临时吸附至铝佐剂上的流感疫苗的制作方法

专利名称：：临时吸附至铝佐剂上的流感疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明属于用佐剂配制疫苗来提供保护以抵御流感病毒感染的领域。技术背景除了希龙疫苗公司(ChironVaccines)的FLUAD产品包含水包油乳液佐剂外，目前使用的流感疫苗通常未用佐剂配制。参考文献1的第17和18章详细描述了这些疫苗。它们基于活病毒或灭活的病毒，灭活疫苗可以基于完整的病毒、"裂解"病毒或纯化的表面抗原(包括血凝素和神经氨酸酶)。近年来，有人提出可将铝盐佐剂纳入流感疫苗中(例如，见参考文献2-5)。除了生产期间需要额外的混合步骤以致于总体生产(速度)减缓外，纳入这些盐还与各种问题有关。例如，由于它们不可溶使得吸附的抗原从混悬液中沉淀下来，因此从散装疫苗制备各剂量要格外小心。此外，抗原与盐类的结合使得最终疫苗的质量控制变得复杂。特别是，一些流感疫苗的效力测试所依据的体外免疫测定要求抗原未结合，即吸附到佐剂上表示无采用这些测试。本发明的目的是提供佐剂配制的其它改进流感疫苗(对于流行期和流行间期使用)和它们的制备方法。
发明内容按照本发明，不在生产期间混合佐剂配制的流感疫苗的抗原和佐剂组分，而是作为单独的组分提供，在使用时临时混合。本发明有效的原因只是在于发现(参见本文的实施例)抗原与佐剂的吸附基本上瞬间发生并且在疫苗接种期间所经历的条件下不可逆。因此，本发明能避免在生产期间实施混合所产生的各种问题。因此，本发明提供的试剂盒装有(i)包含流感病毒抗原的抗原组分；和(ii)包含铝盐的佐剂组分。组分(i)不包含铝盐佐剂，组分(ii)不包含流感病毒抗原。本发明还提供(i)包含流感病毒抗原的抗原组分，和(ii)包含铝盐的佐剂组分，二者同时分别使用或顺序使用。本发明还提供包含流感病毒抗原和铝盐佐剂的免疫原性组合物，在使用时临时混合抗原和佐剂来制备该组合物。本发明还提供制备流感疫苗的方法，该方法包括以下步骤(i)制备包含流感病毒抗原的抗原组分；(ii)制备包含铝盐的佐剂组分；和(iii)将该抗原和佐剂组分组合置于试剂盒中。该方法还可提供步骤(iv)混合该抗原和佐剂组分以给予患者，但步骤(iv)通常由卫生保健专业人员而非生产人员实施。本发明还提供制备和给予流感疫苗的方法，该方法包括以下步骤(i)混合试剂盒的诸组分，该试剂盒装有包含流感病毒抗原的抗原组分和包含铝盐的佐剂组分；和(ii)将混合的组分给予患者。该方法通常包括振荡佐剂组分以分散任何沉淀的铝盐；将抗原组分无菌加入佐剂组分；翻转或轻柔振荡混合的组分；将混合的组分抽入注射器；将混合的组分给予患者。给予患者通常在混合后24小时以内(例如，S18小时、$12小时、S6小时、S3小时、S2小时、小时、S30分钟、S20分钟、S10分钟、S5分钟、S2分钟、Sl分钟，等等)进行。试微本发明的试剂盒装有两种组分，一种含有抗原，一种含有佐剂。这两种组分在试剂盒中分别存放直至决定要制备疫苗来给予患者，此时混合诸组分从而获得抗原吸附到佐剂上的疫苗。因此，这两种组分在试剂盒内彼此物理分离，可采用各种方法实现这种分离。例如，可将这两种组分放在不同的容器，例如小瓶中。然后可例如通过取出一个小瓶的内含物，将其加入另一小瓶，或通过分别取出两小瓶的内含物，将它们在第三个容器中混合来混合这两小瓶的内含物。在一优选的配置中，试剂盒组分之一装在注射器中，另一组分装在容器，例如小瓶中。可利用预填充的注射器(例如，装有针头)将其内含物插入第二容器中来混合，然后将混合物抽入该注射器中。随后将该注射器中的混合内含物给予患者，通常利用新的无菌针头。因此，将一种组分包装在预填充的注射器中无需利用另一注射器实施患者给药。在另一优选配置中，将两种试剂盒组分分别装在同一注射器，例如双室注射器中，如参考文献6-13等所披露的。使用该注射器(例如，给予患者期间)之时即混合了该两室中的内含物。该配置在使用时无需单独的混合步骤。两室中的内含物通常均是水性形式。在一些配置中，组分之一(一般是抗原组分而不是溶液组分)处于干燥形式(例如，冻干的形式)，另一组分处于水性形式。可以混合所述两种组分以再活化干组分，从而获得给予患者的水性组合物。在其它次选的配置中，两种组分均处于干形式。冻干组分通常保存于小瓶而不是注射器内。干燥的组分可以包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖或甘露醇以及它们的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一种优选的配置利用装在预填充注射器中的水性佐剂组分，而将冻干抗原组分装在小瓶中。如果两种组分均是水性的，可以各种体积比，例如l:5(水性抗原体积过量)和5:1(水性佐剂体积过量)之间混合它们。优选1:2和2:1之间的比例，例如约1:1。用于试剂盒的合适容器包括小瓶和一次性注射器。这些容器应是无菌的。如果组分装在小瓶中，小瓶优选由玻璃或塑料材料制成。优选先使小瓶灭菌再加入组合物。为避免患者对乳胶过敏的问题，优选用无乳胶的塞子密封小6瓶，优选所有包装材料均不含乳胶。