使用pten抑制剂治疗损伤的神经的制作方法

使用pten抑制剂治疗损伤的神经的制作方法
【专利摘要】本申请公开了一种通过使所述细胞与磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶接触抑制肽增长或增殖神经细胞的方法。
【专利说明】使用PTEN抑制剂治疗损伤的神经
【背景技术】
[0001 ] 1.技术领域
[0002] 本申请设及一种通过在损伤的神经处或附近区域给予神经再生量或神经退化减 弱量的憐酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质憐酸酶抑制肤再生神经或减弱损伤的神经退 化的方法。
[0003] 2.-般背景和本领域的现状
[0004] 在成年哺乳动物的神经系统中，损伤的神经的再生在响应于神经损伤的愈合中几 乎不会发生。成年CN巧巾经元在受损后不能再生的主要原因有两个-轴突在成年中枢神经系 统中不会再生，运不仅因为其在受损后受到分泌的细胞外抑制因子的抑制，还因为丧失了 内在轴突生长能力，运种内在轴突生长能力随年龄急剧下降[Schwab et曰1;1996， Gol化erg et al.2002;Fi化in et al.2006;Fitch et.al 2008]。然而，神经损伤后分泌的 细胞外抑制分子的消除在体内仅触发非常有限的轴突再生[Yiu et.al 2006;Hellal et al. 2011]。因此，通过调节内在神经向外生长促进轴突再生过程是目前神经损伤的治疗祀 点的焦点。
[0005] PTEN(憐酸酶和张力蛋白同源物)蛋白质是一种双憐酸酶，并且被认为是一种重要 的通过消极地调节憐脂酷肌醇3-激酶(PI3K)信号通路的肿瘤抑制剂。PI3K信号通路对于细 胞增殖、存活和分化W及蛋白质合成、代谢和运动是一种关键的信号转导[Zhang et al.2010]。作为脂质憐酸酶，PTEN通过对憐脂酷肌醇(3,4,5)S憐酸醋(PIP3)的3位进行脱 憐酸化而催化PIP3转化为憐脂酷肌醇(4,5)二憐酸醋(PIP2)，由此通过括抗PI3K活性而抑制 PI3K信号通路[Di Cristofano et.al 2010] JTEN的缺失或失活增强PI3K活性并且促进 PI3K信号通路下游组件(包括PDKUAkt和哺乳动物雷帕霉素祀(mTOR))的活化，运导致肿瘤 形成[Di Cristofano et.al 2010;Stambolic et al. 1998]。
[0006] 通过PTEN调节PI3K介导的信号也深深地关系到神经系统中的神经再生过程。最近 的研究表明，PTEN蛋白的抑制或PTEN基因的缺失促进受损后成年CNS/PN巧申经的内在再生 向外生长[Park et.al 2008;Liu et.al2010;Sun et.al 2012;Qi;ristie et.al 2012]。例 如，Park et al.发现，使用有条件的基因敲除小鼠通过再活化PI3K-Akt-mT0R信号通路，在 成年大鼠视网膜神经节细胞中PTEN的缺失实际上促进了健全的轴突再生。通过条件基因敲 除mTOR通路的另一个负调节子再活化mTOR通路也促进了轴突再生，运表明P服-mTOR信号的 促进可能是恢复内在轴突再生能力的主要因素。另外，Liu et al.报道，在体内CNS损受模 型中条件缺失PTEN实际上通过上调PI3K信号通路增加了 CNS损伤后减弱的神经元mTOR活 性，运导致增强的未受损CS巧由突的补偿性发芽和受损CST轴突越过脊髓损伤的成功再生。 在PNS损伤的情况下，在体外和体内对PTEN的抑制也提高了轴突向外生长[化ristie et.al 2012]。因此，开发用于促进PI3K-mT0R信号通路的？16財巧制剂是一种用于增强受损神经系 统中轴突再生的良好治疗目标，该?16財巧制剂可W被用在与现存的或新型细胞疗法的联合 治疗方法中，所述现存的或新型细胞疗法含有在CNS或PNS损伤后有效于神经再生的其它试 剂。
[0007]在本研究中，我们开发了通过刺激PI3K信号通路而有效于神经再生和/或防护神 经退化的潜在PTEW^ij剂。为了活化作为脂质憐酸酶的PTEN，PTEN必须W合适的方位位于 质膜中[Leslie et.al 2008]。因此，我们调查了 PTEM膜定位的机制W设计肤形式的潜在 口16財巧制剂候选物。设计并合成了 S种不同的肤-TGN-I、TGN-2和TGN-3-作为潜在的PTE財审 制剂，并且使用体外PTEN活性检测调查了它们抑制PTEN活性的能力。我们还通过使用神经 元细胞系表征了它们对PI3K信号通路的调节的影响。我们发现，TGN-I和TGN-2肤巧们是模 仿PTEN C-末端区域中憐酸化位点的修饰肤)在体外PTE脚舌性检测中实际上减弱了PTEN月旨 质憐酸酶活性。TGN-I肤还在PC12细胞中增强了Akt蛋白的活化水平，运表明运些肤有效上 调PUK-Akt信号通路。使用神经元细胞的神经突检测显示，TGN-I和TGN-2肤通过增强神经 突微管结构而促进神经突向外生长W及延迟神经突退化。因此，TGN肤作为用于CNS损伤后 神经再生的治疗剂是有用的。

【发明内容】

[000引在一个方面，本发明设及W下内容：
[0009] 在一个方面，本发明设及一种在神经损伤部位再生神经或减弱神经退化的方法， 包括在损伤的神经处或附近区域给予神经再生量或神经退化减弱量的憐酸酶和张力蛋白 同源物(PTEN)脂质憐酸酶抑制肤。该口16財巧制肤可W是修饰的PTEN或其片段，其中憐酸化 位点被修饰W便该憐酸化位点中的丝氨酸或苏氨酸被憐酸化。憐酸化的丝氨酸或苏氨酸可 W位于位置1'虹-366、Ser-370、Ser-380、!'虹-382、llir-383或Ser-385。憐酸化的丝氨酸或苏 氨酸可位于位置Ser-370、Ser-380和/或Ser-385。憐酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置 Ser-370、Ser-380和Ser-385。憐酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置Ser-380和Ser-385。肤 可W是憐酸化位点的肤的片段和/或PDZ结构域结合基序。肤可W进一步包含肤转移结构域 (PTD)。神经损伤可W是在中枢神经系统中。
[0010] 在另一方面，本发明设及抑制憐酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质憐酸酶活性的 肤。PTEWW制肤可W是修饰的PTEN肤或其片段，其中憐酸化位点被修饰W便该憐酸化位点 中的丝氨酸或苏氨酸被憐酸化。憐酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置化r-366、Ser-370、 Ser-380、T虹-382、Thr-383或Ser-385。憐酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置Ser-370、Ser-380 和 /或 Ser-385。憐酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置 Ser-370、Ser-380 和 Ser-385。憐酸 化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置Ser-380和Ser-385。肤可W是憐酸化位点的肤的片段和/ 或PDZ结构域结合基序。肤可进一步包含肤转移结构域(PTD)。神经损伤可W是在中枢神经 系统中。
[0011] 在又另一方面，本发明设及一种增长、增殖或增强神经细胞的活性的方法，包括使 该神经细胞与张力蛋白同源物(PTEN)脂质憐酸酶抑制肤接触。
[0012] 从本发明的W下描述、随附的参考附图W及随附的权利要求书，将能够更全面地 理解本发明的运些及其它目的。
【附图说明】
[0013] 从下文给出的详细描述W及附图，本发明将变得能够更全面地被理解，其中附图 仅W说明性的方式给出，因此它们不限制本发明，其中：
[0014] 图I A-1B示出了作为潜在PTEWW制剂的TGN肤。A) PTEN C-末端区域的图表。TPEN C-末端区域包括C2结构域(AA186~403)、憐酸化位点(AA352~399)和PDZ结构域结合基序 (400-403)。含有区域(AA352~403)的憐酸化位点和PDZ结构域结合基序被用作TGN肤设计 的模板。B) TGN肤的氨基酸序列。TGN-1、TGN-2和TGN-3模仿PTEN憐酸化位点，其中所指出的 残基通过憐酸化被修饰。TGN-4肤是TGN-I的乱序肤（scrambled peptide)，并且TGN-5肤是 TGN-2的乱序肤。
[0015] 图2A-2C示出了使用TGN肤的体外PTE脚舌性检测。A)使用孔雀石绿检巧聯剂盒体外 PTEN活性检测的机理。C8-PIP3被用作PTEN底物并且与其它憐脂(DOPC和DOPC)-起被制备 为脂质体。通过监测憐酸根离子-孔雀石绿试剂复合物在62化m下的光密度来测量通过PTEN 由C8-PIP3产生的憐酸根离子。B)TGN肤抑制体外PTE脚舌性的效果。通过体外PTE脚舌性检测 来检查TGN-UTGN-2和TGN-3肤的？16財巧制效果。在100化反应体积中使用20ng人重组PTEN 蛋白质和O.lmM作为脂质体的C8-PIP3溫育IOyM每一种肤。TGN-4和TGN-5肤分别用于检查 TGN-I和TGN-2/3肤的序列特异性。所有的数据均代表了S重实验的结果。OTGN-I和TGN-2 肤的ICso曲线。ICso值通过体外PTE脚舌性检测W剂量依赖性方式使用TGN-I和TGN-2肤进行 测量，并且通过Prism 5软件进行计算。TGN肤的ICsq值为:TGN-I为19.9化M，TGN-2为4.83y MW及TGN-3为87.1化M。
