(*表示P〈0.05，对比来自对照小鼠的未刺激的淋巴细胞)。这种诱导在用未发酵或发酵的奶处理的小鼠中均未观察到。以较高剂量施用副干酪乳杆菌和嗜热链球菌发酵的奶减少了基本的IL4产生，然而用PHA刺激后，IL4和IFNy的水平与来自对照小鼠的刺激的淋巴细胞相比减少(§表示P〈0.05)实施例12:用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶对肠粘膜组织学的影响
[0170]为了确定肠粘膜中增殖细胞的分布，我们进行了 Ki67，分裂中细胞表达的一种抗原，的免疫组化分析。在对照组小鼠中，小肠隐窝有清楚的免疫反应而在绒毛上无染色。在接收未发酵的奶的老鼠组织中，在隐窝有较强的表达，但是没有抗原的异位表达小鼠组织。在接收不同类型的发酵奶的老鼠组织中，我们观察到类似的染色模式。我们已经进行了不同的实验组的回肠粘膜的组织学评价。本研究的结果示于图21。施用未发酵的奶减少了小肠绒毛的数目和长度，然而肠形态在接收的各种形式的发酵奶的动物中被保持。
[0171]实施例13:副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米对肠粘膜免疫系统中的标志物影响
[0172]设计这些实验以评估副干酪乳杆菌CBA-L74发酵的谷物的免疫调节特性。研究包括每日胃内施用下列两周:1)未发酵的稻米；2)发酵的稻米(用副干酪乳杆菌CBA L74)IOOmg每天(相当于2X IO8CfVL的副干酪乳杆菌CBA-L74);和3)发酵的稻米(用副干酪乳杆菌CBA L74)500mg每天(相应于109cfu/L的副干酪乳杆菌CBA-L74)。处理期间小鼠没有表现生病或腹泻的任何迹象。在处理结束时处死小鼠并无菌收集派伊尔淋巴集结(PP)。通过在无Ca2+加EDTA的HBSS中孵育从PP移除上皮细胞并且之后组织经受酶消化。清洗单细胞悬浮液、重悬于冷的RMPI并用于以下试验。
[0173]我们最初检查不同饮食补充对整个肠道粘膜的效果。首先，我们进行石蜡包埋回肠切片的苏木精和曙红染色。所使用的饮食补充中没有一种对肠道结构有显著作用或引起炎症细胞浸润。
[0174]之后，我们测定施用副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米是否会影响肠道粘膜中抗炎性细胞因子和促炎性细胞因子的水平。如图22所示，施用稻米或发酵的稻米都增加粘膜IL-1 β和IL-4。以最高剂量补充发酵的稻米导致IL-10减少，如图23中所示。
[0175]之后，我们测定不同处理方案的补充对粘膜IgA水平的影响。两个星期的饮食补充后，处死动物并收集和匀浆化肠粘膜。总IgA用ELISA测量并且将值对总粘膜蛋白标准化。没有一种补充对粘膜IgA具有显著作用。
[0176]我们分析了稻米或副干酪乳杆菌CBAL74发酵的稻米对肠粘膜先天免疫性的影响。如图24所示，饮食补充稻米和发酵的稻米(低剂量)对粘膜TLR仅有温和的影响。如图25a所示，饮食补充未发酵的稻米急剧增加粘膜PPAR Y水平。高剂量的发酵稻米也增加粘膜PPARy水平。如图25b中所示，两个星期饮食补充未发酵的稻米在粘膜中减少NF-κ B活化并增加IKB。低剂量补充发酵的稻米与对照相比无效果，而较高剂量有与用未发酵的稻米所观察到的那些相当的效果。
[0177]我们还测量了饮食施用对血清中抗炎细胞因子和促炎细胞因子水平的影响。饮食补充稻米或发酵的稻米(低剂量)对血清IL-1 β和IL-4水平无影响。实施例14:副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米对肠粘膜中树突状细胞表型的影响
[0178]接下来，我们专注饮食补充未发酵的稻米或副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米对与粘膜相关免疫系统的活性有关的免疫细胞，即树突状细胞和淋巴细胞，的影响。首先，我们用抗⑶I (识别DC)以及用抗⑶-80和⑶-86、MHC-1I和⑶-40标记单细胞悬浮液以确定在这些淋巴器官中肠道DC的活性和成熟度水平。如图26中的表所示，我们观察到高剂量发酵的稻米对DC表型的显著作用。补充未发酵的稻米(在这些实验中，我们使用两种不同剂量)没有任何影响，而发酵的稻米对CD80、CD40和MHC-1I水平的影响在IOOmg/天是很明显的，并且在500mg/天更明显。
[0179]我们接下来确定饮食补充稻米或副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米改变DC对促炎刺激(如细菌LPS和CpG)的反应性的能力。如图27中的表所示，来自对照小鼠的DC对LPS或CpG的暴露诱导对照DC的CD80上调。补充未发酵的稻米没有改变对炎症刺激的反应性。补充测试剂量的发酵的稻米减少LPS和CpG诱导的CD80上调。
[0180]实施例15:副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米对在肠粘膜T淋巴细胞表型的影响
[0181]我们研究了饮食补充稻米或副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米是否能够影响肠道T淋巴细胞(无论是⑶4+和⑶8+)朝向Thl或Th2表型的极化。来自派伊尔淋巴集结的淋巴细胞暴露于PHA并且之后通过IL-4和IFN- Y的内部因子染色来评价淋巴细胞极化。