小瓶可装有单剂量疫苗，或可装有多剂量("多剂量"小瓶)，例如10份剂量。优选用无色玻璃制成小瓶。一般给予的流感疫苗的剂量体积是约0.5ml，虽然可将半剂量(即，约0.25ml)给予儿童。可给容器做上显示半剂量体积的标记，以有助于递送给儿童，例如，含有0.5ml剂量的注射器可具有显示0.25ml体积的标记。小瓶可装有盖子(例如，Luer锁扣)，从而可将预填充的注射器插入盖子中，将注射器的内含物推入小瓶中(例如，重建其中的冻干材料)，再将小瓶的内含物抽回注射器中。将注射器从小瓶中取出后，装上针头，将组合物给予患者。优选使盖子位于封口或覆盖物内，从而要先除去封口或覆盖物再接触盖子。小瓶可具有盖子，从而能无菌取出其内含物，特别是对于多剂量小瓶。如果要将某组分包装入注射器，注射器可装有针头。如果未装针头，可随注射器提供单独的针头用于装配和使用。这种针头可以是有鞘的。优选安全针头。常见的是1英寸23号、l英寸25号和5/8英寸25号针头。注射器可装有可剥离标签，其上打印了内含物的批号和有效期，从而有助于记录保管。注射器的柱塞优选具有塞子，从而能防止柱塞在抽吸期间意外掉出。注射器可装有乳胶橡胶盖子和/或柱塞。一次性注射器可含有单剂量疫苗。在装上针头之前，注射器一般装有针帽以密封顶端，所述针帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则优选给针头装有丁基橡胶罩。优选的注射器是以"Tip-Lok"TM为商品名投入市场的那些。如果使用玻璃容器(例如，注射器或小瓶)，则优选使用硼硅酸玻璃而不是钠钙玻璃制成的容器。试剂盒可装有(例如，装在同一盒子中)插页，该插页包含疫苗的细节，例如给药的使用说明书，疫苗中抗原的细节等。使用说明书还可包含警告，例如准备肾上腺素溶液以防疫苗接种后的过敏反应，等等。试剂盒优选保存在2'C-8'C之间。不应冷冻它们。流麟就嚴试剂盒诸组分之一包含流感病毒抗原。通常可从流感病毒颗粒制备这些抗原，或者可在重组宿主(例如，利用杆状病毒载体的昆虫细胞)中表达诸如血凝素等抗原并以纯化形式使用[14、15]。然而，抗原一般来自病毒颗粒。抗原可采用活病毒，或者更优选灭活病毒的形式。灭活病毒的化学方法包括用有效量的一种或多种以下试剂处理洗涤剂、甲醛、福尔马林、|3-丙内酯或紫外光。灭活的其它化学方法包括用亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或它们任何的组合处理。本领域知道灭活病毒的其它方法，例如二元乙胺(binaryethylamine)、乙酰基乙烯亚胺或Y射线。INFLEXAl/M产品是完整的病毒颗粒灭活疫苗。如果使用灭活病毒，疫苗可包含完整的病毒、裂解病毒或纯化的表面抗原(包含血凝素，通常还包含神经氨酸酶)。可通过各种方法从含病毒的液体收集病毒颗粒。例如，纯化方法可包括利用线性蔗糖梯度溶液的区带离心，所述蔗糖溶液含有洗涤剂以使病毒颗粒破裂。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。用洗涤剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三-N-丁酯、曲通X-IOO、曲通NIOI、溴化十六烷基三甲铵、TergitolNP9，等等)处理病毒颗粒，包括"吐温-醚"裂解方法来产生亚病毒颗粒制品，从而获得了裂解病毒。本领域熟知裂解流感病毒的方法，例如参见参考文献16-21等。通常利用破裂浓度(disruptingconcentration)的裂解剂(splittingagent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎来进行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白质完全或部分溶解，从而改变了病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子和离子性(例如，阳离子)表面活性剂，例如烷基糖苷、垸基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯垸基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、海克麦格(Hecameg)、垸基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠、CTAB(溴化十六垸基三甲铵)、磷酸三丁酯(tri-N-butyl-phosphate)、塞太弗伦(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基铵盐、脂转染试剂、脂转染胺、DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，裂解发生在最初的病毒颗粒纯化期间(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。