[0016] 图3A-3C示出了 TGN-I肤通过增加体内的Akt活化水平促进PUK-Akt信号。A)通过 使用TGN-I阻断PTE脚舌性的Akt活化的机理。在PI3K信号通路中引入TGN-I促进了 PI3K信号 并且促进了 Akt活化(憐酸化)水平。B)使用PC12细胞裂解物的蛋白质印迹数据。使用TGN-I 肤（IOyM ,IOOiiM )或TGN-4肤（IOiiM )处理PC12细胞，并且溫育24小时。使用抗-憐酸化Akt 抗体的蛋白质印迹数据显示，TGN-IW剂量依赖性方式特异性地促进了内源性Akt的活化水 平。C)还监测了作为阳性对照和负载对照的PTEN和0-肌动蛋白的表达水平。
[0017] 图4A-4B示出了 TGN-I和TGN-2肤，该TGN-Il和TGN-2肤显示出神经营养作用和抵抗 神经突退化的神经保护作用。A)首先使用诺考达挫(0.扣M )将分化的PC12细胞处理1小时， W及使用含有NGF (1化g/血)和TGN肤(TGN-巧日TGN-2，10化M /每种）的新鲜培养基溫育另外 的72小时。使用Image J软件，将相对神经突稳定性计算为来自免疫巧光图像的绿色/红色 巧光信号强度的比率。对于每个样品，所有的巧光信号强度均测量至少S次W用于绿色/红 色比率计算，并且归一化(仅为培养基= l〇〇%)"B)分化的PC12细胞上的神经突向外生长的 定量。使用含有NGF(50ng/ml)的分化培养基将PC12细胞处理24小时，随后使用TGN肤（IOOii M/每一种)溫育额外2天。将TGN-4肤用作TGN-I的阴性对照。在第3天使用神经突定量试剂 盒(Mi 11 ipore) W分光光度法进行神经突定量并且归一化(仅为培养基=100 % )。
[0018]图5示出了在细胞膜表面上PTEN的界面活化的假想模型。目前据信PTEN具有两种 体内构象状态并且拟进行构象变化W位于膜定位中W完全表达其脂质憐酸酶活性。可溶形 式的PTENW "闭合"构象处于失活状态，其中PTEN C-末端区域的憐酸化位点空间上屏蔽 PTE脚舌性位点和C2结构域W防止PTEN膜关联。当"憐酸化位点"中的憐酸化的残基被脱憐酸 化时，PTE州尋其构象从"闭合'构象改变至"开放"构象。在此阶段，位于PTEN的C2结构域处的 多个膜结合基序被暴露并准备与膜关联。PTE脚舌性位点的结合口袋也可W用于访问驻留在 膜表面上的PIP3底物。膜表面上的PIP2与N-末端PIP2结合基序的结合W及C-末端PDZ结构域 结合基序至副官蛋白（adjutant protein) (N肥RFl)中的PDZ结构域的结合，力求PTEN在产 生其脂质憐酸酶活性所需的合适的位置处位于细胞膜表面上。
【具体实施方式】
[0019]在本申请中，"一个(a)"和"一钟(an)"被用来指代单个或多个对象。
[0020] 如本文中所使用的，将损伤的神经或神经系统"附近"注射细胞是指足够接近注射 位点和损伤区域之间的区域，W在损伤部位实现再生神经或防止损伤的神经细胞的退化的 有效结果。因此，在损伤的神经处或附近注射细胞包括在损伤部位或对于注射细胞足够接 近的任何位置W表达有效的多肤并且该多肤被允许直接或间接地实现神经再生或神经退 化预防效果。对于外周神经，特别是脊髓损伤，注射可W在损伤部位的"上游"进行，因为细 胞倾向于在损伤部位泄漏出。
[0021] 如本文中所使用的，"神经突"是指神经元的细胞体的任何突起部。该突起部可W 是轴突或树突。当谈起未成熟的或发育中的神经元(特别是培养中的细胞)时频繁地使用该 术语，因为在完成分化之前，难W辨别轴突和树突。
[0022] 如本文中所使用的，"神经再生"是指在中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS) 中神经损伤后新神经细胞、神经元、神经胶质、轴突、髓銷或突触的生成。通过经由抑制PTEN 活化PI3K-mT0R介导的信号而恢复的内在神经再生能力驱动该再生。
[0023] 如本文所使用的，神经退化的"弱化"或"防止"是指在中枢神经系统(CNS)或外周 神经系统(PNS)中延迟由神经损伤引起的轴突、神经胶质或髓銷结构的退化。"弱化"或"防 止"是通过与PI3K-mT0R-介导的信号紧密相关的神经微管结构稳定来实现的，该PI3K-mTOR-介导的信号由PTEN抑制而激活。
[0024] 憐酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)
[00巧]PTEN氨基酸序列如下：
[0026]
[0027]
[0028] PTEN蛋白质目前正成为用于开发在成年CNS系统中再生损伤的神经的治疗材料的 热口目标，其通过促进PI3K-Akt-mT0R信号而恢复减弱的内在神经再生能力[Park et.曰1 2008;Liu et.al 2010;Sun et.al 2012]。新型?16財巧制剂的开发被认为是用于开发PTEN-活性调节分子的良好策略。不幸的是，PTEN蛋白质的X射线晶体结构[Lee et.al 1999]不足 W为PTEN-底物(PIP3)结合状态提供足够的信息，而所述结合状态对于设计直接阻断PTEN-底物结合的有效PTEWW制剂是关键。替代地，对于PTEN祀向质膜的活性的机理正处于紧张 的研究当中。尽管作为PETN酶的底物的憐脂酷肌醇(3，4，5)二憐酸醋(PIP3)是在细胞膜脂 质双层中发现的憐脂的一员，但是PTEN蛋白质起初作为可溶性蛋白而产生，并且必须通过 构象改变界面激活其脂质憐酸酶活性，随后W适合取向进行PTEN-膜关联[Das et.al2003; Leslie et.al 200引。位于PTEN C2结构域中的多种带电荷的氨基酸和结合基序被认为是 用于将PTEN蛋白质附接到细胞膜表面上的主要错[Lee et.al 1999;Georgescu et.al 2000 ;Leslie et.al 200引。对于PTEN在细胞膜上的适当取向W便产生PTEN的脂质憐酸酶 活性，使用其它结合部分的额外结合也是必要的[化ambell et.al 2003;Walker et.al 2004;0d;riozola et.al2007]。
[0029] PTEN C-末端区域中的非结构化的部分(AA 352-399)被称为"憐酸化位点"，因为 该区域含有称作憐酸化修饰位点的六个丝氨酸/苏氨酸(Thr-366、Ser-370、Ser-380、Thr-382、T虹-383和Ser-385)残基[Lee et.al 1999;化zquez et.al 2001]。先前的研究表明， 该"憐酸化位点"中的运6个残基的突变或缺失导致了更大的肿瘤抑制活性、增强的PTEN膜 亲和力、和降低的蛋白质稳定性[Vasquez et.al 2001;Das et.al 2003;0kahara et.al 2004；Rahdar et.al 2009]〇
[0030] 目前，拒信，PTEN蛋白质具有两种构象状态（图4)。在"关闭"构象中，PTEN是失活 的，因为包括"憐酸化位点"的PTEN的C-末端遮蔽了（mask)位于C2结构域中的膜结合基序W 及PTEN活性位点口袋，运阻止了PTEN与细胞膜的关联W及PIP3接近该活性位点。另一方面， 在PTEN活性位点口袋和C2结构域均未被遮蔽并且完全暴露到细胞膜及其底物PIP3的情况 下，PTEN W其"开放"构象状态变成界面活性的。另外，"憐酸化位点"中该6种丝氨酸/苏氨酸 残基的憐酸化状态被认为是PTEN界面活化的关键因素，因为其直接控制PTEN蛋白质从"关 闭"构象至"开放"构象的构象变化[Das et.al 2003,Vasquez et.al 2006;0d;riozola et.al 2007,Rahdar et.al 2009]〇
[0031] 根据当前提议的模型（图5)，PTEN在膜表面的界面活化需要S个步骤。
[0032] 1)"憐酸化位点"中憐酸化的丝氨酸/苏氨酸残基的脱憐酸化触发PTEN从"关闭"至 "开放"构象的构象变化，运使得PTEN蛋白质能够与细胞膜关联并且将PTE脚舌性位点口袋暴 露给位于细胞膜上的PIP3底物。
[0033] 2)然后，C2结构域中的多膜结合基序与细胞膜相互作用W将PTEN蛋白质错定在膜 表面上。
[0034] 3)同时需要N-末端PIP2结合位点(AA6-15)和细胞膜中的PIP2分子之间的额外相互 作用[Wa化er et.al 2004]W及C-末端PDZ结合域结合位点(AA400-403)与副官畑ERFl蛋白 的PDZ结构域的结合[Tak址asM et.al2006;Molina et.al 2010]来调整细胞膜表面上的 PTEN取向。