[0182]⑶4+和⑶8+淋巴细胞这一实验的结果分别示于图28和2。如图28所示，在基础条件下，在⑶4+淋巴细胞中IL-4和IFNy因为约10-12%的细胞对这些细胞因子是阳性的而几乎处于平衡。如图29所示，⑶8+中，在基础条件下IL-4有轻微超过IFNy表达细胞。⑶4+或⑶8+淋巴细胞暴露于PHA导致IL-4和IFN Y的细胞内染色的强劲增长，IFN Y的产生占优势。
[0183]在接受未发酵的稻米的小鼠中在基础条件和对CD4+和CD8+淋巴细胞两者的PHA刺激之后，我们观察到占优势的IL-4产生(Th2表型)。然而，IL-4产生与基础条件下IFNy产生的持续性相关，并且PHA刺激之后我们观察到虽然与对照细胞相比响应是迟钝的但这一细胞因子的表达增加了。在基础条件下接受发酵的稻米的小鼠中观察到IFNy阳性细胞超过IL-4的优势，虽然在基础条件下与对照组相比百分比是相当的(对⑶4+)或稍有降低的(对于⑶8+)。PHA刺激之后，在这两种细胞群中细胞因子响应与对照小鼠相比迟钝，但是针对Thl表型(IFNy阳性细胞占优势)。
[0184]实施例16:鼠伤寒沙门氏菌存在时副干酪乳杆菌CBA L74对单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)中IL-1O产生的影响
[0185]我们测试了副干酪乳杆菌CBA L74细胞和副干酪乳杆菌CBA L74细胞上清液两者在细菌病原体鼠伤寒沙门氏菌存在时诱导人类MoDC中促炎性细胞因子IL-1O产生的能力。人类MoDC从至少4个供体，并且在某些情况下，7个供体得到。如图30所示，鼠伤寒沙门氏菌(“FB62”)，对照乳杆菌副干酪乳杆菌21060 (“B21060”)和副干酪乳杆菌CBA L74 (“CBAL74”)细胞中都诱导IL-1O产生。相反，尽管鼠伤寒沙门氏菌上清液(“sn fb62”)诱导IL-1O产生，但来自两种乳杆菌，乳杆菌菌株副干酪乳杆菌21060 (“snb21060”)和副干酪乳杆菌CBA L74 (“sn cbal74”)的上清液并没有。副干酪乳杆菌CBA L74上清液与鼠伤寒沙门氏菌的共培养(“sn cbal74+FB62”)诱导IL-1O至超过并且在单独使用与鼠伤寒沙门氏菌(“snfb62+FB62”)时看到的水平之上。有趣的是，即使MoDC预先用副干酪乳杆菌CBA L74上清液处理仅一小时并且之后清洗以除去上清液，(“lh sn cbal74+FB62”)，还是观察到了类似的影响。
[0186]实施例17:鼠伤寒沙门氏菌存在时副干酪乳杆菌CBA L74对单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)中IL-12p70产生的影响
[0187]我们测试了副干酪乳杆菌CBA L74细胞和副干酪乳杆菌CBA L74细胞上清液两者在细菌病原体鼠伤寒沙门氏菌存在时诱导人类MoDC中促炎性细胞因子IL-12p70产生的能力。人类MoDC从至少4个供体，并且在某些情况下，7个供体得到。实验的结果示于图31。与实施例16中所获得的结果相反，我们发现，鼠伤寒沙门氏菌(“FB62”)诱导高水平的抗炎细胞因子IL-12p70而对照的乳杆菌菌株副干酪乳杆菌21060 (“B21060”)和副干酪乳杆菌CBA L74 (“CBA L74”)细胞只诱导低水平的IL_12p70。此时再次，鼠伤寒沙门氏菌上清液(“sn fb62”)诱导IL-12p70的产生，而乳杆菌菌株副干酪乳杆菌21060 (“sn b21060”)和副干酪乳杆菌CBA L74 (“sn cbal74”)上清液并没有。副干酪乳杆菌CBA L74上清液与鼠伤寒沙门氏菌的共培养(“sn cbal74+FB62”)引起了 IL_12p70产生的显著减少。即使MoDC都预先用副干酪乳杆菌CBA L74上清液处理仅一小时并且之后清洗以除去上清液(“Ih sncbal74+FB62”)，也观察到所述影响。这一减少超过了用对照乳酸杆菌副干酪乳杆菌21060(“lh sn b21060+FB62”)所观察到的。这些数据表明，副干酪乳杆菌CBA L74和副干酪乳杆菌CBA L74的培养上清液两者都具有能减轻细菌病原体鼠伤寒沙门氏菌诱导的炎症抗炎的特性。
[0188]实施例18:鼠伤寒沙门氏菌存在时副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶对单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)中IL-1O产生的影响[0189]我们测试了细菌病原体鼠伤寒沙门氏菌存在时副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶诱导人类MoDC中抗炎细胞因子IL-10产生的能力。实验的结果示于图32。虽然未活化的MoDC通常不产生IL-10，但我们发现用副干酪乳杆菌CBA L74-发酵的奶孵育的MoDC剂量依赖性诱导 IL-1O 的产生(参见“基质 CBAL741.41gr/100ml” 和“基质 CBAL740.14gr/100ml “)。即使在鼠伤寒沙门氏菌存在时该性能也被保留(参见“基质CBAL741.41gr/100ml+FB62”和“基质 CBAL740.14gr/100ml+FB62”)。
