解木聚糖拟杆菌物种微生物的制作方法

解木聚糖拟杆菌物种微生物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含解木聚糖拟杆菌物种微生物的食品，尤其发酵食品和益生食品。这些微生物特别地特征为对于人类消费具有十分低的致病性和高度安全性。另外，提供了用于产生、尤其通过发酵产生所述食品的方法，以及合适的解木聚糖拟杆菌细菌菌株。
【专利说明】解木聚糖拟杆菌物种微生物
发明领域
[0001]本发明涉及包含微生物的食品。具体而言，提供包含解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)物种微生物的食品。另外，本发明提供这些微生物在发酵中的用途。
[0002]发明背景
[0003]含有细菌作为有机组成部分或生产助剂的食品是本领域长久已知的。具体而言，酸性发酵的发酵食品，例如酸奶，干酪，生香肠和蔬菜，是我们营养的有机组成部分。多种方法用于产生发酵食品，其中例如利用自发性发酵使用或专门添加微生物添加至食品原料。当前的发酵方法特别地基于添加起子培养物至相应的食品原料(例如乳，以产生酸奶或干酪)。与传统的生产过程对比，起子培养物提供多种益处。例如，经济损失因缺陷性生产更少和缩短生产过程而防止。另外，原料通常可以反应得更好。还由于可以利用各种起子培养物的混合物，所以就味道、安全性和均质性而言，结果经常更好。可以产生在生产过程中不定向干预情况下否则将是不可能的产品。
[0004]开发和改善已知发酵过程的一个基本目标是形成并选择用于发酵过程的适宜微生物，因为它们决定性地影响发酵过程。所用微生物的代谢活性决定了例如成品的香味、酸化程度和/或颜色。另外，当积极地影响健康状况或代谢时，微生物对营养领域具有巨大的潜力。积极影响顾客健康的发酵食品的一个已知例子涉及益生食品。益生菌是以足够量消费时对顾客具有促进健康影响的活微生物制备物。益生性乳酸细菌使用得最长久，不过也使用酵母和其他物种。
[0005]如今使用的大部分益生菌株属于乳杆菌属(Lactobacillus)或双歧杆菌属(Bifidobacterium),仅少数属于其他属如肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)或链球菌属(Streptococcus)。主要原因在于乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)常存在于发酵食品中并因此通常视为对人类安全。在人类中使用非传统物种的建议总体上激起关于潜在不利作用的更大忧虑。因此，当前的益生菌株主要因而其主流接受性而选择一 一个排除健康特性好得多的潜在菌株的选择过程。
[0006]例如，占据人结肠小生物群20%到至多40%的拟杆菌属微生物通常不用于发酵或用作益生菌株。这是令人惊讶的，因为已知某些拟杆菌属物种(Bacteroides sp.)拥有有益于人类健康的许多功能。拟杆菌拥有参与糖发酵、含氮物质利用和胆酸和其他类固醇生物转化的独特代谢活性。另外，已经显示拟杆菌含有具备免疫调节作用并强烈参与宿主免疫系统发育及维持其对抗病原体和疾病的能力的某些多糖抗原。
[0007]然而，一些拟杆菌菌株可能参与在特定条件下严重肠外感染的形成。因此，一些菌株被划归为条件致病菌并且可以遭致一些安全顾虑。例如，卵形拟杆菌(Bacteroides ovartus)微生物未被划入最低安全性微生物类别中并且因此具有潜在致病风险。
[0008]鉴于此，本发明的一个目的是包含满足高度安全标准的微生物并且因此可以安全用于人类消费的食品。具体而言，一个目的是涉及益生食品。
[0009]发明简述
[0010]本发明人已经发现可以有利地使用解木聚糖拟杆菌物种微生物作为食品、尤其发酵食品和益生食品中的食品添加剂或食品成分。含有解木聚糖拟杆菌物种微生物的食品具有以有活力形式或以无活力形式使用的所述微生物提供的多种有利特性。具体而言，这些微生物具有十分低的致病性并且因此对于人类消费是高度安全的，并且产生有利的短链脂肪酸。
[0011]解木聚糖拟杆菌是由Chassard等人首次描述的拟杆菌属新物种(“Bacteroides xylanisolvens sp.Nov., a xylan-degrading bacterium isolatedfrom human faeces” ； International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(2008) ; 58，1008-1013)。其是降解木聚糖的革兰氏阴性杆状细菌，该细菌可以从人粪便分离并因此是人共生性微生物。解木聚糖拟杆菌作为DSM18836保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH) (DSMZ), Inhoffenstraβ e7B, 38124Braunschweig(DE)并且是从此处可公开获得的。然而，其在食品中的用途不是本领域已知或提出过的。