[0035] 我们基于图4中示出的PTEN膜定位模型，特别是"憐酸化位点"和PDZ结构域结合位 点(AA 352-403)，设计了我们的TGN肤作为潜在的PTEN抑制剂。作为潜在PTEN抑制剂的TGN 肤的基本概念是，通过遮蔽膜结合所需的PTE脚舌性位点和C2结构域防止PTEN和细胞膜表面 之间的关联。由于Ser370和Ser385优先通过干酪素激酶II憐酸化[Mi 1 Ier et.al 2002]，因 此增加了膜定位W及憐酸酶活性，比在其它残基突变时的多[0化iozola et.al 2007]。因 此，运两种中的至少一个丝氨酸残基被包括在所有的TGN肤中（Ser370/385在TGN-I中， Ser385在TGN-2/TGN-3中）。此外，在380和385位置处的憐酸化的丝氨酸残基当前被认为是 "假底物"的一部分，其遮蔽PTEN活性位点中的催化口袋接近真实的底物PIP3[0driozola et.al 2007]。肤被设计成在所有的TGN肤中包括运两种丝氨酸残基(Ser 380和Ser 385)。
[0036] TGN-I肤序列模仿PTEN憐酸化位点的AA 365~388区域并且含有四个丝氨酸/苏氨 酸残基（Thr366，Ser370，Ser380和Ser385)，其中S个是被憐酸化修饰的残基（Ser370， Ser380和Ser385)DTGN-2和TGN-3肤模仿PTEN蛋白质的AA376-403区域，包括两个憐酸化的 丝氨酸残基（Ser380和Ser385) W及C-末端Pa)结构域结合基序（ITKV)。在TGN-I和TGN-2中 仅丝氨酸被憐酸化W模仿体内PTEN的憐酸化位点，因为苏氨酸残基的憐酸化在体内导致二 次修饰并且在突变时对于改变PTEN-膜结合亲和力不那么有效[Odriozola et.al 2007; Rahdar et. al 2009 ]。在TGN-3肤中，两个丝氨酸残基（Ser380和Ser385)用鄉氨酸取代W用 于比较。另外，使TGN-巧日TGN-2/3肤的序列乱序W检查序列特异性，并且运些肤被分别称为 TGN-4 和 TGN-5 肤。
[0037] 使用重组人PTEN蛋白质和C8-P化作为底物的体外活性检测和ICso检测显示，TGN-1和TGN-2肤在体外W剂量依赖性方式特异地抑制PTE脚舌性（图2) dC8-P化与其它憐脂分子 (D0PC/D0PS)被引入至PTEN蛋白质中作为合成的脂质囊泡-细胞膜脂质双层的模仿系统。活 性检测结果暗示，TGN-I和TGN-2肤通过直接与PTEN蛋白质相互作用并且干扰PTEN-囊泡膜 关联W防止底物(C8-PIP3)结合PTEN活性位点，可W在体外抑制PTE脚舌性。事实上，代替脂 质体形式而仅直接添加 C-8PIP3脂质的体外PTEN活性检测未能显示出PTE脚舌性(数据未示 出）。与TGN-2肤相比，TGN-3肤的大幅降低的抑制效果表明，丝氨酸残基（Ser380和Ser385) 上的憐酸化修饰是通过TGN-肤体外对口16財巧制的重要因素。另外，在体夕FPTE脚舌性上，TGN-2肤显示出比TGN-I肤近4倍高的抑制效果(TGN-1的ICso值为19.9化M，?及TGN-2为4.83y M ) "TGN-1和TGN-2肤之间的主要结构差异在于TGN-2肤含有PTEN C-末端区域(AA389~ 403)的最后15个氨基酸序列，该序列包括PDZ结构域结合基序(AA 399~403)。由于活性检 巧暢在体外条件下进行的，因此可W解释为，存在于TGN-2肤中的最后15个氨基酸序列提供 了针对PTEN蛋白质的更高的结合亲和力W更有效地干扰PTEN-囊泡膜关联、或者比TGN-1肤 更有效地遮蔽PTEN活性位点中的底物结合口袋。
[003引在神经细胞中，TGN-I肤也有效阻断PTE脚舌性W调节PUK-Akt信号通路（图3)。使 用TGN-I将含有内源性或过表达的PTEN的PC12细胞溫育24小时，并且通过蛋白质印迹使用 抗憐酸化Akt抗体检查Akt蛋白质的活化(憐酸化)水平。使用TGN-I肤处理的细胞裂解物中 的Akt蛋白质的憐酸化水平远高于使用TGN-4肤或DMSO处理的裂解物中的Akt蛋白质的憐酸 化水平，运表明TGN-I肤特异性抑制PTENW括抗PI3K活性。因此，TGN-I肤通过抑制PTE脚舌性 有效促进PUK-Akt信号通路。
[0039] 由于微管稳定化被认为是对于通过促进轴突再生能力和神经元极化治疗脊髓损 伤是关键的[Sengottuvel et 曰1 2011 ,Hellal et 曰1 2011 ,Witte et al2008]，因此我们 采用了诺考达挫在分化的神经元细胞上诱导神经炎性退化并且测试TGN肤是否显示出通过 微管稳定化的神经保护作用。由于微管稳定性与Q-微管蛋白乙酷化水平密切相关 [化kemura et al 1992]，我们使用抗乙酷化a-微管蛋白抗体对稳定的神经突进行免疫染 色。免疫巧光数据（图4A)表明，TGN-I和TGN-2肤实际上稳定了神经突微管结构W延迟神经 突退化。再者，添加 TGN-I肤特异性促进了神经元细胞分化过程的神经突外生长（图4B)。因 此，TGN-I和TGN-2肤显示出神经营养作用W及防止神经突退化的神经保护作用。
[0040] 在先前的研究中，Odriozola et.Al报道，涵盖了PTEN C-末端憐酸化位点簇 (AA368~390)的合成的憐酸化模拟肤(Cp-23，Cp-23DE)，类似于TGN-I肤序列，在体外介导 PTEN催化活性的抑制。另外，使用由GFP融合的憐酸化模拟肤转染的293T细胞的检测显示出 降低的PTEN-膜关联水平W及改善的憐酸化-Akt水平。然而，(Wriozola et al.中使用的憐 酸化模拟肤(Cp-23，CP-23DE)仅模仿了PTEN"憐酸化位点'的AA 368~390区域，但与本TGN 肤不同，其不含有憐酸化的丝氨酸残基。事实上，尽管0化iozola肤(Cp23)和TGN-I肤共享了 几乎相同的氨基酸序列，但是通过比较体外ICsq值(TGN-1的ICsq值为19.9化M，而Cp23为~ 103化M)，TGN-1的抑制效力几乎比0化iozola肤(Cp23)高50倍。另外，0化iozola肤(Cp23, 103化M )与其乱序肤(Cp23-Der,94扣M)之间的ICso值几乎没有差异。然而，TGN-I肤比其乱 序肤TGN-4显示出更高的抑制效果（图2B )，运表明TGN-I肤显示出了对体外PTE脚舌性的序列 特异性抑制作用，而0化iozola肤（Cp23)则未显示出。另外，TGN-2肤不同于(Mriozola肤 (Cp23)在于含有包括PDZ结构域结合基序的额外15个氨基酸残基，已经证明其有效于PTEN 抑制(TGN-2的ICso值为4.93iiM)。此外，TGN-I和TGN-2肤在它们的N-末端包括PTD(肤转移结 构域)序列，W便运些肤可W被直接引入到细胞中，而0化iozola肤需要与GFP融合并转染到 细胞中。因此，TGN-I和TGN-2肤在体外和体内均具有有效的PTEN抑制能力。
[0041 ]我们通过模仿包括"憐酸化位点"的PTEN C-末端区域开发肤。TGN-I和TGN-2在体 外显示出对PTE脚舌性的特异性且有效的抑制作用，并且在神经元细胞中通过阻断PTE脚舌性 而上调PUK-Akt信号通路。由于已知通过PTEN的抑制促进PI3K-Akt-mT0R信号在CNS损伤后 的神经再生中是有效的[Saijila化et曰1 2013]，因此本发明的肤作为CNS损伤的治疗剂 或处理剂是有用的。使用分化的神经元细胞与TGN肤的神经突检测表明，TGN-I和TGN-2肤明 显地显示出神经营养作用W及通过增强神经突微管结构而对退化的神经突的神经保护作 用。因此，运些肤是用于神经损伤(包括CNS损伤)后神经再生W及用于延迟神经退化进展的 治疗目标。
[0042] 肤设计
[0043] 使用PTEN C-末端区域(氨基酸残352~403)作为模板，设计作为?16財巧制剂的本 发明的肤，在本文中也称为叮GN肤"。
[0044] 优选的是，所有的TGN肤均包括PTD(肤转移结构域）序列，其可W在N-末端包括 尺尺1^1^1^(569 10^:2)^提高膜渗透性。
[0045] TGN肤可W是处于PTEN氨基酸序列SEQ ID NO: 1的氨基酸残基352~403内的任何 PTEN片段、或包括PTEN氨基酸序列SEQ ID NO: 1的氨基酸残基352~403的部分作为序列的 一部分的PTEN片段。优选地，TGN肤包括存在于运种肤片段中的丝氨酸或苏氨酸的憐酸化。 优选地，丝氨酸或苏氨酸位点处在PTEN蛋白沈Q ID NO: 1的366、370、380、382、383或385位。
[0046] TGN肤可W为至少10个氨基酸残基的长度，至少15、至少20、至少25、至少30、至少 35或至少40个氨基酸残基的长度。优选的是，肤包括丝氨酸或苏氨酸残基或它们的组合的 至少一个的憐酸化。
[0047] 应当认识到的是，在一个方面，TGN肤不受其肤长度的限制。优选的是，所述肤的至 少一部分驻留在氨基酸残基352~403内。
[004引在运一点上，示例性的TGN-I肤具有24氨基酸，其中S个为憐酸化的丝氨酸残基 VTPD化SD肥PD肌RYpSDTTDpSDPE(沈Q ID N0:3)，pS =憐酸化的丝氨酸）。当PlD被附接在N-末端时，看到具有32个氨基酸残基的RRRRRRRR-VTPDVpSD肥PDHYRYpSDTTDpSDPE-酷胺（SEQ ID N0:4)0
[0049] 另一个示例性的肤是TGN-2肤，其具有28个氨基酸，其中两个为憐酸化的丝氨酸残 基，HYRYpSDTTDpSD阳肥PFD邸QHTQITKWWQ ID NO: 5)。当PlD被附接在N-末端时，看到具有 36个氨基酸残基的RRRRRRRR-HYRYpSDTTDpSD阳肥P抑邸QHTQITKV-酷胺（SEQ ID N0:6)。