因此裂解方法可包括使含病毒颗粒的物质澄清(以除去非病毒颗粒物质)，浓縮收集的病毒颗粒(例如，采用吸附法，如CaHP04吸附)，分离完整病毒颗粒与非病毒颗粒物质，在密度梯度离心步骤中利用裂解剂裂解病毒颗粒(例如，利用含有裂解剂，如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度(溶液))，然后过滤(例如，超滤)以除去不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒有用地重悬在磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVAC、FLUARIX、FLUZONE禾BFLUSHIELD产品是裂解疫苗(splitvaccine)。纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常还包含神经氨酸酶。本领域熟知制备纯化形式的这些蛋白质的方法。FLUVIRINTM、AGRIPPAL和INFLUVACTM产品是亚单位疫苗。除HA和NA以外的流感蛋白也可用作流感抗原，包括天然蛋白质的片段。还可使用它们的组合。流感抗原还可以病毒体形式存在[22]。流感病毒可以是减毒的。流感病毒可以对温度敏感。流感病毒可以是冷适应的。这三种可能性特别适用于活病毒。用于疫苗中的流感病毒毒株每季不同。在目前的流行间期，疫苗通常包含两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明还可利用流行毒株(即，对疫苗受者和普通人群而言免疫原初的毒株)的病毒，例如H2、H5、H7或H9亚型毒株(特别是甲型流感病毒)，流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以添加了流行毒株的普通三价疫苗为基础。然而，取决于季节和疫苗所含抗原的性质，本发明可起保护作用以抵御以下一种或多种甲型流感病毒HA亚型Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16。本发明的佐剂配制的组合物特别适用于免疫接种以抵御流行毒株。能导致流行病爆发的流感毒株的特征在于(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，其含有新的血凝素，即，未在人群中出现超过10年的毒株(例如，H2)，或者以前根本未在人群中见到的毒株(例如，通常只在鸟群中发现的H5、H6或H9)，从而使得人群对该毒株的血凝素而言在免疫学上是原初的；(b)其能在人群中水平转移；和(C)其对人具有致病性。对于免疫接种抵御流行性流感，优选具有H5血凝素类型的毒株，例如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，及任何其它可能出现的流行毒株。在H5亚型内，病毒可能属于HA进化枝1、HA进化枝1'、HA进化枝2或HA进化枝3[23],其中进化枝l和3特别相关。可有用地包含在这些组合物中的其它毒株是耐受抗病毒治疗的毒株(例如，耐受奥塞米韦[24]和/或扎那米韦)的毒株，包括耐药性流行毒株[25]。本发明组合物可包含一种或多种(例如，1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。如果疫苗包含多种流感毒株，通常分别培养不同的毒株，收集病毒后混合来制备抗原。因此，本发明方法可包括混合多种流感毒株的抗原的步骤。优选包含两种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株的抗原的三价疫苗，虽然单价疫苗也有用(例如，对于流行毒株)。流感病毒可以是重配毒株，可通过反向遗传学技术获得。反向遗传学技术[例如，26-30]能利用质粒在体外制备含所需基因组区段的流感病毒。该技术通常涉及表达(a)例如能从poll启动子编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如能从polll启动子编码病毒蛋白质的DNA分子，从而使得在细胞中表达两种类型的DNA能装配完整的感染性病毒颗粒。DNA优选能提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能利用辅助病毒提供所述RNA和蛋白质中的一些。优选质粒方法，从而能用不同质粒产生各病毒RNA[31-33]，这些方法还包括利用质粒来表达所有病毒蛋白质或其中一些(例如，PB1、PB2、PA和NP蛋白质)，一些方法利用了12种质粒。为减少所需的质粒数，最近的方法[34]在同一质粒上组合了多个RNA聚合酶I转录盒(对于病毒RNA合成)(例如，编码l、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感vRNA区段的序列)，在另一质粒上组合了含RNA聚合酶II启动子的多个蛋白质编码区(例如，编码1、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感mRNA转录物的序列)。