[0012]可以显示解木聚糖拟杆菌物种微生物不具有致病性并且因此可以在没有造成不良副作用的高风险情况下消费，尤其由人消费时。另外，因致病性低，所以不存在法定规定对制造、分销和销售解木聚糖拟杆菌物种微生物通的严重限制，这因此可以在很少努力情况下就得以满足。具体而言，根据欧盟指令2000/54/EC和德国“生物材料规定” (“Biostoffverordnung” ),将解木聚糖拟杆菌微生物划归为第I风险组的生物因子。第I风险组是4个风险组的最低者并且涉及不可能造成人类疾病的生物因子。将许多其他微生物(还包括其他拟杆菌属物种微生物)划分在更高的风险组(例如卵形拟杆菌是第2风险组的生物因子)。
[0013]因此，在第一方面，本发明提供包含解木聚糖拟杆菌物种微生物的食品。
[0014]在第二方面，本发明提供一种用于产生发酵食品的方法，其中食品原料与用于发酵的起子培养物组合，特征在于添加解木聚糖拟杆菌物种微生物。另外，提供了通过所述方法可获得的包含解木聚糖拟杆菌物种微生物的发酵食品。
[0015]在第三方面，本发明提供一种作为DSM23964保藏的菌株CTC1、由其衍生的微生物或CTCl同源物的微生物。
[0016]如实施例中展示，本发明的微生物尤其对于质粒DNA物质、最重要的毒力因子和大部分相关胞外酶和致病因子呈阴性，并且不附着于人结肠的上皮细胞。另外，本发明的微生物在小鼠内的毒理学研究中不显示副作用并且在服用每日剂量高达8.5*10nCTCl持续3周的人类中不显示任何性质的副作用。因此，本发明的微生物满足极高安全性标准并可以由人消费，而没有不想要的副作用的风险。另外，本发明的微生物优选地对各种抗生素敏感，因此，如果需要，可以容易地和有效地消除。
[0017]另外，可以展示本发明的微生物显示稳定和均质的细胞表面，尤其显示可以用作产品品质标记的稳定和均质的表面碳水化合物结构表达。表面特征和尤其其碳水化合物结构可以用作含有本发明微生物的微生物培养物的均匀性的标记物，和/或可以用作培养物中本发明微生物的量的标记物。[0018]另外，本发明人已经发现本发明的微生物能够产生短链脂肪酸(SCFA)。作为微生物碳水化合物发酵的终产物产生的短链脂肪酸(SCFA)可以具有促进健康的特性。作为例子，丙酸盐据报道具有潜在的降低胆固醇作用和抗脂质生成作用。其还可以刺激饱满感并且与乙酸盐和丁酸盐一起提供抗致癌作用。
[0019]在第四方面，本发明提供一种用于产生根据本发明第一方面的食品的方法，包括步骤:将解木聚糖拟杆菌物种微生物添加至包含至少一种食品原料的组合物或添加至加工的食品物料。另外，提供了解木聚糖拟杆菌物种微生物产生食品、尤其作为用于发酵的起子培养物的用途。
[0020]本发明的其他目的、特征、优势和方面将因以下描述和所附权利要求书而对本领域技术人员变得清楚。然而，应当理解以下描述、所附权利要求书和表示本申请的优选实施方案的具体实施例仅以说明方式给出。处于所公开发明的精神和范围内的多种改变和修改将因阅读以下内容而对本领域技术人员变得容易显见。
[0021]发明详述
[0022]本发明人已经发现解木聚糖拟杆菌物种微生物适用于在食品中，尤其适用于人类消费。因此，在第一方面，本发明涉及包含解木聚糖拟杆菌物种微生物的食品。
[0023]根据本发明，解木聚糖拟杆菌物种微生物尤其涉及属于拟杆菌属并优选具有以下一个或多个特征的微生物:
[0024]a)在DNA-DNA杂交测定法中，其与作为DSM18836或DSM23964保藏的解木聚糖拟杆菌显示至少30%、优选地至少50%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%、更优选地至少98%或至少99%的DNA-DNA亲缘关系；
[0025]b)其与作为DSM18836或DSM23964保藏的解木聚糖拟杆菌显示至少95%、优选地至少97%、至少98%或至少99%、更优选地至少99.5%的16S rRNA基因序列相似性水平；
[0026]c)其具有以下一个或多个特征:
[0027]i)作为保藏为DSM18836的解木聚糖拟杆菌，其不能够降解淀粉；
[0028]ii)其具有利用和/或代谢甘露醇、尤其D-甘露醇、松三糖和/或山梨醇、尤其D-山梨醇和/或从丙三醇产生酸的能力；
[0029]iii)其表现谷氨酰谷氨酸芳基酰胺酶活性；
[0030]iv)其不能产生吲哚；
[0031]V)其不显示过氧化氢酶活性；
[0032]d)其具有以下一个或多个特征:
[0033]i)其是厌氧微生物；
[0034]ii)其不形成孢子；
[0035]iii)其是非-能动的；并且
[0036]iv)其是革兰氏阴性的。
[0037]优选地，满足以上定义的标准a)至d)的至少两个或至少三个并且更优选地全部标准。
[0038]术语“DNA-DNA亲缘关系”尤其指两种微生物的基因组或整个DNA的相似性百分数，如根据 De Ley 等人，(1970) Eur.J.Biochem.12，133-142 或 Hu β 等人，(1983) Syst.Appl.Microbiol.4，184-192的DNA-DNA杂交/复性测定法所测量。具体而言，DNA-DNA杂交测定法优选地由DSMZ (德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH),布伦瑞克，德国)鉴定服务机构进行。在一个实施方案中，DNA-DNA杂交测定法如下文实施例1.3中所述进行。