[0050] TGN-3肤具有与TGN-2肤相同的氨基酸序列，但是没有经修饰的残基，并且两个丝 氨酸残基被替换为鄉氨酸，肌RYVDTTDVD阳肥P抑抓QHTQITKV(SEQ ID N0:7)。当PTD被附接 在N-末端时，看到RRRRRRRR-HYRYVDTTDVD阳肥P抑邸卵TQITKV-酷胺（SEQ ID NO: 8)。
[0051] TGN-4肤被设计为TGN-I肤的乱序肤S孤EYTDNPDSRYVSDTP VDTEH(沈Q ID N0:9)。 当PTD被附接在N-末端时，看到的是RRRRRRRR-S抓EYTDNPDSRYVSDTPVDT拙-酷胺（SEQ ID NO: 10)。并且TGN-5被设计为TGN-2/TGN-3乱序肤DE皿TEYTPDYR犯THFNSQPTDKSDVI(沈Q ID NO: 11)。当PTD被附接在N-末端时，看到的是RRRRRRRR-DEHDTEYTPDYR犯THFNS QPTDKSDVI-酷胺(SEQ ID N0:12)。
[0052] 化学修饰的肤
[0053] 多肤治疗剂可能具有短的循环半衰期和蛋白水解降解W及低溶解度。为了改善本 发明的生物药物的药代动力学和药效动力学特性，可W实施诸如操纵氨基酸序列等方法W 降低或提高免疫原性和降低蛋白水解裂解;可W将肤融合或偶联到免疫球蛋白和血清蛋 白，诸如白蛋白；还可W并入到用于生物药物(诸如本发明的肤)和抗体的药物递送载体中 W保护并减慢释放;并且还设想了偶联到天然或合成聚合物。具体地，对于合成聚合物偶 联，还设想了聚乙二醇化或酷化，诸如N-酷化、S-酷化、酷胺化等。
[0化4] 神经组织
[0055] 神经组织在脊索的影响下源自胚胎外胚层。外胚层被诱导W形成加厚的神经板， 然后神经板分化并且其端部最终融合W形成神经管，所有的中枢神经系统源自神经管。中 枢神经系统由脑、烦神经和脊髓组成。外周神经系统源自称为神经崎的神经沟附近的细胞。
[0056] 神经组织W-个复杂的综合通信网络分布在整个身体中。神经细胞(神经元)与回 路(从非常简单到非常复杂的高级回路）中的其它神经元通信。神经元进行实际的信息传输 和整合，而被称为神经胶质细胞的其它神经组织细胞通过支持、保持、防护和补养神经元来 协助神经元。在脑中，神经胶质细胞比神经元多约10倍。神经胶质细胞创造神经元功能所需 的微环境，并且有时它们协助神经处理和活动。神经元是兴奋性细胞。运意味着在适当刺激 时，能够启动可W传播跨越细胞膜W传送信息到远处细胞的动作电势。神经元是独立的功 能单元，其负责刺激的接收、传输和加工。
[0057] -般而言，神经元由=部分组成:细胞体，细胞核和细胞器位于细胞体重;树突，其 是由细胞体伸出的从环境或其它神经元接收刺激的突起;和轴突，其是从细胞体伸出的用 于将神经脉冲传送到其它细胞的长的单个突起。轴突通常在其远端枝化并且在另一细胞终 止的每个枝具有球形端。端球与相邻细胞的相互作用形成称为突触的结构。突触专口用于 接收信号并且将其转换为电势。
[0058] 在人体中发现的大多数神经元是多极的，运意味着它们具有多于两个细胞突起， 其中仅有一个是轴突，而其余的突起是树突。视网膜或嗅粘膜的两极神经元具有一个树突 突起和从细胞体脱落的轴突。在脊髓神经节中发现的假单极神经元使得由树突获得的感觉 脉冲能够直接传输到轴突，而无需通过细胞体。神经元可W根据功能来分类。感觉神经元参 与感觉刺激的接收和传送。运动神经元发送脉冲W控制肌肉和腺体。其他神经元、中间神经 元作为功能网络的一部分充当神经元之间的中间网络。
[0059] 突触是专口的功能性细胞接点（junction),用于传播细胞信号。大多数突触是化 学突触，其中突触前末梢中的囊泡含有化学信使，该化学信使在突触前膜被刺激时释放到 突触间隙中。化学信使扩散通过突触间隙W结合到突触后膜中的受体。运诱导突触后膜的 极化状态的改变，影响细胞行为。一种特殊类型的突触是神经肌肉接点。超过35种神经递质 是已知的，并且大多数是小分子(一氧化氮，乙酷胆碱）、儿茶酪胺(去甲肾上腺素，血清素）、 或神经活性肤（内啡肤，血管加压素）。一旦使用，神经递质即通过酶分解、扩散或突触前细 胞的内吞作用而快速地被清除。
[0060] -些神经元被包裹在称为髓銷的绝缘材料中。运种富含脂质的材料由神经胶质细 胞(外周神经系统中的雪旺氏细胞)和中枢神经系统中的少突胶质细胞形成。运种绝缘通过 减少必须经退极化的膜表面积使得能够更快速的神经传导。在有髓銷的神经元中，神经脉 冲跨越轴突的长度从一个无髓銷段跳跃到另一个无髓銷段。正是组织中的髓銷并且缺乏神 经元细胞体使得一些神经组织在较大的外周神经中呈现为白色W及脑的白质。称为星形细 胞的其它神经胶质细胞参与了结构的完整性、神经元营养和维持神经组织的微环境。星形 细胞通过间隙接点与另一星形细胞直接通信，并且通过调节局部环境在神经元的照料中能 够影响神经元的存活。室管膜细胞沿脊髓和脑室排列并且分泌脑脊髓液。称为小胶质细胞 的其它小神经胶质细胞是吞隧细胞，它们与成年中枢神经系统的发炎和修复有关。
[0061] 神经组织是兴奋性组织，其能够接收和传递电脉冲。中央细胞类型被称为神经元。 神经元通常具有细胞体、接收输入的树突、和传递电势的轴突。
[0062] 神经元可W被分类为感觉神经元、运动神经元、分泌神经元或关联神经元。它们通 常通过传导速度、直径和称为髓憐脂的专口化脂蛋白绝缘的存在或不存在来分类。类型A纤 维是有髓銷的并且能够Wl2-120m/s传导脉冲。类型B也是有髓銷的纤维，但是它们仅W3-5m/s传送脉冲。类型C纤维是无髓銷的、直径小且非常慢(2.5m/s)。类型A纤维的一个例子是 支配脾肠肌的运动神经元。自主节前传出神经元是类型B纤维的一个例子，并且携带弥溫性 疼痛信息的感觉神经元是慢类型C纤维的一个例子。
[0063] 感觉神经元适于从环境检测某些类型的信息。运些包括感知压力或拉伸之类的机 械性刺激感受器、溫度感受器、视网膜中的光感受器、和化学感受器(诸如味蕾或用于嗅觉 的那些）。联络神经元或中间神经元通常存在于脊髓和脑中，其中它们将感觉传入神经元连 接到传出运动或分泌神经元。
[0064] 神经元通过称为突触的结构彼此通信。轴突在含有许多小囊泡的一个或多个末端 钮中终止。运些小囊泡充满了称为神经递质的化学物质。虽然依赖于神经元可W使用其它 化学物质如去甲肾上腺素、血清素和GABA，但乙酷胆碱是突触处最通常的神经递质。当脉冲 从轴突向下移动并到达终钮时，囊泡与神经元膜融合并且释放神经递质。然后，化学物质扩 散通过窄突触间隙到接收神经元突触后膜上的该化学物质的特异性接受器。
[0065] 神经递质与接受器的相互作用导致膜电势的改变，膜电势的变化可W诱导出新的 脉冲突触后神经元。酶乙酷胆碱醋酶存在于突触中W分解乙酷胆碱并且终止刺激。其它神 经递质被分解或被带回到突触前神经元W终止刺激。
[0066] 在中枢神经系统中，许多神经元可W聚集在单个神经元上。当突触前神经元的每 个将神经递质释放到其具有突触后神经元的突触中时，出现整合和加和的局部膜电势。运 些输入信号可W是抑制或刺激。如果得到的加和的膜电势达到了神经元的最小阔值，则将 启动动作电势。
[0067] 动作电势通过跳跃性传导在远离细胞体的一个方向上传送。最快速的神经元被覆 盖在髓銷中，髓銷W由称为郎飞氏结的赤裸神经元膜的节点分隔开的离散区段排列。在跳 跃式传导中，电势从一个节点跳跃到一个节点，由此减少参与动作电势传导的膜面积并且 加快传导。
[0068] 在神经系统中发现的非神经细胞被称为神经胶质细胞。星形细胞是最多的并且提 供神经元的支持和营养。小胶质细胞是对神经组织特异的小吞隧细胞。沿脑室系统和脊髓 的中央管排列并且制造脑脊髓液的细胞称为室管膜细胞。在中枢神经系统中，少突神经胶 质细胞形成多个神经元的髓銷的区段。在外周神经系统中，髓銷的每个区段由单一雪旺氏 细胞（schwann cell)形成。
[0069] 中枢神经系统
[0070] 中枢神经系统(CNS)由脑和脊髓组成。除了由骨烦骨和脊椎提供的保护之外，脑膜 (硬脑膜、蛛网膜和软脑膜)也保护和滋养CNS。脑脊髓液存在于珠网膜下腔、脊柱的中央管 和脑室中。软脑膜是最内层并且附着到神经组织。软脑膜和硬脑膜之间是蛛网膜层。坚初的 纤维性硬脑膜恰好位于烦骨下方。
[0071] 脑可W被分为前脑、中脑和脑干=个基本区域。前脑包括丘脑、下丘脑、基底神经 节和大脑。大脑负责意识思维、感觉演绎、所有自愿的运动、屯、智能力和情绪。
[0072] 脑组织可W分为结构区和功能区。大脑的表面被卷积到脑回（脊)和脑沟(槽）。皮 质感觉区域和运动区域可分别映射到中央后回和中央沟。感觉区域接收来自身体的相反侧 的丘脑处理后投射的感觉信息。具有更多感觉神经末梢的身体的那些部分通过更多的皮层 感觉区表示。运动区控制对侧肢体的随意肌运动，但是联合区对于运动的启动是重要的。
[0073] 大脑是脑的最大部分并且被分成具有多个叶片的两个半球，左半球和右半球。额 叶含有运动区、布洛卡言语区、联合区并且发挥智力和行为的功能。顶叶包含感觉区并且发 挥感觉和听觉功能。初级视觉联合区位于枕叶中并且颠叶包含听觉联合、嗅觉和记忆存储。