参考文献34所述方法的优选方面包括(a)单独质粒上的PB1、PB2和PAmRNA编码区；和(b)单独质粒上的所有8个vRNA编码区10段。包含一个质粒上的NA和HA区段和另一质粒上的6个其它区段也是有利的。除了用poll启动子编码病毒RNA区段，还可能用细菌噬菌体聚合酶启动子[35]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。由于poll启动子的种类特异性，细菌噬菌体聚合酶启动子对于许多细胞类型(例如，MDCK)更方便，虽然还必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。其它技术可能采用双重poll和polll启动子来同时编码一个模板的病毒RNA和可表达的mRNA[36、37]。因此，病毒(特别是甲型流感病毒)可包含A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(通常是A/PR/8/34的6个区段，其中HA和N区段来自疫苗毒株，即6:2重配株)，特别是用卵培养病毒时。还可包含用于生产疫苗制备用重配病毒的A/WSN/33病毒或任何其它病毒毒株的一个或多个RNA区段。通常，本发明保护抵御能人向人传播的毒株，因此毒株的基因组一般包含源自哺乳动物(例如人)流感病毒的至少一个RNA区段。其可包含源自禽流感病毒的NS区段。可用SPF卵或细胞培养物培养用作抗原来源的病毒。目前培养流感病毒的标准方法利用含胚的鸡蛋以及从鸡蛋内含物(尿囊液)中纯化病毒。然而，近年来用动物细胞培养物培养病毒，出于速度和患者变态反应的原因，优选该培养方法。如果采用鸡蛋培养病毒，则可将病毒与一种或多种氨基酸一起引入鸡蛋的尿囊液中[18]。细胞物质通常是哺乳动物细胞系。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于仓鼠、牛、灵长类(包括人和猴)和犬细胞。可利用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是，例如非洲绿猴细胞，例如Vero细胞系中的肾细胞。合适的犬细胞是，例如MDCK细胞系中的肾细胞。因此，合适的细胞系包括但不限于MDCK;CHO;293T;BHK;Vero;MRC-5;PER.C6;WI-38;等等。利用哺乳动物细胞表示疫苗可以不含卵蛋白质(例如，卵白蛋白和卵类黏蛋白)和鸡DNA，从而能降低变应原性。用于培养流感病毒的优选哺乳动物细胞系包括源自马-达二氏犬肾的MDCK细胞[38-41];源自非洲绿猴(Cem;/^ec^a"/n'o;w)肾脏的Vero细胞[42-44];或源自人胚胎成视网膜细胞的PER.C6细胞[45]。这些细胞系可广泛购自，例如美国模式培养物保藏所(ATCC)[46]、寇里尔细胞保藏中心(CoriellCellRepositories)[47]或欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587的各种不同Vero细胞，目录号为CCL-34的MDCK细胞。PER.C6可以保藏号96022940购自ECACC。作为哺乳动物细胞系的次选替代，可用禽细胞系培养病毒[例如，参考文献48-50]，包括源自鸭(例如，鸭视网膜)或母鸡的细胞系，例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)，等等。例子包括禽胚胎干细胞[48、51]，包括包括源自鸡胚胎干细胞的EBx细胞系、EB45、EB14和EB14-074[52]。培养流感病毒的最优选细胞系是MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可以CCL-34购自ATCC，但也可使用该细胞系的衍生物。例如，参考文献38披露了适应于在悬浮培养基中生长的MDCK细胞系("MDCK33016"，以DSMACC2219保藏)。类似地，参考文献53披露了生长在无血清培养悬液中的MDCK衍生细胞系("B-702"，以FERMBP-7449保藏)。参考文献54披露了非致瘤性MDCK细胞，包括"MDCK-S"(ATCCPTA-6500)、"MDCK-SF101"(ATCCPTA-6501)、"MDCK-SF102"(ATCCPTA-6502)和"MDCK-SF103"(PTA-6503)。参考文献55披露了对感染高度敏感的MDCK细胞系，包括"MDCK.5F1"细胞(ATCCCRL-12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。如果利用哺乳动物细胞系培养病毒，则试剂盒中的抗原组分优选不含卵蛋白质(例如，卵白蛋白和卵类黏蛋白)和鸡DNA，从而能降低变应原性。如果用细胞系培养病毒，则生长培养基以及用于启动培养的病毒接种物优选不含(即，经测试得到污染的阴性结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[56]。特别优选不含单纯疱疹病毒。