[0039]术语“16S rRNA基因序列相似性”尤其指在第一微生物16S核糖体RNA(rRNA)基因的核酸序列的一个区域和第二微生物16S rRNA基因的核酸序列的相应区域之间相同核苷酸的百分数。优选地，该区域包含至少100个连续核苷酸，更优选地至少200个连续核苷酸，至少300个连续核苷酸或至少400个连续核苷酸，最优选地约480个连续核苷酸。在一个实施方案中，16S rRNA基因的核酸序列的区域分别旁侧分布有SEQ ID NO:1和2的序列或它们的互补序列。
[0040]在优选的实施方案中，解木聚糖拟杆菌物种微生物稳定和/或均质地表达至少一种表面碳水化合物结构。稳定表达表面碳水化合物结构的微生物尤其指一组微生物，其中至少50%、优选地至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或约100%的微生物表达该表面碳水化合物结构。稳定表达表面碳水化合物结构的微生物尤其指一组微生物，其中至少50%、优选地至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或约100%的微生物以这样的表达水平表达表面碳水化合物结构，所述表达水平与平均表达水平相距不多于50%、优选地不多于40%、不多于30%、不多于25%、不多于20%、不多于15%或不多于10%。表达表面碳水化合物结构的微生物尤其涉及以通过如本领域已知合适方法可检测的量包含该表面碳水化合物结构的微生物。
[0041]解木聚糖拟杆菌微生物优选地能够产生短链脂肪酸(SCFA)。作为微生物糖发酵的终产物产生的短链脂肪酸(SCFA)可以具有促进健康的特性。作为例子，丙酸据报道具有潜在的降低胆固醇作用和抗脂质生成作用。其还可以刺激饱满感并且与乙酸和丁酸一起提供抗致癌作用。在优选的实施方案中，本发明的微生物能够产生选自丙酸、乙酸、琥珀酸、甲酸和乳酸的一种或多种SCFA。优选地，其能够产生丙酸和/或乙酸。在优选的实施方案中，这些SCFA还存在于含有该微生物的本发明食品中。在其中本发明食品包含处于活性形式的解木聚糖拟杆菌物种微生物的某些实施方案中，所述微生物仍能够在消费食品后在顾客的身体内部产生所述SCFA。
[0042]在优选的实施方案中，解木聚糖拟杆菌微生物在摄入后能够存活于胃中条件，尤其经过胃，并且优选地还存活于至少人类肠道的至少一部分中的条件，尤其经过所述部分。具体而言，存活于人类胃中的条件指在包含解木聚糖拟杆菌微生物的组合物中、尤其在本发明的食品中至少50%、优选地至少60%、至少70%、至少80%或至少85%该微生物在胃液中存活至少180分钟。另外，存活于人类肠道中的条件指在包含解木聚糖拟杆菌微生物的组合物中、尤其在本发明的食品中至少50%、优选地至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%该微生物在肠液中存活至少240分钟。
[0043]在优选的实施方案中，解木聚糖拟杆菌微生物具有以下一个或多个安全特征:
[0044](i)其对抗生素甲硝唑、美罗培南和/或克林霉素敏感；
[0045](ii)其不含质粒 RP4(DSM3876)和 / 或质粒 pSClOl (DSM6202)；
[0046](iii)其不含β -内酰胺酶基因cfiA和/或CfxA ；
[0047](iv)其不含毒力因子脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)多糖A和/或脆弱拟杆菌肠毒素Bft和/或由基因ompW编码的“Ton B连接的外膜蛋白”；
[0048](V)其不显示任何胞外DNA酶活性、胞外软骨素酶活性、胞外透明质酸酶活性和/或胞外神经氨酸酶活性；和
[0049](vi)其不附着于人结肠的上皮细胞。
[0050]在一个优选实施方案中，所述解木聚糖拟杆菌微生物是
[0051]a) CTCl,其由 Glycotope GmbH, Robert-Riissle--Str.10，13125 柏林(DE)根据布达佩斯条约要求，在2010年9月I日以登录号DSM23964保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)，Inhoffenstra^ e7B, 38124 布伦瑞克(DE) (DSM23964)，
[0052] b)衍生自CTCl的微生物，或
[0053]c) CTCl 同源物。
[0054]CTCl (DSM23964)属于解木聚糖拟杆菌物种。优选地，CTCl是严格厌氧、不形成孢子、非-能动和革兰氏阴性的杆状细菌，宽0.4-0.5μπι，长通常1_2μπι，其在Wilkins-Chalgren琼脂上长成菌落，所述菌落在18小时后具有2_3mm直径，圆形、乳状、升高和凸出的表面。
[0055]衍生自CTCl的微生物和/或CTCl同源物优选地具有以下一个或多个特征:
[0056]a)其属于如上文定义的解木聚糖拟杆菌物种；
[0057]b)在DNA-DNA杂交测定法中，其与作为DSM23964保藏的CTCl的解木聚糖拟杆菌显示至少30%、优选地至少50%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%、更优选地至少98%或至少99%的DNA-DNA亲缘关系；
[0058]c)其与作为DSM23964保藏的CTCl显示至少95%、优选地至少97%、至少98%、或至少99%、更优选地至少99.5%、和最优选地约100%的16S rRNA基因序列相似性水平；
[0059]d)其能够产生短链脂肪酸；