[0074] 丘脑位于大脑皮层和脑干之间。除了嗅觉之外的所有感觉输入在投射到大脑的其 它区域之前均在此处进行处理。下丘脑位于丘脑下方并且负责处理内部刺激和内部环境的 维护。血压、体溫、屯、率、呼吸、水分代谢、渗透压、饥饿和神经内分泌活动的瞬间无意识的控 制均在此处处理。从垂体后叶释放催产素和ADH的神经内分泌细胞的细胞核位于下丘脑中。
[0075] 基底节(尾状核、苍白球、黑质、丘脑底核、红核)是嵌入大脑的每个半球内的神经 元群体。它们参与控制复杂的运动控制、信息处理和无意识的总量有意运动。
[0076] 脑干包括延髓和脑桥。延髓包含用于控制呼吸、屯、脏和血管舒缩反射的重要功能 区和中继中屯、。脑桥包含参与呼吸调节的呼吸调整中屯、。
[0077] 小脑位于脑干上方并且使用别处发生的有关身体的位置、动作、姿势和平衡的感 觉信息。运动不是在小脑中启动的，但是其对于协调运动是必要的。
[007引外周神经系统
[0079] 外周神经系统包括位于脑和脊髓外部的神经、神经节、脊髓神经和脑神经。十二个 脑神经起因于位于脑干中的核并且传送到携带脉冲的特定位置，W控制各种自主神经功能 如嗅觉、视觉、流诞、屯、率和皮肤感觉。脑神经通常是混合的，因为它们携带感觉和运动成 分，但是它们可W仅具有运动或感觉纤维。下表列出了脑神经W它们的功能。
[0080] 表1-脑神经
[0nRi1
[0082] 外周神经系统的感觉部分接收来自各种类型的接受器的输入，对其加工并且发送 到中枢神经系统。感觉输入可W来自如在本体感觉(关节和肌肉的位置感）中的内部源或来 自如皮肤上的压力或热的感觉的外部源。由特定脊髓神经支配的皮肤区域被称为皮区。传 入纤维收集感觉输入并传送到脊髓，汇聚于丘脑，并最后结束于大脑的感觉皮层。具有更多 感觉接受器的那些区域（即指尖和嘴唇)对应于脑的感觉皮层上的较大区域。携带本体信息 的纤维也被分散到小脑。几乎所有的感觉系统将脉冲传送到丘脑的部分。大脑皮层参与意 识知觉和感觉刺激的解释。
[0083] 通过自主神经和躯体传出神经系统发生向肌肉和腺体的运动输入。关节、肌腫和 肌肉的CN对申经支配经由躯体传出神经系统传输。一些肌肉响应由脊髓反射处理。运样的一 个例子是，当手指接触热炉时看到撤回反射。移除手指的运动在痛觉到达脑之间通过简单 的脊髓反射发生。显然，运是一种保护机制，W避免进一步的损伤。运动输入至腺体和平滑 肌通常经由自主神经系统发生。
[0084] 大部分器官接收来自自主神经系统的两个分支的输入。在该器官或组织中，一个 分支通常是兴奋性的而另一个是抑制性的。自主神经系统的交感神经分支起到为生理压力 准备身体的作用。交感神经分支的刺激像是在身体准备W响应运行或战斗中踩油口。看到 了诸如增加的屯、率、气道扩张和从糖原储备的葡萄糖动员等效果。交感神经从第1脑椎上升 到第4腰椎。它们具有短的节前神经元，节前神经元结束于沿脊柱定位的链节之一中。乙酷 胆碱是在具有长节后神经元的突触处的神经递质，其然后传送到祀组织，此处在大多数交 感神经末梢处释放支甲肾上腺素。少数交感神经节后神经元(诸如支配汗腺或骨骼肌血管 的那些)释放乙酷胆碱。
[0085] 副交感神经分支发挥经由从CNS的头部和紙骨区域出现神经元抵消交感神经分支 的作用。例如，副交感神经刺激收缩气道并降低屯、率。其调节休息活动诸如消化、排尿和勃 起。长节前神经元在接近末端器官的突触处释放乙酷胆碱。短节后神经元也在效应器组织 上释放乙酷胆碱。
[00化]治疗组合物
[0087] 在一个实施方式中，本发明设及用于W神经退行性疾病为特征的各种疾病的治 疗。W运种方式，通过提供抑制神经元退化的化合物，可W将本发明的治疗化合物给予患有 或易于患有该疾病的人类患者。具体地，该疾病与脑的神经变性疾病、神经细胞的损失(特 别是在海马和大脑皮质中）、减少的神经递质、脑血管退化、脊椎中的压碎神经和/或认知能 力的丧失有关。
[0088] 治疗化合物的配制在本领域中一般是已知的并且可W方便地参考Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Co.,Easton,F*a.,美国。例如，每天 每千克体重量可W给予约O.OSiig至约20mg。可W调整剂量方案W提供最佳的治疗反应。例 如，每天可W给予多个分剂量或者可W根据治疗情况的紧急程度所指出的按比例减少剂 量。活性化合物可W W方便的方式给予，例如通过口服、静脉内（在水溶性的情况）、肌内、皮 下、腹腔内、经鼻、皮内或栓剂途径或植入(例如，使用缓慢释放分子通过腹膜内途径或通过 使用细胞(例如体外致敏的单核细胞和树突状细胞)并继转移到接受者）。根据给药途径，可 能需要将肤包覆在材料中W保护其不受酶、酸和可能失活所述成分的其它天然条件的作 用。
[0089] 例如，肤的低亲脂性将使得它们在胃肠道中被能够裂解肤键的酶破坏并且在胃中 被酸水解。为了通过除了肠胃外给予之外的方式给予肤，它们将被材料包覆或与材料一起 给予W防止其失活。例如，肤可W在佐剂中给予，与酶抑制剂一起给予或在脂质体中给予。 本文所考虑的佐剂包括间苯二酪、非离子表面活性剂如聚氧乙締油酸和正十六烷基聚乙締 酸。酶抑制剂包括膜蛋白酶抑制剂、二异丙基氣憐酸醋(DEP)和抑肤酶。脂质体包括水包油 包水CGF乳液W及常规的脂质体。
[0090] 活性化合物也可W胃肠外给予或腹膜内给予。也可W制备处于甘油液体聚乙二 醇、W及它们的混合物或在油中的分散体。在普通的存储和使用条件下，运些制剂含有防腐 剂W防止微生物的生长。
[0091] 适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液(在水溶性的情况下）或分散体和用 于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌 的并且必须是流体，其程度是存在易于注射性。其在制造和存储的条件下必须是稳定的，并 且必须保存防止微生物如细菌和真菌的污染。载体可W是溶剂或分散介质，其含有例如水、 乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）、它们的合适混合物和植物油。通过使 用包衣如卵憐脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂能够维持 适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂可W带来对微生物作用的防止，例如氯下醇、 苯酪、山梨酸、硫柳隶等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钢。通过在组合物 中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸侣和明胶)可W带来可注射组合物的延长吸收。
[0092] 通过将所需量的活性化合物与所需的W上列举的各种其它成分并入到适合的溶 剂中，然后通过无菌过滤，制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种无菌活性成分并入到无 菌赋形剂中制备分散体，该无菌赋形剂含有基础分散介质和所需的来自W上列举的其它成 分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻 干燥技术，其从先前的无菌过滤溶液得到活性成分加任何附加所需成分的粉末。
[0093] 当如上所述适当保护肤时，可W 口服给予活性化合物，例如与惰性稀释剂或与可 同化的可食用载体一起，或其可W被包封在硬或软明胶胶囊中，或者其可W被压缩成片剂， 或其可W被直接并入饮食的食物中。对于口服治疗给药，活性化合物可W与赋形剂合并并 且W可摄入的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、馳剂、悬浮液、糖浆、干胶片等的形式使用。此种 组合物和制剂应当含有按重量计至少1%的活性化合物。当然，该组合物和制剂的百分比可 W改变并且可W方便是为单位重量约5%至约80%。此种治疗有用的组合物中活性化合物 的量是使得会获得适合剂量。优选的根据本发明的组合物或制剂经被制备W便口服单位剂 型含有约0.化g至2000mg的活性化合物。
[0094] 片剂、丸剂、胶囊等可W含有W下成分:粘结剂，如黄著胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或 明胶;赋形剂，如憐酸二巧；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃馨淀粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂 酸儀;并且可W添加甜味剂，如薦糖、乳糖或糖精，或者调味剂诸如薄荷、冬青油、或樓桃调 味剂。当单位剂型是胶囊时，除了 W上类型的材料，其还可W含有液体载体。各种其它材料 可W作为包衣存在或W其它方式修改剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可W包 衣有虫胶、糖或两者。糖浆或馳剂可含有活性化合物、作为甜味剂的薦糖、作为防腐剂的对 径基苯甲酸甲醋和丙醋、染料和调味剂如樓桃或澄调味剂。当然，在制备任何单位剂型中使 用的任何材料均应当是药用纯的并且在使用量上基本上无毒。另外，活性化合物可W被并 入到缓释制剂和配制品中。