如果用细胞系培养病毒，则每剂中抗原组分优选含有少于10ng(优选少于1ng，更优选少于100pg)的残留宿主细胞DNA，虽然可以存在痕量的宿主细胞DNA。可采用标准纯化方法，例如层析等在疫苗制备期间除去污染性DNA。通过核酸酶处理，例如用DNA酶可促进除去残留的宿主细胞DNA。参考文献57和58披露了减少宿主细胞DNA污染的便利方法，其涉及两步处理，首先可在病毒培养期间使用DNA酶(例如，Benzonase)，然后可在病毒颗粒破裂期间使用阳离子洗涤剂(例如，CTAB)。垸化剂，例如P-丙内酯处理也可用于除去宿主细胞DNA，该方法还可优选用于灭活病毒颗粒[59]。优选每15pg血凝素中含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗，例如每0.25ml体积含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗。更优选每50吗血凝素中含有〈10ng(例如，<lng、〈100pg)宿主细胞DNA的疫苗，例如每0.5ml体积含有〈10ng(例如，<1ng、〈100pg)宿主细胞DNA的疫苗。优选任何残留宿主细胞DNA的平均长度短于500bp，例如短于400bp、短于300bp、短于200bp、短于100bp，等等。对于用细胞系，例如MDCK细胞培养，可用悬液培养[38、60、61]或贴壁培养的细胞来培养病毒。用于悬液培养的一种合适的MDCK细胞系是MDCK33016(保藏号为DSMACC2219)。或者，可采用微载体培养。优选用无血清的培养基和/或无蛋白质的培养基培养支持流感病毒复制的细胞系。本发明将其中不含人或动物来源的血清添加剂的培养基称为无血清培养基。无蛋白质应理解为表示发生细胞增殖的培养基中不含蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质，但可包含病毒生长所需的蛋白质，例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在这种培养基中生长的细胞自身可天然含有蛋白质。支持流感病毒复制的细胞系优选在37。C以下生长[62](例如，30-36°C，或约3(TC、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C)，例如在病毒复制期间。在培养的细胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步骤给培养的细胞接种待培养的毒株，将受感染的细胞培养病毒繁殖所需的时间，例如通过病毒滴度或抗原表达测定的(如，接种后24-168小时)，收集繁殖的病毒。以病毒和细胞之比为1:500-1:1，优选1:100-1:5，更优选1:50-1:10(通过PFU或TCIDso检湖U)13接种培养的细胞。可将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，病毒于25-40°C，优选28-37t:,在细胞上吸附至少60分钟，但通常少于300分钟，优选在90-240分钟之间。可通过冻融或酶促作用除去感染的细胞培养物(例如，单层)，从而增加了收集的培养上清液中的病毒含量。然后使收集的液体灭活或冷冻保存。以约0.0001—10，优选0.002-5，更优选0.001-2的感染复数("m.o.i.")感染培养的细胞。更优选以约O.Ol的m.o.i.感染细胞。可在感染后30-60小时收集感染的细胞。优选在感染后34-48小时收集细胞。更优选在感染后38-40小时收集细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以释放病毒，可在培养期间的任何合适阶段加入蛋白酶。血凝素(HA)是灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考HA水平使疫苗剂量标准化，一般通过单向辐射状免疫扩散(SRID)试验检测。疫苗通常含有约15pgHA/毒株，虽然在例如儿童，或流行情况下可使用较低的剂量。与较高剂量(例如，3X或9X剂量[63、64])—样，已使用了部分剂量，例如V2(即，7.5|agHA/毒株)、"4和1/8[4、5]。因此，疫苗可包含0.1-150pgHA/流感毒株，优选0.1-50pg，例如0.1-20pg、0.1-15pg、0.1-10pg、0.1-7.5pg、0.5-5pg，等等。具体的剂量包括，例如约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5/毒株，等等。与本发明一样，当疫苗中存在佐剂时，这些较低的剂量最有用。对于活疫苗，通过中值组织培养感染剂量(TCID5o)而不是HA含量来检测给药，每种毒株的TCID5o—般在106-108之间(优选1065-1075)。本发明所用的HA可以是病毒中发现的天然HA，或者可经修饰。例如，已知可修饰HA以除去致使病毒在禽类中高度致病的决定簇(例如，围绕HA1和HA2之间的切割位点的超碱性区域(hyper-basicregion))，否则这些决定簇可阻止病毒在卵中生长。