[0190]图32还显示，副干酪乳杆菌CBA L74已被热激活(“6.3 X IO6CFU CBA74煮沸的”)、多聚甲醛处理激活(“6.3 X IO6CFU CBA74PFA”)或冻融激活(“6.3 X IO6CFU CBA74F & AMPT‘ )但保留诱导IL-1O的能力。
[0191]当我们观察了副干酪乳杆菌CBA L74的培养基，副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶导致鼠伤寒沙门氏菌诱导的IL_12p70产生的显著的剂量依赖性的减少。(图33)。鼠伤寒沙门氏菌存在时嗜热链球菌发酵的奶导致IL-12p70产生的增加。然而，副干酪乳杆菌CBA L74发酵的奶没有刺激IL-12p70的产生，与副干酪乳杆菌CBA L74的抗炎特性相符合。这些数据表明副干酪乳杆菌CBA L74保留了抗炎特性，即使在更促炎性物质存在时。
[0192]实施例19:坂崎肠杆菌存在时副干酪乳杆菌CBA的L74细胞上清液对单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)中IL-1O和IL12p70的产生的影响
[0193]我们测试了在细菌病原体坂崎肠杆菌存在时副干酪乳杆菌CBA L74细胞上清液诱导人类MoDC中抗炎细胞因子IL-1O和促炎细胞因子IL-12p70产生的能力。我们测试了两株坂崎肠杆菌，N9和N13。坂崎肠杆菌诱导了人类MoDC中IL-1O和IL_12p70两者的产生。加入副干酪乳杆菌CBA L74细胞上清液导致IL-1O的增加和IL_12p70的显著下降。
[0194]实施例20:鼠伤寒沙门氏菌存在时副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米对组织外植体模型中的细胞因子产生的影响
[0195]小鼠肠上皮用作建立Abud (实验细胞研究。303:252-262 (2005))中所述三维共培养体系。组织外植体在100%02的存在下以及一个大气压的压力下培养24小时，较低腔室包含Iml hEC DMEM加上ITS-X和EGF。较高腔室含有200ml培养基加上鼠伤寒沙门菌、副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻米或鼠伤寒沙门菌和副干酪乳杆菌CBA L74的组合发酵的稻米。收获上清并通过ELISA检测IL-1 β，TNF-α和IL-1O的水平。如图33所示，鼠伤寒沙门菌存在时加入发酵的稻米显著降低了促炎性细胞因子，IL-1 β和TNF-α的产生，与对抗炎细胞因子IL-1O的水平只有温和影响。
[0196]但是应当理解，本发明并不仅限于本文所公开和附图中所显示的特定结构，而是也包括在权利要求的范围内的任何修改或等同物。
【权利要求】
1.一种包含发酵食物产品的组合物，其中所述食物产品已经被益生菌细菌，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) CBA L74,国际保藏号 LMG P - 24778,所发酵。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述食物产品是乳制品或谷物产品。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述乳制品是牛奶、酸奶、凝乳、奶酪或婴儿配方。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述谷物产品是稻米、小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、高粱、小米或黑小麦。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述食物产品是干燥的。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述干燥的食物产品被再水合。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述干燥的、再水合的食物产品是免疫调节性的。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述益生菌细菌不复制。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述食物产品包含约lX102cfu/g至约I X 1012cfu/g益生菌细菌每克干重。
10.一种包含益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P - 24778，和生理学上可接受的载体的组合物。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述生理学上可接受的载体是食物产品。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述食物产品是乳制品或谷物产品。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述乳制品是牛奶、酸奶、凝乳、奶酪或婴儿配方。