[0060]e)其具有上文公开的一个或多个安全特征:
[0061]f)其存活于人类胃和/或肠中的条件。
[0062]优选地，满足以上定义的标准a)至f)的至少两个，更优选地至少三个，至少四个或至少五个和最优选地全部标准。
[0063]如本文所用的术语“微生物”可以仅指一个单细胞生物以及指众多的单一单细胞生物。例如，术语“解木聚糖拟杆菌物种微生物”可以指解木聚糖拟杆菌物种的一个单一解木聚糖拟杆菌细菌细胞以及解木聚糖拟杆菌物种的多个细菌细胞。术语“解木聚糖拟杆菌物种微生物”和“解木聚糖拟杆菌微生物”在本文中以同义地方式使用。通常而言，术语“微生物”指众多细胞。具体而言，该术语指至少IO3个细胞，优选地至少IO4个细胞，至少IO5或至少IO6个细胞。
[0064]根据本发明，术语“食品”指任何可食用产品，尤其可以用于营养人类和/或动物，优选地用于人类营养的任何产品。食品可以是从分离的养分、膳食补充剂和特定膳食至基因修饰的食品、草药产品和加工食品如发酵食品、谷物食品、汤和饮料。术语
“食品”尤其指可以由人类或动物经口取得的任何养分、养分组合物或制剂，如但不限于养分、营养添加物、食品添加剂、膳食补充剂、临床食品、肠胃外食品，肠内食品、特殊膳食用途食品、指定健康用途的食品或功能性食品，它们可以经口以不同形式，如但不限于胶囊、片、乳液、粉末、液体应用以及以任何食品或饮料形式或作为其部分应用。在特定的情况下，食品可以按肠胃外方式给予(肠胃外食品)。食品可以按原样或与至少一种其他成分混合给予。食品本身或其与至少一种其他成分的混合物可以按原样给予或混入食品或饮料中。术语“食品”还意指任何食品，尤其发酵食品、饮料、胶囊、片、乳液、粉末或液体。在某些实施方案中，食品提供一般健康益处。具体而言，食品可以是益生的。
[0065]本发明的食品优选地以产生用于顾客的每日剂量约IO6至约IO13个微生物的量或浓度包含解木聚糖拟杆菌物种微生物。优选地，每日剂量不超过2.8*1012个微生物，优选地2.3*1012个微生物，和/或是至少IO8个微生物，优选地至少IO9个微生物。具体而言，每日剂量处于约IOltl至约IO12个微生物范围内。食品优选地处于单一单位剂量的形式，所述单位剂量各自包含如上文所述的解木聚糖拟杆菌物种微生物的每日剂量。
[0066]本发明的食品可以含有处于有活力、非增殖、无活力或裂解形式的解木聚糖拟杆菌物种微生物。优选地，所述微生物以非致病形式、非增殖、无活力或裂解形式使用。
[0067]在第二方面，本发明涉及一种用于产生发酵食品的方法，其中食品原料与用于发酵的起子培养物组合，特征在于添加解木聚糖拟杆菌物种微生物。
[0068]本发明的“发酵食品”尤其指借助微生物的作用产生或保存的食品。具体而言，包括涉及使用细菌的发酵过程。通过本发明方法可产生的产品的非限制示例性名单包括发酵奶制品，如酸乳清、凝乳/酸乳、明胶、奶油干酪、软干酪、切片干酪、硬干酪、加工干酪、奶豆腐、来自凝乳的干酪、烹煮干酪、牛奶酒(kefir)、衣梅尔
(ymer)、avran、糖蜜、酸奶、果味酸奶、甜乳清、乳清黄油、新鲜干酪、莫兹瑞拉、菲达干酪、乳清粉、酸奶油、法式酸奶油(crSme fraiche)、马斯卡朋(mascarpone)、斯美塔那酸奶油(smetana)、酸奶油、酸奶油黄油、黄油、酥油(butter oil)、半脂黄油、微酸黄油、生香肠，如萨啦咪或咸肉、可可、咖啡、酸面包和酸菜，如德国酸菜(sauerkraut)。根据待生产的发酵食品选择食品原料。
[0069]在用于产生发酵食品的本发明方法中，解木聚糖拟杆菌物种微生物可以单独或与适于发酵的另一个微生物组合地用作起子培养物。另外，可以将解木聚糖拟杆菌物种微生物在发酵期间添加至食品原料或在发酵后添加至发酵食品。如果不使用解木聚糖拟杆菌物种微生物作为起子培养物，则优选地添加非增殖、无活力或裂解形式的解木聚糖拟杆菌物种微生物。如果解木聚糖拟杆菌物种微生物以活性形式添加，则可以使它们不能够在最终的发酵食品中繁殖。这可以例如通过照射微生物或加热来实现。优选地，将微生物杀死。
[0070]用于产生发酵食品的本发明方法优选地包括至少一种以下方法步骤:
[0071]-将食品原料用任选地含有解木聚糖拟杆菌物种微生物的起子培养物接种；
[0072]-添加至少一种糖，优选地葡萄糖；并且
[0073]-温育含有用于发酵的起子培养物的食品原料，优选地在无氧条件下。
[0074]在用于产生发酵食品的本发明方法中，优选地添加如上文所述的解木聚糖拟杆菌物种微生物。另外，相对于本申请的食品，产生的发酵食品优选地具有上文描述的一个或多个特征。参照解木聚糖拟杆菌物种微生物和包含其的食品的以上公开内容、特征和实施方案。将解木聚糖拟杆菌物种微生物优选地以至少IO6个细胞/毫升原料的量、优选地以约IO9至约101°个细胞/毫升原料的量、更优选地以约1*109至约7*109个细胞
/毫升原料的量添加。
[0075]另外，本发明提供通过产生发酵食品的本发明方法可获得的发酵食品。
[0076]在第三方面，本发明提供一种作为DSM23964保藏的菌株CTC1、由其衍生的微生物或CTCl同源物的微生物。相对于解木聚糖拟杆菌物种微生物，菌株CTCl的微生物优选地具有上文描述的一个或多个特征。