[00%]如本文中所使用的，"药学上可接受的载体和/或稀释剂"包括任何和所有的溶剂、 分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将此种介质和试剂用于药物 活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容， 否则可W预期其在治疗组合物中的使用。补充活性成分也可W并入到该组合物中。
[0096] 将肠胃外组合物配制成易于给予且剂量均匀的单位剂型是特别有利的。如本文中 所使用的单位剂型是指适合作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理离散单 元;含有经计算的预定量的活性材料的每个单元与所需的药物载体一起产生所需的治疗效 果。本发明的单位剂型的规格由如下条件决定且直接依赖于如下条件：（a)活性材料的独特 特性和欲实现的特定治疗效果，和(b)为在患有身体健康受损的疾病病况的活受试者中治 疗疾病，复合此种活性成分领域中的固有限制。
[0097] 为了 W有效量方便和有效的给予，将主要活性成分与适合的药学上可接受的载体 复合为单位剂型。例如，单位剂量形式可W含有0.化g至约2000mg的量的主要活性化合物。 W比例表示，活性化合物通常W约0.扣g/ml存在于载体中。在含有补充活性成分的组合物 的情况下，剂量通过参考通常剂量W及所述成分的给予方式来确定。
[009引递送系统
[0099]各种递送系统是已知的并且可W被用来给予本发明的化合物，例如包封在脂质 体、微粒、微胶囊，能够表达该化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用、作为逆转录病毒或 其他载体的一部分的核酸的构建等。引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、 皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。该化合物或组合物可W通过任何方便的途径给予，例如通 过输注或推注、通过上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜等）的吸收、或可 与其它生物活性剂一起给予。给予可W是全身性的或局部的。另外，可W期望通过任何适合 的途径将本发明的药物化合物或组合物引入到中枢神经系统中，适合的途径包括室内和銷 内注射;室内注射可W通过例如附接到胆存器馈如Ommaya胆存器）的室内导管来协助。还 可W采用肺部给予，例如通过使用吸入器或喷雾器W及具有气雾剂的配制品。
[0100] 在一个具体的实施方式中，可W期望将本发明的药物化合物或组合物局部地给予 到需治疗的区域;运可W通过例如但非限制的如下方式实现:在手术过程中局部输注，通过 注射、通过导管的方式、通过栓剂的方式、或通过植入物的方式局部应用（例如与手术后的 伤口敷料一起），所述植入物为多孔、非多孔或凝胶状材料并且包括膜例如娃橡胶膜或纤 维。优选地，当给予蛋白质（包括抗体或本发明的肤）时，必须小屯、使用蛋白质不吸收的材 料。在另一个实施方式中，该化合物或组合物可W囊泡(特别是脂质体)递送。在又另一个实 施方式中，该化合物或组合物可W受控释放系统来递送。在一个实施方式中，可W使用累。 在另一个实施方式中，可W使用聚合材料。在又一个实施方式中，可W将受控释放系统放置 靠近治疗祀(即脑），因此仅需要全身剂量的一小部分。
[0101] 如果组合物的给予可W被受者动物耐受并且适合给予那个动物，那么该组合物可 W被认为是"药理学或生理学上可接受的"。如果给予的量是生理学显著的，那么运样的药 剂可W被认为是W "治疗有效量"给予。如果药剂的存在导致了受者患者生理学可检测的变 化，那么该药剂是生理学上显著的。
[0102] 本发明并不限于本文所描述的【具体实施方式】的范围。确实，除了本文所描述的实 施方式，从W上描述和附图中本发明的各种修改对本领域技术人员而言将是显而易见。此 种修改旨在落入所附权利要求书的范围内。为了说明本发明提供下列实施例，而非限制。
[0103] 实施例
[0104] 实施例1-材料和实验地
[0105] 实施例1.1
[0106] 大鼠肾上腺髓质PC12嗜铭细胞瘤神经元细胞购自ATCC(Manassas，VA)。包括 Dulbecco改良的Eagle氏培养基（DMEM)、胎牛血清（FBS)和马血清的细胞培养材料购自 Mediated! Inc. (Manassas,VA)。2.55神经生长因子购自抓 Biosciences, Inc. (Be壯ord, MA 01730)。抗神经元类IIie-微管蛋白的TUJ-I单克隆兔抗体购自Covance Inc. (Gaithersburg,MD)。抗乙酷化a-微管蛋白的单克隆小鼠抗体购自Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz,CA)。山羊血清Texas民e.d? 山羊抗兔IgG抗体、AlexaFluor?488山羊抗小 鼠 IgG抗体、4'，6-二脉基-2-苯基吗I噪、二乳酸盐(DAPI)和Alamai-Biue" 购自Molecular Probes-Invihogen化Ugene ,OR)。诺考达挫购自 Sigma-Al化ich(St.Louis ,MO)。神经突向 外生长检测试剂盒购自Mi 11 ipore (Bi 1 Ierica ,MA)。所有脂质均购自Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster ,AL 35007)。重组人PTEN蛋白质和孔雀石绿憐酸盐检测试剂盒购 自R&D Systems,Inc. (Minneapolis,MN 55413)。人PTEN C-DNA购自OriGene Inc. (Rockville,MD 20850) eLipofectamine? 2000转染试剂购自 Invit;rogen?DT;ris-甘氨酸 梯度微型凝胶（10~20 % )购自No vex?。所有抗体均购自Santa Cruz Biotechology, Inc. (Santa Cruz,CA 95060)。所有其它材料均购自Fisher Scientific Inc.。
[0107] 实施例1.2-肤设计
[010引使用PTEN C-末端区域(AA352~403)作为模板设计了作为潜在PTEWW制剂的TGN 肤。所有的TGN肤在它们的N-末端包括PTD(肤转移结构域)序列（RRRRRRRR) W增加膜渗透 性。TGN-I肤具有32个氨基酸，其中S个是憐酸化的丝氨酸残基（歷= 4244.18Da，序列： RRRRRRRR-VTPD化SD肥PD肌RYpSDTTDpSDPE-酷胺（SEQ ID N0:4)，pS =憐酸化的丝氨酸）。 TGN-2肤具有36个氨基酸，其中两个是憐酸化的丝氨酸残基（丽= 4776.28Da，序列： HYR化SDTTDpSD阳肥P抑抓QHTQITKV-酷胺（SEQ ID N0:6)，pS =憐酸化的丝氨酸KTGN-3肤 与TGN-2肤具有相同的氨基酸序列，但是没有经修饰的残基并且两个丝氨酸残基被替换为 鄉氨酸（MW = 4640.99Da，序列：RRRRRRRR-肌RYVDTTDVD阳肥P抑抓地TQITKV-酷胺（SEQ ID N0:8))。TGN-4肤被设计为TGN-l肤的乱序肤（MW = 4004.19Da，序列 = RRRRRRRR-SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH-酷胺（SEQ ID NO: 10))，并且TGN-5肤被设计为TGN-2/TGN-3乱 序肤（丽=4616.88Da，序列=RRRRRRRR-DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI-酷胺（SEQ ID NO: 12))。所有的肤均由2ist Cen化巧 Biochemicals Inc. (Mar化oro,MA 01752)合成。纯度 >95%并且由HPLC确认。
[0109] 实施例1.3-体外PTE脚舌性检测
[0110] 设计体外PTEN活性检测W检查将憐脂酷肌醇S憐酸醋(PIP3)转化为憐脂酷肌醇 二憐酸醋(PIP2)并产生憐酸根离子(PO的PTEN脂质憐酸酶活性。将1,2-二辛酷基-Sn-丙S 氧基-3-二氧憐基-(1' -肌-肌醇-3，4，5-S憐酸醋）（C8-PIP3)用作PTEN底物并且与其它憐 脂一起制备为脂质囊泡(脂质体），因为作为脂质憐酸酶的PTEN是界面酶。对于脂质体制备， 将〔8斗1?3、00?5(1，2-二油酷基-311-丙^氧基-憐酸丝氨酸）和00?〔（1，2-二油酷基-311-丙 S氧基-憐酸胆碱)与800化脂质体缓冲液(50mM IYiSilOOmM化Cl ,IOmM MgCb, 5mM DTT, pH=8.0)混合在一起，W得到O.lmM C8-PIP3、0.25mM DOPS和0.25mM DOPC的最终浓度。然 后在4°C下将脂质混合物超声处理30分钟W产生脂质体。超声处理之后，短暂离屯、脂质体溶 '浓W除去残留的脂质。