14.如权利要求12所述的组合物，其中所述谷物产品是稻米、小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、高粱、小米或黑小麦。
15.如权利要求10-14中任一项所述的组合物，其中所述食物产品是干燥的。
16.如权利要求10-15中任一项所述的组合物，其中所述干燥的食物产品被再水合。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述干燥的、再水合的食物产品是免疫调节性的。
18.如权利要求10-17中任一项所述的组合物，其中所述益生菌细菌不复制。
19.如权利要求10-18中任一项所述的组合物，其中所述食物产品包含约lX102cfu/g至约I X 1012cfu/g益生菌细菌每克干重。
20.如权利要求10所述的组合物，其中所述生理学上可接受的载体是药学上可接受的载体。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括基于脂质或基于聚合物的胶体。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述胶体是脂质体、水凝胶、微粒、毫微粒或嵌段共聚物胶束。
23.如权利要求21所述的组合物，其中所述基于聚合物的胶体是胶囊。
24.如权利要求20-23中任一项所述的组合物，其中所述益生菌细菌不复制。
25.如权利要求20-24中任一项所述的组合物，其中所述益生菌细菌是约IX 102cfu/g至约I X 1012cfu/g干重的单位剂型。
26.如权利要求20-25中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于口服施用。
27.一种制造营养组合物的方法，所述方法包括:a)提供食物广品； b)将所述食物产品与 有效量的益生菌，副干酪乳杆菌CBAL74，国际保藏号为LMGP - 24778，以及任选的共接种物组合以形成混合物； c)将所述混合物在足以发生发酵的温度和时间孵育。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述食物产品是乳制品或谷物产品。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述益生菌细菌的量为约IX106cfu/ml至约 5 X 106cfu/ml。
30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述共接种物是嗜热链球菌。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述共接种物的量为约lX104cfu/ml至约I X 105cfu/ml。
32.如权利要求27-31中任一项所述的方法，其中所述孵育步骤持续直到所述混合物中益生菌细菌的水平达到约lX108cfu/ml至约I X 101Qcfu/ml。
33.如权利要求27-32中任一项所述的方法，其还包括干燥所述营养组合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述干燥步骤是喷雾干燥。
35.如权利要求27-34中任一项所述的方法,其中所述营养组合物与一种或多种另外的食物组合。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述另外的食物产品包含乳制品、谷物产品、基于蔬菜的广品、基于水果的广品或基于蛋白的广品。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述基于水果的产品包括番茄产品。
38.一种调节受试者中免疫系统的方法，所述方法包括: a)鉴定需要免疫系统调节的受试者； b)施用有效量的包含食物产品的组合物，其中所述食物产品已经被益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P-24778，所发酵。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述食物产品包括如权利要求1-19中任一项所述的食物产品。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中所述受试者是人类婴儿。
41.一种治疗有发展胃肠道病症的风险的受试者的方法，所述方法包括: a)鉴定有发展胃肠道病症的风险的受试者； b)施用有效量的包含食物产品的组合物，其中所述食物产品已经由益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P-24778，所发酵。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述食物产品包括如权利要求1-19中任一项所述的食物产品。
43.如权利要求41所述的方法，其中所述胃肠道病症是粘膜免疫系统缺陷、食物变态反应、腹泻相关疾病、细菌或病毒感染、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩病、乳糜泻或坏死性小肠结肠炎。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述粘膜免疫系统缺陷是不成熟的免疫系统。