本发明试剂盒的抗原组分可包含洗涤剂，例如聚氧乙烯失水失水山梨糖醇酯表面活性剂(称为"吐温")，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六垸基三甲铵(CTAB)，或脱氧胆酸钠，特别是对于裂解或表面抗原疫苗。可以只存在痕量的洗漆剂。因此，疫苗中所含的辛苯聚醇-10、oc-生育酚半琥珀酸酯(cc-tocopherylhydrogensuccinate)和聚山梨醇酯80各自低于1mg/ml。其它痕量的残留组分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。灭活但非全细胞的疫苗(例如，裂解病毒疫苗或纯化的表面抗原疫苗)可包含基质蛋白，从而受益于位于该抗原内的其它T细胞表位。因此，包含血凝素和神经氨酸酶的非全细胞疫苗(特别是裂解疫苗)还可包含Ml和/或M2基质蛋白。如果存在基质蛋白，优选包含可检测水平的M2基质蛋白或M1蛋白的片段。还可存在核蛋白。乾浙流感疫苗中所用的佐剂包括脱乙酰壳多糖[65]，水包油乳液，例如MF59[66]，水包油包水乳液[67],铝盐[2、5]，CpG寡脱氧核苷酸，例如CpG7909[68]，大肠杆菌热不稳定毒素[69、87]及其脱毒突变体[70-71]，单磷酰脂质A[72]及其3-o-脱酰基衍生物[73]，百日咳毒素突变体[74]，胞壁酰二肽[75]，等等。然而，本发明的佐剂组分基于铝盐。这些盐包括称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是惯常的，但只是为方便而使用，并未精确描述其实际的化学构成[例如，见参考文献76的第9章]。本发明可用常规用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟基氧化铝盐，其通常至少部分结晶。羟基氧化铝以分子式A10(OH)表示，其与其它铝化合物，例如氢氧化铝Al(OH)3的区别在于红外(IR)光谱，特别是在1070cm"处存在吸收带和在3090-3100cm'1处存在强烈的肩峰[参考文献76的第9章]。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形态(例如，电子透射显微照片所见的)。氢氧化铝佐剂的pl通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH7.4时，氢氧化铝佐剂的吸附能力在每11^八1+++1.8-2.6mg蛋白质之间。称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷酸铝，这些佐剂也常含有少量硫酸根(即，羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代该盐中羟基的程度。羟基磷酸盐中P04/A1摩尔比通常在0.3-1.2之间。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的A1P04。例如，3164cm—1的IR光谱带(例如，当加热至20(TC时)表明存在结构性羟基[参考文献76的第9章]。磷酸铝佐剂的PCVA产摩尔比通常在0.3-1.2之间，优选在0.8-1.2之间，更优选0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，特别是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PCVA产摩尔比在0.84-0.92之间，含0.6mgAl3Vml的无定形羟基磷酸铝。磷酸铝通常是颗粒状的(例如，电子透射显微照片中所见的平板样颗粒)。这些颗粒在吸附任何抗原后的典型直径是0.5-20pm(例如，约5-10nm)。据报道，pH7.4时，磷酸铝佐剂的吸附能力在每11^八1+++0.7-1.5mg蛋白质之间。磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度成反比，而该取代程度依据沉淀制备该盐所用的反应条件和反应物浓度而不同。也可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(磷酸根越多=PZC酸性越高)或通过添加例如组氨酸缓冲液(使得PZC更具碱性)等缓冲液来改变PZC。本发明所用磷酸铝的PZC通常在4.0-7.0之间，更优选在5.0-6.5之间，例如约5.7。用于制备本发明组合物的铝盐悬液可含有缓冲液(例如，磷酸或组氨酸或Tris缓冲液)，但不一定。这些悬液优选无菌、无热原。悬液可含有游离的水性磷酸根离子，例如浓度在1.0-20mM之间、优选在5-15mM之间、更优选约10mM。这些悬液也可含有氯化钠。在本发明的一个实施方式中，佐剂组分包含氢氧化铝和磷酸铝的混合物[4]。在这种情况中，磷酸铝可能多于氢氧化铝，例如重量比至少为2:1，例如^5:1、26:1、^7:1、28:1、29:1，等等。