[0077]具体而言，本发明的微生物是解木聚糖拟杆菌物种微生物。在优选的实施方案中，其与作为DSM18836或DSM23964保藏的CTCl在DNA-DNA杂交测定法中显示至少70%、优选地至少90%、至少95%、更优选地至少98%、最优选地至少99%的DNA-DNA亲缘关系。另外，其优选地与作为DSM18836或DSM23964保藏的CTCl显示至少98%、优选地至少99%或至少99.5%、更优选地100%的16S rRNA基因序列相似性水平。
[0078]在优选的实施方案中，本发明的微生物具有以下一个或多个特征:
[0079]i)作为保藏为DSM18836的解木聚糖拟杆菌，其不能够降解淀粉；
[0080]ii)其具有利用和/或代谢甘露醇、尤其D-甘露醇、松三糖和/或山梨醇、尤其D-山梨醇和/或从丙三醇产生酸的能力；
[0081]iii)其表现谷氨酰谷氨酸芳基酰胺酶活性；
[0082]iv)其不能产生吲哚；
[0083]V)其不显示过氧化氢酶活性。
[0084]另外，本发明的微生物优选地是不形成孢子和非-能动的革兰氏阴性厌氧微生物。其优选地能够产生短链脂肪酸，尤其如上文所述，和/或能够在摄入后存活于胃中和任选地人类肠道中的条件，尤其如上文所述。
[0085]在优选的实施方案中，本发明的微生物具有以下一个或多个安全特征:
[0086](i)其对抗生素甲硝唑、美罗培南和/或克林霉素敏感；
[0087](ii)其不含质粒 RP4(DSM3876)和 / 或质粒 pSClOl (DSM6202)；
[0088](iii)其不含β -内酰胺酶基因cfiA和/或CfxA ；
[0089](iv)其不含毒力因子脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)多糖A和/或脆弱拟杆菌肠毒素Bft和/或由基因ompW编码的“Ton B连接的外膜蛋白”；
[0090](V)其不显示任何胞外DNA酶活性、胞外软骨素酶活性、胞外透明质酸酶活性和/或胞外神经氨酸酶活性；和
[0091](vi)其不附着于人结肠的上皮细胞。
[0092]本发明的微生物尤其是优选地在其天然环境中不存在的分离的微生物。具体而言，微生物不存在于人体中，优选地其不存在于人体或动物体中。根据一个实施方案，本发明的微生物已经从包含不属于解木聚糖拟杆菌物种的微生物的组合物分离。根据一个实施方案，本发明的微生物存在于包含至少70%、至少80%、至少90%、优选地至少95%、97%、99%、最优选约100%本发明微生物的培养物中或从其中获得。
[0093]另外，本发明提供一种包含本发明微生物的组合物。就本发明微生物的特征而言，参考上文的发明公开。优选地，组合物中80%或更多、更优选地85%或更多、90%或更多、95%或更多、98%或更多或99%或更多和最优选地约100%的微生物是本发明的微生物。根据一个实施方案，组合物中的微生物以有活力、非增殖、无活力或裂解形式存在。根据一个实施方案，所述组合物是细胞培养物。
[0094]优选地，该组合物包含至少IO3个本发明的微生物、更优选地至少IO4个、至少IO5个或至少IO6个本发明的微生物。
[0095]在第四方面，本发明提供一种用于产生食品、尤其根据本发明第一方面的食品的方法，包括步骤:将解木聚糖拟杆菌物种微生物添加至包含至少一种食品原料的组合物或添加至加工的食品物料。另外，提供了解木聚糖拟杆菌物种微生物产生食品、尤其作为用于发酵的起子培养物的用途。就解木聚糖拟杆菌物种微生物的特征而言，参考以上公开内容。
[0096]如本文所用，表述“包含”，除了其字面含义外还包括并且特别地指表述“基本上由……组成”和“由……组成”。因而，表述“包含”指其中“包含”具体所列出元素的主题物不包含其他要素的实施方案，以及其中“包含”具体所列出元素的主题物可以和/或实际上的确涵盖其他要素的实施方案。同样，表述“具有”应理解为表述
“包含”，还包括并且特别地指表述“基本上由……组成”和“由……组成”。
【专利附图】

【附图说明】
[0097]图1显示本发明微生物CTCl和不同参考微生物的限制性分析。这些结果支持CTCl是解木聚糖拟杆菌物种。
[0098]图2显示质粒和β内酰胺酶基因cfiA、cfxA和cepA的确定。(A)质粒:加载20 μ g每种分离的质粒DNA。泳道:I, Ikb DNA梯；2,大肠杆菌DSM3876 ; 3,大肠杆菌DSM6202 ； 4，解木聚糖拟杆菌 DSM23964。 (B) cfiA 基因:泳道:1，IOObp DNA 梯；2，脆弱拟杆菌TAL3636 ; 3，解木聚糖拟杆菌DSM23964 ; 4，阴性对照。(C)cfxA基因:泳道:I和6，IkbDNA梯；2， 卵形拟杆菌丽7; 3，卵形拟杆菌丽23; 4，解木聚糖拟杆菌DSM23964 ； 5，阴性对照。(D)C印A基因:泳道:I和6，IOObp DNA梯；2，脆弱拟杆菌DSM1396 ； 3，卵形拟杆菌丽23; 4，解木聚糖拟杆菌DSM23964 ;泳道5，阴性对照。
[0099]图3显不毒力编码基因bft、wcfR、wcfS和omp W的确定。(A)bft基因:泳道:1，IOObp DNA梯；2，解木聚糖拟杆菌DSM23964 ; 3，脆弱拟杆菌ATCC43858 ; 4，阴性对照。(B) wcfR基因:泳道:1，Ikb DNA梯；2，脆弱拟杆菌DSM1396 ; 3，脆弱拟杆菌ATCC43858; 4，脆弱拟杆菌DSM2151 ; 5，解木聚糖拟杆菌DSM23964 ; 6，脆弱拟杆菌TAL3636; 7，阴性对照。(C)wcfS基因:泳道:泳道:1，Ikb DNA梯；2，脆弱拟杆菌DSM1396; 3，脆弱拟杆菌ATCC43858 ; 4，脆弱拟杆菌DSM2151 ; 5，解木聚糖拟杆菌DSM23964 ； 6，脆弱拟杆菌TAL3636 ; 7，阴性对照。(D)ompW基因:泳道:1，IOObp DNA梯；2,解木聚糖拟杆菌 DSM23964 ; 3,幾拟杆菌(Bacteroides caccae) DSM19024 ； 4,阴性对照。