[01川为了PTEN活性检测，将20ng重组人PTEN蛋白质与40化完成的脂质体溶液混合。将 PTEN检测缓冲液（ImM Tr i S，20mM DTT和0.5 % NP-40，抑=8.0)添加到100化最终体积。然 后，在37°C水浴中将反应混合物溫育30分钟。在溫育之后，使用孔雀石绿憐酸盐检测试剂盒 检测由PTEN蛋白质产生的无机憐酸根离子。首先，将50或100化每种反应混合物转移到96-孔板中并且分别加入10或20化孔雀石试剂A，在室溫下溫育10分钟。在完成溫育之后，再次 向每个样品中加入10或20化孔雀石试剂B，并且在室溫下再溫育20分钟。通过使用分光光度 计在620nm下测量OD(光密度)进行憐酸根离子的检测。为了确定TGN肤（1化M )对重组PTEN 活性的抑制效果，W ImM浓度制备每种TGN肤的DMSO溶液，并且将化L TGN肤溶液与重组PTEN 蛋白质、脂质体和PTEN检测缓冲液混合，并且通过遵循上述协议检测PTE脚舌性。
[0112] 实施例1.4-体外IC50检测
[0113] 通过使用不同浓度的TGN-I和TGN-2肤进行体外PTEN活性检测来测量ICso值。用于 ICso检测的TGN-I或TGN-2肤的浓度范围分别为0.1、l、10、30、60和100i^MW及0.05、0.1、 0.5、1、5、10和10化M。所有数据均代表S重试验并且ICsq值通过Prism 5软件(GrapWad Software)计算。
[0114] 实施例1.5-PC12细胞培养
[0115] 将PC12大鼠嗜铭细胞瘤细胞接种在6-孔板中（0. SxlO6细胞/孔）并且使用含有 7.5 % FBS和7.5 %山羊血清的DMEM培养基进行培养。在细胞汇合度达到约60~70 %后，向 PC12细胞中加入NGF(神经生长因子，50ng/mU W用于分化并且再溫育5天。然后，向每个孔 中加入含有不同量TGN肤的DMSO溶液的新鲜培养基，并且再溫育24小时。为了PTEN过表达， 将PC12细胞接种在6-孔板中（l.OxlO6细胞/孔)并且如上所述使用NGF(50ng/mL)进行分化。 首先通过将2~2.扣g人PTEN C-DNA加入到50化L化ti-MEM中，随向所上述稀释的DNA溶液 中加入3.75-8.7扣L Lipofectamine 2000?试剂，溫和地混合并且在室溫下溫育25分钟，为 每孔转染的细胞制备DNA-Lipofectamine 2000混合物。使用新鲜培养基更换6-孔板中PC12 细胞的生长培养基并且向每孔中加入500化DNA-Lipofectamine 2000复合物W进行转染。 在转染之后，在37°C下在5.0%C〇2溫育箱中将转染的细胞溫育24-48小时，然后检测转基因 表达。
[0116] 实施例1.6-使用PC12细胞的神经突检测
[0117] 在保持在37°C在5%C〇2溫育箱中的T-75cm2烧瓶中，向大鼠肾上腺髓质PCl2大鼠嗜 铭细胞瘤神经细胞补充7.5%牛胎儿血清(FBS)、7.5%马血清化S)和0.5 %青霉素链霉素。 在50%汇合度下溫和机械地从烧瓶脱附细胞W将细胞分离，并且W分离比1:7培植。
[0118] 对于神经突保护检测，W2.OSxlO5细胞/支架的接种密度(凭经验确定为最佳接种 密度)将PC12细胞接种于6-孔板中，并且溫育24-48小时直到细胞汇合度达60~70%。然后， 使用NGF(50ng/mL)将PC12细胞分化72-120小时。为了模仿神经突退化，使用诺考达挫(0.5ii M )处理分化的PC12细胞。在37°C下溫育1小时之后，将含有诺考达挫的旧培养基置换为含 有NGF( lOng/mL)和/或TGN肤（IOOyM作为最终浓度）的新鲜培养基，并且再溫育72小时。通 过W下所述的免疫巧光检测分析残留的神经突。
[0119] 对于神经突向外生长检测，Wl.OxlO5细胞/孔的接种密度将PC12细胞接种于6-孔 板。在细胞汇合度达到60~70%时，通过添加 NGF(50ng/mL)启动PC12细胞的分化。溫育24小 时之后，向6-孔板中的孔中加入TGN肤巧化M作为最终浓度），并且再溫育两天。W分光光度 计使用下述的神经突向外生长试剂盒(Mi Ilipore)对神经突状态定量。
[0120] 实施例1.7-蛋白质印迹
[0121] 在培养之后，从6-孔板中收集PC12细胞，并且使用台式离屯、机离屯、下来W制备细 胞粒料（13,000rpm，在室溫下5min)。弃去上清液，并且使用3~500化Ix PIPA缓冲液 (Invitrogen)再悬浮细胞粒料。通过使用液氮和37°C水浴的冻融循环（3-4次），随后使用 27G针重复喷洒再悬浮的细胞，W裂解再悬浮的细胞。在4°C在10 ,OOOg下将裂解的细胞离屯、 20分钟，并且收集上清液，使用BCA蛋白浓度试剂盒(Thermo Scientific)检测总蛋白质浓 度。
[0122] 使用抗-憐酸化Akt抗体进行蛋白质印迹W检查PC12细胞中内源性Akt蛋白的憐酸 化水平。使用Novex?梯度微型凝胶（10~20%)进行SDS-PAGE。将SDS-PAGE凝胶中的细胞裂 解物样品和蛋白质转移到PVDF膜上，随后使用封闭液(5 %牛乳处在含有0.1 %吐溫-20的IX TBS缓冲液中）溫育。W1:500稀释度(含有0.1 %吐溫-20的IX TBS缓冲液)将抗憐酸化Akt抗 体用作主要抗体。Wl :8000稀释因子将HRP-偶联的抗-兔抗体用作次要抗体。还使用抗PTEN 抗体（1:400稀释因子)检查了内源性或过表达的PTEN蛋白质的表达水平。将0-肌动蛋白的 表达水平检测为负载对照。
[0123] 实施例1.8-神经突定量
[0124] 对于总神经突的定量，我们使用神经突向外生长检测试剂盒(Millipore)与分光 光度计。在37 °C下使用新鲜的细胞外基质化CM)蛋白质（1化g/mL胶原蛋白）将Mi 11 icel 1插 入物(EMD Mi 11 ipore, Bi I Ier i Ca, Massachusetts, USA)的下侧面涂布2小时后，对每个插入 物接种PC12细胞，然后将所述插入物放置在24孔板的每个孔中。将细胞在室溫下保持15分 钟W便附着，然后向每孔中加入总计700iU分化培养基(膜下和膜上分别为GOOiil和10化1)。 使神经突延伸3天，然后使用-200°C甲醇在室溫下将插入物固定20分钟，随后通过新鲜PBS 冲洗。之后，在室溫下将插入物放置在40化1神经突染色液中30分钟，并且在湿润的棉签除 去细胞体之后，将每个插入物放置在10化1神经突染色提取液(Millipore)中。最后，将溶液 转移到96孔板中并且在分光光度计上读取562nm下的吸光度进行定量。
[01巧]实施例1.9-免疫巧光
[0126] 细胞培养后，除去生长培养基，在室溫下使用10%福尔马林将细胞固定15分钟。随 后，使用0.5M甘氨酸在PBS中的溶液洗涂细胞并且在40°C下使用5 %山羊血清和0.2 % 化iton-X在PBS中的溶液封闭过夜。对于使用主要抗体的免疫染色，在40°C下，使用用于总 神经突染色的针对神经元类me-微管蛋白的TJU-I单克隆兔抗体（1: 200稀释）、和用于稳 定神经突染色的针对乙酷化a微管蛋白的单克隆小鼠抗体（1:100稀释度），将细胞溫育过 夜。一旦使用IX PBS缓冲液将细胞洗涂S次后（10分钟/洗涂），加入次要抗体-用于TUJ-I抗 体的Texas反ed@山羊抗兔1此（1:200稀释度）和用于乙酷化a微管蛋白的AlexaFlu〇r?488 山羊抗小鼠 IgG( 1:200稀释度)抗体，并且在40°C溫育过夜。随后，将细胞在IX PBS缓冲液和 化g/ml4'，6-二脉基-2-苯基吗I噪中洗涂S次（10分钟/洗涂），并且在第二次洗涂步骤之后 加入二乳酸盐(DAPI) W染色细胞核。在最终的洗涂后，准备细胞W待使用巧光显微镜检查。 AlexaF山〇r?488-IgG(绿）的激发和发射波长是488nm/519nm，而I'exas民ed?山羊抗兔IgG (红)为595/615皿，并且DAPI为405/461皿。在不同的放大倍数下获取细胞的巧光图像，并且 通过"ImageJ"图像处理和分析程序（Public Domain by Wayne Rasband,NIH,Bethesda, Ma;ryland,USA)进行分析。
[0127] 实施例2-结果
[01 %]实施例2.1-使用PTEN憐酸化位点作为模板设计TGN肤
[0129] 已知体内阻断作为脂质憐酸酶的PTEN活性有效于神经损伤后轴突的再生[Park et.al 2008,化ristie et.al 2012]。我们研究了阳TN-膜关联机理W设计阻断细胞膜表面 上PTEN定位的潜在?16財巧制剂。根据先前的研究[Lee et.al 1999;Leslie et.al 2008]， PTEN蛋白质具有两个功能结构域一憐酸酶结构域和C2结构域一并且还在C-末端区域中具 有"憐酸化位点"，该"憐酸化位点"通过憐酸化-脱憐酸化过程充当控制PTEN蛋白质构象变 化的"开关"[Das et.al 2003;Leslie et.al 2008]。为了PTEN的完全脂质憐酸酶活性，在 "憐酸化位点"的憐酸化的丝氨酸/酪氨酸的脱憐酸化应当发生，W便在PTEN-膜关联之前改 变PTEN构象。经由N-末端PIP2结合基序和C-末端PDZ结构域结合基序的额外结合将PTEN蛋 白质定位于细胞膜上完全PTEN活性所需的适合位置[Walker et.al 2004;Molina et.al2010]。因此，我们决定使用PTEN"憐酸化位点"加上PDZ-结构域结合基序作为模板，用 于设计作为潜在的PTEN抑制剂的TGN肤，其扰乱PTEN-膜关联(图1A)。