给予患者的组合物中A广+的浓度优选低于10mg/ml，例如S5mg/ml、mg/ml、S3mg/ml、^2mg/ml、S1mg/ml，等等。优选的范围在0.3-1mg/ml之间。优选最大〈0.85mg/剂。除了一种或多种铝盐佐剂，佐剂组分还可包含一种或多种其它佐剂或免疫刺激剂。这种其它组分包括但不限于3-0-脱酰基单磷酰脂质A佐剂("3d-MPL");和/或水包油乳液。3d-MPL也称为3-脱-0-酰基单磷酰脂质A或3-0-脱酰基-4，-单磷酰脂质A。该名称表明单磷酰脂质A中还原端葡糖胺的3位脱酰基。其由明尼苏达沙门菌(Sa/mo"e〃flw'朋Moto)的无庚糖(heptoseless)突变体制备，其化学结构类似于脂质A但缺乏酸不稳定的磷酰基和碱不稳定的酰基。它能激活单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，刺激释放几种细胞因子，包括IL-1、IL-2、TNF-a和GM-CSF。制备3d-MPL最初描述于参考文献77，该产品由考里克萨公司(CorixaCorporation)生产并以商品名MPlJM出售。其它细节见参考文献78-81。最后，在本发明的其它实施方式中，用钙盐取代铝盐。在这些实施方式中，佐剂组分通常包含磷酸钙盐。莎欽遂^激试剂盒的抗原组分和佐剂组分是药学上可接受的，它们混合所得的产品也一样。混合的产品可包含除抗原和佐剂以外的组分，这些组分可源自抗原组分和/或佐剂组分和/或任选的第三组分。因此，最终的混合物通常包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。对这些载体和赋形剂的充分讨论见参考文献82。最终的混合物可包含防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。然而，这些疫苗优选基本上不含(即，少于5pg/ml)汞物质，例如不含硫柳汞[17、83]。更优选不含汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。优选包含生理盐，例如钠盐以控制张力。优选1-20mg/ml之间的氯化钠(NaCl)。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸氢二钠(disodiumphosphatedehydrate)、氯化镁、氯化韩等。组合物可包含柠檬酸离子。给药组合物通常具有200mOsm/kg-400mOsm/kg之间的重量克分子渗透压浓度，优选240-360mOsm/kg，更优选290-310mOsm/kg。以前曾报道说重量克分子渗透压浓度对疫苗接种所致疼痛没有影响[84]，但仍优选将重量克分子渗透压浓度维持在此范围内。给药组合物可包含一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括磷酸缓冲液；Tris缓冲液；硼酸缓冲液；琥珀酸缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸缓冲液。所含的缓冲液范围一般是5-20mM。给药组合物的pH通常在5.0-8.1之间，更常见在6.0-8.0之间，例如6.5和7.5之间，或7.0和7.8之间。因此，本发明方法可包括先调节散装疫苗的pH再包装的步骤。试剂盒各组分，包括容器，优选无菌。试剂盒组分优选无热原，例如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。试剂盒组分优选无谷蛋白。试剂盒组分可包含一次免疫的物质，或可包含多次免疫的物质(即，"多剂量"试剂盒)。因此，例如可在一个容器中装有10份剂量的抗原，在第二个容器中装有10份剂量的佐剂。手术期间，在使用之日的早晨混合该两种组分，从而在该天中将10份剂量给予一系列患者。将各剂量抽入给药用的注射器。在多剂量配置中，优选包含防腐剂。除了在多剂量组合物中包含防腐剂以外，还可将组合物置于装有用于转移物质的无菌适配器的容器中。浙方法微舰舒混合后，本发明组合物适合给予人类患者，本发明提供在患者体内产生免疫应答的方法，包括将本发明的组合物给予患者的步骤。本发明还提供试剂盒，或者用作药物的本发明组合物。本发明还提供(i)流感病毒抗原和(ii)包含铝盐的佐剂组分在制备用于在患者体内产生免疫应答的药物中的应用，其中所述药物包含作为分离组分的抗原和佐剂。这些方法和应用产生的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。本领域熟知在流感病毒疫苗接种后评估抗体应答、中和能力和保护作用的方法。人类研究证明针对人流感病毒血凝素的抗体滴度与保护作用有关(血清样品血凝反应-抑制滴度约30-40时，对同源病毒感染的保护作用约为50%)[85]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单辐射免疫扩散(SRID)和/或单向辐射状溶血(SRH)检测抗体应答。本领域熟知这些试验技术。