[0100]图4显示菌株DSM23964与Caco-2细胞结合的分子分析。(A) GAPDH和蔗糖异麦芽糖酶。泳道:1，IOObp DNA梯(Bioline) ; 2，第 I 日；3，第 3 日；4，第 6 日；5，第 8日；6，第10日；7，第13日；8，第14日，9，第阴性对照。(B)菌株DSM23964和脆弱拟杆菌DSM1396的检测。泳道:1，IOObp DNA梯；2，第一洗涤步骤后的菌株DSM23964 ;3，第六洗涤步骤后的菌株DSM23964 ; 4，菌株DSM23964+Caco_2细胞；5，第一洗涤步骤后的脆弱拟杆菌DSM1396 ; 6，第六洗涤步骤后的脆弱拟杆菌DSM1396 ; 7，脆弱拟杆菌DSM1396+Caco-2 细胞;8，Caco-2 细胞；9，菌株 DSM23964 ; 10，脆弱拟杆菌 DSM1396 ;11，阴性对照。(C)嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的检测。泳道:I,第一洗涤步骤后的嗜酸乳杆菌DSM9126 ; 2，第六洗涤步骤后的嗜酸乳杆菌DSM9126 ; 3，嗜酸乳杆菌DSM9126+Caco-2细胞；4，Caco-2细胞；5，嗜酸乳杆菌DSM9126 ; 6，阴性对照；7，IOObp DNA 梯。
[0101]图5显示90天口服毒性研究期间小鼠的体重和食物消耗量。(A)雄性对照的体重:NMRI小鼠。(B)雌性对照的体重:NMRI小鼠。(C)雄性对照的食物消耗量:NMRI小鼠。(D)雌性对照的食物消耗量:NMRI小鼠。每组均值:组I (O)、组2 (I X IO6)、组3 (I X IO7)、组4 (I X IO8) CFU的解木聚糖拟杆菌DSM23964和组5 (I X IO11)解木聚糖拟杆菌DSM23964巴氏消毒/动物/日。统计显著性由P≤0.01指示。值根据Dunnett检验。
[0102]图6显示通过物种特异性多重PCR检测到所注射溶液中的污染。泳道:1，阳性对照(解木聚糖拟杆菌DSM23964) ； 2，溶液2 (I X IO9个脆弱拟杆菌RMA6791/ml)；3，溶液3(1X109个解木聚糖拟杆菌DSM23964/ml) ； 4，溶液4(1.5X IO8个脆弱拟杆菌RMA6791/ml) ； 5，溶液 5 (1.5 X IO8 个解木聚糖拟杆菌 DSM23964/ml) ； 6，溶液 6 (5 X IO6个脆弱拟杆菌RMA6791/ml) ; 7，溶液7 (5 X IO6个解木聚糖拟杆菌DSM23964/ml)，8，阳性对照(脆弱拟杆菌RMA6791) ； 9，溶液I (对照组)。污染对照:泳道10，90%脆弱拟杆菌RMA6791和10%解木聚糖拟杆菌DSM23964的混合物；泳道11，10%脆弱拟杆菌RMA6791和90%解木聚糖拟杆菌DSM23964的混合物。泳道12，Ikb DNA梯(Fermentas)。
[0103]图7显示来自穿刺脓肿的分离DNA的物种特异性PCR。 (A)在用解木聚糖拟杆菌DSM23964注射的动物的脓肿中检出解木聚糖拟杆菌。泳道:1，IOObp DNA梯(Fermentas) ； 2-3,组 3 (4.6X IO9 个解木聚糖拟杆菌 DSM23964/kg bw) ； 4-5,组
5(6.9 X IO8个解木聚糖拟杆菌DSM23964/kg bw) ； 6-7,组7 (2.3 X IO7个解木聚糖拟杆菌DSM23964/kg bw) ； 8，阳性对照(解木聚糖拟杆菌DSM23964) ； 9，阴性对照(水)。(B)在用脆弱拟杆菌RMA6791注射的动物的脓肿中检出脆弱拟杆菌。泳道:1，IOObp DNA梯(Fermentas) ； 2-3,组 2 (4.6X IO9 个脆弱拟杆菌 RMA6791/kg bw) ； 4-5,组 Μ6.9Χ108个脆弱拟杆菌 RMA6791/kg bw) ； 6-7,组 6 (2.3 X IO7 个脆弱拟杆菌 RMA6791/kgbw)，8，阳性对照(脆弱拟杆菌RMA6791) ； 9,阴性对照(水)；10, Ikb DNA梯(fermentas)。
实施例
[0104]实施例1:本发明的微生物是解木聚糖拟杆菌物种的独特菌株。
[0105]1.1分类学分析1: 16S rRNA序列相似性