[0130] TGN-l肤模仿"憐酸化位点"的氨基酸序列（365-388)，并且TGN-2和TGN-3肤模仿包 括"憐酸化位点"和PDZ结构域结合基序(399-403)的C-末端区域的氨基酸序列（376-403)。 由于"憐酸化位点"中丝氨酸残基的憐酸化对于PTEN构象变化是关键[Leslie et.al 2008; 0化iozola et.al 2007]，所WTGN-I肤被修饰W在"憐酸化位点"内部包括S个憐酸化的丝 氨酸残基（Ser 370、Ser380和Ser385)。TGN-2肤包括两个憐酸化的丝氨酸残基（Ser380和 Ser385)。在TGN-3肤中，两个丝氨酸残基（Ser380和Ser385)被替换为鄉氨酸W用于比较。 TGN-4和TGN-5肤分别被设计成乱序TGN-I和TGN-2肤序列。所有的TGN肤均被修饰W在N-末 端包括八个精氨酸残基作为肤转移结构域(PTD)，从而增加细胞膜渗透性(图1B)。
[0131] 实施例2.2-TGN-1和TGN-2肤示出对体外PTE脚舌性的特异性抑制作用
[0132] 使用体外PTE脚舌性检测测试了合成TGN肤的PTEWW制作用。选择二辛酷基憐脂酷 肌醇3,4,5S憐酸醋（二C8-PIP3)作为PTEN的底物并且用两种不同的憐脂-二油酷憐脂酷胆 碱化0PC)和二油酷基憐脂酷丝氨酸(DOPS)制备脂质囊泡(脂质体）。将脂质与脂质体缓冲液 混合并且通过超声处理变成脂质体（总脂质浓度= 〇.6mM)。使用20ng重组人PTEN蛋白质将 制备的脂质体(0.1 mM二-C8 PIP3)在室溫下溫育30分钟，W通过将C8-PIP3转化为C8-PIP2 并且产生憐酸根离子检测PTEN活性。使用孔雀石绿试剂盒测量由PTEN产生的憐酸根离子 (图2A)。检查IOyM每种TGN肤对PTE脚舌性的抑制作用。如在图2B中看到的，TGN-I肤和TGN-2 肤均显著阻断了PTEN活性（与阳性对照相比，使用TGN-I将PTEN活性降低至54%，而使用 TGN-2将PTE脚舌性降低至31 % )。另一方面，与TGN-I或TGN-2相比，TGN-2肤显著出有限的抑 审Ij (86% )。另外，TGN-4和TGN-5肤均未显示出PTE脚舌性的显著抑制，运表明TGN-I肤和TGN-2 肤的PTEWW制是序列特异性的。使用重组PTEN蛋白质和二C8-PIP3脂质分子的体外PTE脚舌 性检测仅未能显示出PTEN活性(数据未示出）。
[0133] 还W剂量依赖性方式(0~10化M范围）使用体外PTE脚舌性用TGN肤测量了 TGN肤的 ICso值。TGN-I肤、TGN-2肤和TGN-3肤的计算ICso值分别为19.9化M、87.1化M和4.8化M(图 2C)。
[0134] 实施例2.3-TGN-1肤在体内促进PUK-Akt信号通路
[0135] 使用PC12大鼠嗜铭细胞瘤细胞系确定TGN-I肤对神经元细胞中的PI3K信号通路的 影响。在37°C下，使用TGN-I肤（IOiiM和100i^M)或TGN-4肤a化M)将分化的PC12细胞(使用 PTEN C-DNA转染W便PTEN过表达，或处于自然状态)溫育24小时。如在图3A的图表中看到 的，如果TGN-I肤实际上阻断了PTE脚舌性并且抑制了PTEN对PI3K活性的括抗作用，那么PI3K 信号通路中Akt蛋白质的活化(憐酸化)水平应当增加。使用抗-憐酸化Akt蛋白质抗体的蛋 白质印迹数据显示，使用TGN-I肤处理的PC12细胞中内源性Akt蛋白质的活化(憐酸化)水平 WTGN-I肤剂量依赖性方式增加（图3B和图3C)。使用TGN-4肤或DMSO处理的PC12细胞未增加 AKT蛋白质的活化水平，运表明Akt蛋白质憐酸化水平的促进由TGN-I肤特异性的触发。由于 内源性PTEN(图3B)或过表达的PTEN(图3C)的表达水平在使用TGN肤或DMSO处理后未显示出 活性差异，所W很显然，TGN-I肤特异性抑制PTEN活性，从而抑制PTEN对PI3K信号通路的下 调作用，并且促进PUK-Akt信号通路。
[0136] 实施例2.4-TGN-1和TGN-2肤在神经元细胞培养物中显示出神经营养作用，包括神 经保护作用
[0137] 我们在分化的神经元细胞上研究了 TGN肤抵抗神经突退化的作用。通过使细胞与 诺考达挫接触干扰细胞的神经突微管动力学，W在PC12细胞中诱导神经突退化。首先使用 诺考达挫（0.化M)处理分化的大鼠 PC12细胞，并且使用含有NGF(50ng/mL)和TGN肤（IOOy M)的新鲜培养基溫育72小时。使用两种不同的微管蛋白抗体(用于稳定神经突的乙酷化a-微管蛋白抗体和用于总神经突的TUJ-10-微管蛋白抗体)的免疫巧光分析表明，TGN-I肤和 TGN-2版经由微管稳定化明显地延迟了诺考达蜂-诱导的神经突退化（图4A)。我们进一步研 究了TGN版对PC12细胞的神经突向外生长的影响。向正分化的PC12细胞中加入TGN版实际上 促进了神经突发育(通过TGN-I增量2.4倍，且通过TGN-2增量1.6倍，图4B)。综合来看，我们 的TGN-I版和TGN-2版显示了神经营养作用^及保护成熟神经突不退化的活性。
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[0171] 仅使用常规实验，本领域技术人员将认识或能够确定本文具体描述的本发明具体 实施方式的许多等同物。
【主权项】
1. 一种在神经损伤部位再生神经或减弱神经退化的方法，包括在损伤的神经处或附近 区域给予神经再生量或神经退化减弱量的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶抑 制肽。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，PTEN抑制肽是经修饰的PTEN肽或它的片段，其中 磷酸化位点被修饰以便所述磷酸化位点中的丝氨酸或苏氨酸被磷酸化。3. 根据权利要求1所述的方法，其中，磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置!1^-366、36^ 370、Ser-380、Thr-382、Thr-383或Ser-385 〇4. 根据权利要求1所述的方法，其中，磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-370、Ser-380和/或Ser-385。5. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-370、 Ser-380和Ser-385〇6. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-380 和Ser-385〇7. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述肽是磷酸化位点的肽的片段和/或roz结构域 结合基序。8. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述肽进一步包含肽转移结构域(PTD)。9. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述神经损伤处在中枢神经系统中。10. -种肽，所述肽抑制磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶活性。11. 根据权利要求10所述的肽，其中，所述肽是PTEN肽或它的片段，其中磷酸化位点被 修饰以便所述磷酸化位点中的丝氨酸或苏氨酸被磷酸化。12. 根据权利要求11所述的肽，其中，磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置11^-366、36^ 370、Ser-380、Thr-382、Thr-383或Ser-385 〇13. 根据权利要求12所述的肽，其中，所述磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-370、 Ser-380和/或Ser-385。14. 根据权利要求13所述的肽，其中，所述磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-370、 Ser-380和Ser-385〇15. 根据权利要求13所述的肽，其中，所述磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-380 和Ser-385〇16. 根据权利要求11所述的肽，其中，所述肽是磷酸化位点的肽的片段和/或roz结构域 结合基序。17. 根据权利要求11所述的肽，其中，所述肽进一步包含肽转移结构域(PTD)。18. -种增长、增殖或增强神经细胞的细胞活性的方法，包括使所述神经细胞与磷酸酶 和张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶抑制肽接触。
【文档编号】C07K14/47GK105873942SQ201480072117
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年11月4日
【发明人】李宽熙, 卢文钟, 光伍克·安
【申请人】组织基因公司