45.如权利要求41-44中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类婴儿。
46.一种治疗患有胃肠道病症的受试者的方法，所述方法包括: a)鉴定患有胃肠道病症的受试者；b)施用有效量的包含食物产品的组合物，其中所述食物产品已经被益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P-24778，所发酵。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述食物产品包括如权利要求1-19中任一项所述的食物产品。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述胃肠道病症是粘膜免疫系统缺陷、食物变态反应、腹泻相关疾病、细菌或病毒感染、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩病、乳糜泻或坏死性小肠结肠炎。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述粘膜免疫系统缺陷是不成熟的免疫系统。
50.如权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类婴儿。
51.一种治疗患有胃肠道病症的受试者的方法，所述方法包括: a)鉴定患有胃肠道病症的受试者； b)施用有效量的药物组合物，其包含益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBAL74，国际保藏号LMGP-24778。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述药物组合物包括如权利要求20-26中任一项所述的组合物。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述胃肠道病症是粘膜免疫系统缺陷、食物变态反应、腹泻相关疾病、细菌或病毒感染、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩病、乳糜泻或坏死性小肠结肠炎。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述粘膜免疫系统缺陷是不成熟的免疫系统。
55.如权利要求51-54中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类婴儿。
56.益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBAL74，国际保藏号LMG P-24778，在用于治疗胃肠道病症的食物产品的制备中的用途。
57.如权利要求56所述的用途，其中所述食物产品包括如权利要求1-19中任一项所述的食物产品。
58.如权利要求56或57所述的用途，其中所述胃肠道病症是粘膜免疫系统缺陷、食物变态反应、腹泻相关疾病、细菌或病毒感染、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩病、乳糜泻或坏死性小肠结肠炎。
59.如权利要求58所述的用途，其中所述粘膜免疫系统缺陷是不成熟的免疫系统。
60.如权利要求56-59中任一项所述的用途，其中所述受试者是人类婴儿。
61.益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBAL74，国际保藏号LMG P-24778，在用于治疗胃肠道病症的药物的制备中的用途。
62.如权利要求61所述的用途，其中所述药物组合物包括如权利要求20-26中任一项所述的组合物。
63.如权利要求61所述的用途，其中所述胃肠道病症是粘膜免疫系统缺陷、食物变态反应、腹泻相关疾病、细菌或病毒感染、肠易激综合征、炎性肠病、克罗恩病、乳糜泻或坏死性小肠结肠炎。
64.如权利要求63所述的用途，其中所述粘膜免疫系统缺陷是不成熟的免疫系统。
65.如权利要求61-64中任一项所述的用途,其中所述受试者是人类婴儿。
66.通过如权利要求27-37中任一项所述的方法制得的营养组合物。
67.一种试剂盒，其包含测定量的包含发酵的食物产品的营养组合物和选自由包装材料、包括使用说明的包装插页、无菌流体和无菌容器组成的组的一项或多项，其中所述食物产品已经被益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P-24778，所发酵。
68.一种试剂盒，其包含测定量的包含益生菌细菌，副干酪乳杆菌CBA L74，国际保藏号LMG P-24778，的药物组合物和选自由包装材料、包括使用说明的包装插页、无菌流体和无菌容器组成的组的一项或 多项。
【文档编号】A23C9/123GK103997899SQ201280040658
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年6月18日 优先权日:2011年6月20日
【发明者】安德烈亚·布代利, 弗兰切斯卡·罗曼娜·法桑诺, 米利亚姆·泰尔扎诺, 洛伦佐·布拉马蒂 申请人:H.J.亨氏公司