[0106]使用通用引物27f (5，-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:1))和 519r (5，-GWATTACCGCGGCKGCTG-3’(SEQ ID NO: 2))，通过 PCR 扩增菌株 CTCl 的 16S rRNA 基因序列(480个碱基)。通过使用高纯PCR产物纯化试剂盒(Roche，印第安纳波利斯，USA)纯化PCR产物并且通过使用低DNA质量梯(Invitrogen，Carlsbad, USA)估计DNA浓度和产物大小。使用DYEnamic? ET染料终止循环测序试剂盒(Amersham Bioscience)和ABIPRISM3100毛细管测序仪(Applied Biosystems)根据制造商的说明书，对PCR产物测序。起初通过BLAST程序(Altschul等人，,1997)和megaBLAST (Zhang等人，2000)程序针对具有合格发表的原核名称的模式菌株的数据库(Chun等人，2007)实施系统进化邻居的鉴定。随后选择具有最高评分的50个序列以便使用总体比对算法计算配对序列相似性，这在 EzTaxon 服务器处实施(http://www.eztaxon.0rg/ ； Chun 等人，2007)。通过使用程序MEGA第5版(Tamura，2007)去除比对空位和模糊碱基，手工修正所产生的多重序列比对结果，并且根据邻接法(Saitou和Nei，1987)采用程序MEGA第5版(Tamura，2007)，构建进化系统树。
[0107]菌株CTCl的16S rRNA序列分析显示这个菌株与解木聚糖拟杆菌DSM18836聚类(100%16S rRNA序列相似性)、与卵形拟杆菌ATCC8483聚类(97.5%)、与多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)ATCC29148 聚类(94.2%)并与 Bacteroides finegoldiiDSM17565聚类(92.2%)。通常认为16S rRNA基因序列趋异性方面≤97%的相似值对于物种划定是显著的(Stackebrandt 和 Goebel, 1994)。然而，Stackebrandt 和 Ebers (2006)已经推荐这种值可以增加至98.7-99%，同时不牺牲“物种”描述的品质和精度，并且作为分类学家的辅助。
[0108]1.2分类学分析2:全基因组DNA-DNA杂交
[0109]认为DNA-DNA杂交是分类学中的金标准。使CTCl菌株的全基因组与解木聚糖拟杆菌 DSM18836、卵形拟杆菌 DSM1896、多形拟杆菌 DSM2079 和 Bacteroides finegoldiiDSM17565的全基因组杂交(这些分析在DMSZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)处并由该机构进行)。简而言之，将3g待比较的每个菌株的生物材料用于DNA制备。分析分离的DNA的纯度并且使用弗氏压碎器剪切DNA并使其在高温变性(100°C，10分钟)。将DNA优选地剪切成大小在200和600kDa之间的片段，主要部分为约450+/_100kDa。以分光光度方式使用在260nm处的吸光度测量每个菌株的DNA以及相等浓度的两个菌株的DNA的混合物(样品中的DNA终浓度是基本上相同的并且优选地位于约20和100μ g/ml之间，尤其约30 μ g/ml)的复性。通过迅速冷却该溶液至DNA解链温度以下25°C的温度启动复性，并且测量进行30分钟。从单个细菌菌株的各自DNA和两个菌株的DNA混合物的复性曲线的不同斜率计算DNA亲缘关 系。具体而言，将复性速率V’确定为吸光度/分钟(Λ A/t)的下降，并且根据De Ley等人给出的公式(见上文)结合程度(D)，即DNA亲缘关系:
【权利要求】
1.一种食品，其包含解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)物种的微生物。
2.根据权利要求1所述的食品，其中所述解木聚糖拟杆菌物种微生物是作为DSM23964保藏的CTC1、由其衍生的微生物或CTCl同源物。
3.根据权利要求1或2所述的食品，其中所述解木聚糖拟杆菌物种微生物具有以下一个或多个特征: a)在DNA-DNA杂交测定法中，其与作为DSM23964保藏的CTCl显示至少70%、优选地至少90%、至少95%、更优选地至少98%、最优选地至少99%的DNA-DNA亲缘关系； b)其与作为DSM23964保藏的CTCl显示至少98%、优选地至少99%或至少99.5%、更优选地100%的16S rRNA基因序列相似性水平；和/或 c)其能够产生短链脂肪酸；和/或 d)其能够在摄入后存活于胃中和任选地人类肠道中的条件；和/或 e)其具有以下一个或多个安全特征: (i)其对抗生素甲硝唑、美罗培南和/或克林霉素敏感； (ii)其不含质粒RP4(DSM3876)和 / 或质粒 pSClOl (DSM6202)； (iii)其不含β-内酰胺酶基因cfiA和/或CfxA ；` (iv)其不含毒力因子脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)多糖A和/或脆弱拟杆菌肠毒素和/或由基因ompW编码的“Ton B连接的外膜蛋白”； (v)其不显示任何胞外DNA酶活性、胞外软骨素酶活性、胞外透明质酸酶活性和/或胞外神经氨酸酶活性；和 (vi)其不附着于人结肠的上皮细胞；和/或 f)其稳定和/或均质地表达表面碳水化合物结构。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的食品，以产生用于顾客的每日剂量约IO6至约IO13个微生物的量或浓度包含解木聚糖拟杆菌物种微生物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的食品，包含处于有活力、非增殖型、无活力或裂解形式的解木聚糖拟杆菌物种微生物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的食品，所述食品选自发酵食品、益生食品、功能性食品、膳食补充剂和食品添加剂。
7.一种用于产生发酵食品的方法，其中食品原料与用于发酵的起子培养物组合，特征在于添加解木聚糖拟杆菌物种微生物。
8.根据权利要求7所述的方法，具有以下一个或多个特征: a)使用所述解木聚糖拟杆菌物种微生物单独或与另一种起子培养物组合作为起子培养物； b)将所述解木聚糖拟杆菌物种微生物在发酵期间或之后添加至发酵食品；和/或 c)所述解木聚糖拟杆菌物种微生物以有活力、非增殖、无活力或裂解形式使用； d)将所述解木聚糖拟杆菌物种微生物以至少IO6个细胞/毫升原料的量、优选地以约IO9至101°个细胞/毫升原料的量添加。
9.根据权利要求7或8所述的方法，包括至少一个以下方法步骤: -将食品原料用任选地含有解木聚糖拟杆菌物种微生物的起子培养物接种；-添加至少一种糖，优选地葡萄糖；并且 -温育含有用于发酵的起子培养物的食品原料，优选地在无氧条件下。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述解木聚糖拟杆菌物种微生物具有以下一个或多个特征: a)其是CTCl(DSM23964)、由其衍生的微生物或CTCl同源物； b)在DNA-DNA杂交测定法中，其与作为DSM23964保藏的CTCl显示至少70%、优选地至少90%、至少95%、更优选地至少98%、最优选地至少99%的DNA-DNA亲缘关系； c)其与作为DSM23964保藏的CTCl显示至少98%、优选地至少99%或至少99.5%、更优选地100%的16S rRNA基因序列相似性水平；和/或 d)其能够产生短链脂肪酸；和/或 e)其能够在摄入后存活于胃中和任选地人类肠道中的条件；和/或 f)其具有以下一个或多个安全特征: (i)其对抗生素甲硝唑、美罗培南和/或克林霉素敏感； (ii)其不含质粒RP4(DSM3876)和 / 或`质粒 pSClOl (DSM6202)； (iii)其不含β-内酰胺酶基因cfiA和/或CfxA ； (iv)其不含毒力因子脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)多糖A和/或脆弱拟杆菌肠毒素和/或由基因ompW编码的“Ton B连接的外膜蛋白”； (v)其不显示任何胞外DNA酶活性、胞外软骨素酶活性、胞外透明质酸酶活性和/或胞外神经氨酸酶活性；和 (vi)其不附着于人结肠的上皮细胞。
11.发酵食品，通过根据权利要求7至10中任一项所述的方法可获得。
12.作为DSM23964保藏的菌株CTC1、由其衍生的微生物或CTCl同源物的微生物。
13.根据权利要求12所述的微生物，其中从CTCl或CTCl同源物衍生的微生物具有以下一个或多个特征: a)其是解木聚糖拟杆菌物种微生物； b)在DNA-DNA杂交测定法中，其与作为DSM23964保藏的CTCl显示至少70%、优选地至少90%、至少95%、更优选地至少98%、最优选地至少99%的DNA-DNA亲缘关系； c)其与作为DSM23964保藏的CTCl显示至少98%、优选地至少99%或至少99.5%、更优选地100%的16S rRNA基因序列相似性水平；和/或 d)其能够产生短链脂肪酸；和/或 e)其能够在摄入后存活于胃中和任选地人类肠道中的条件；和/或 f)其具有以下一个或多个安全特征: (i)其对抗生素甲硝唑、美罗培南和/或克林霉素敏感； (ii)其不含质粒RP4(DSM3876)和 / 或质粒 pSClOl (DSM6202)； (iii)其不含β-内酰胺酶基因cfiA和/或CfxA ； (iv)其不含毒力因子脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)多糖A和/或脆弱拟杆菌肠毒素和/或由基因ompW编码的“Ton B连接的外膜蛋白”； (v)其不显示任何胞外DNA酶活性、胞外软骨素酶活性、胞外透明质酸酶活性和/或胞外神经氨酸酶活性；和(Vi)其不附着于人结肠的上皮细胞。
14.组合物，其包含根据权利要求12或13所述的微生物。
15.用于产生根据权利要求1至6中任一项所述的食品的方法，包括步骤:将解木聚糖拟杆菌物种微生物添加至包含至少一种食品原料的组合物或添加至加工的食品物料。
16.根据权利要求15所述的方法，其中解木聚糖拟杆菌物种微生物是根据权利要求12或13所述的微生物。
17.解木聚糖拟杆菌物种微生物用于产生食品、尤其作为用于发酵的起子培养物的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中解木聚糖拟杆菌物种微生物是根据权利要求12或13所述 的微生物。
【文档编号】A23L1/30GK103874428SQ201280040687
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年8月22日 优先权日:2011年8月22日
【发明者】S·格勒茨, P·乌尔瑟默, K·陶陶尼安 申请人:葛莱高托普有限公司