可以各种方法给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(例如，注射入手臂或腿中)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[86-88]、口服[89]、真皮内[90、91]、透皮、经皮[92]等。本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成年人。流感疫苗目前推荐用于儿科和成年人免疫接种，年龄自6个月起。因此，患者可以小于l岁、l-5岁、5-15岁、15-55岁、或至少55岁。接受疫苗的优选患者是老年人(例如，250岁，$60岁，优选265岁)，年轻人(例如，S5岁)，住院患者，卫生保健人员、军队和军事人员，怀孕的妇女，慢性病、免疫缺陷患者，在接受疫苗前7天中服用抗病毒化合物(例如，奥塞米韦或扎那米韦化合物；例如磷酸奥塞米韦，参见下文)的患者、对鸡蛋过敏的人和出国的人。然而，这些疫苗不仅适用于这些团体，还可应用于更广泛的人群中。对于流行毒株，优选给予所有的年龄组。可将本发明制备的疫苗与其它疫苗基本上同时(例如，可在医疗保健专家或疫苗接种中心的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与以下疫苗基本上同时麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的乙型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联物疫苗(例如，四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶联物疫苗，等等。与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本上同时给予在老年患者中特别有用。类似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，特别是有效抵御疫流感毒的抗病毒化合物(例如，奥塞米韦)基本上同时(例如，可在医疗保健专家的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者。这些抗病毒(化合物)包括神经氨酸酶抑制剂，例如(3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-环己烯-l-羧酸，包括其酯(例如乙酉旨)和盐(例如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-环己烯-l-羧酸、乙酯、磷酸酯(l:l)，也称为磷酸奥塞米韦(TAMIFLU)。治疗可以是单剂量用药法或多剂量用药法。多剂量可以用于初次免疫接种程序表和/或加强免疫接种程序表中。给予多次剂量(通常是两剂量)在免疫原初患者，例如对于以前从未接受流感疫苗的人，或对于接种抵御新HA亚型的疫苗而言(例如在流行病爆发期间)特别有用。多剂量通常可间隔至少一周(例如，约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周，等等)给予。由于本发明组合物和试剂盒包含铝佐剂，保存期间可能发生组分沉淀。因此，应先振荡组合物再给予患者。振荡的组合物是混浊的白色悬液。术语"含有"包括"包含"以及"由...组成"，例如"含有"X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。词语"基本上"不排除"完全"，例如"基本上无"Y的组合物可完全无Y。该词语"基本上"可视需要从本发明定义中省去。与数值x相关的术语"约"表示，例如xi100/。。除非有专门表述，包括混合两种或多种组分的步骤的某方法不要求任何具体混合顺序。因此，可以任何顺序混合诸组分。如果有三种组分，则可先将两种组分彼此混合，再将该混合物与第三种组分混合，等等。如果将某抗原描述为"吸附"到某佐剂上，优选吸附了至少50%(以体积计)的该抗原，例如50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或更多。如果利用动物(特别是牛)材料培养细胞，这些材料应从不含可传染海绵样脑病(TSE)，特别是不含牛海绵样脑病(BSE)的来源获得。总体上，优选在完全不含动物来源的材料中培养细胞。如果将细胞物质用于重配或反向遗传学方法，优选批准用于人疫苗生产的细胞物质，例如欧洲药典概述章节5.2.3中的。本发明的实施方式由于在使用铝盐作为流感病毒疫苗佐剂时有上述问题，决定研究能否制备其中的佐剂和抗原组分直至使用之时维持隔开但其中仍能发生抗原吸附的疫苗。为确定该方法的可行性，将某流感病毒的纯化表面抗原与氢氧化铝悬液混合。混合后，立即通过台式离心沉淀铝盐，检测残留在上清液中的蛋白质的量(即，未吸附的蛋白质的量)。^雄伊微辦泰泰橫从流感病毒A/NewCaledonian(HlNl)或A/Wyoming(H3N2)纯化血凝素，将其稀释至75吗HA/ml。制备4.25mg/ml(约1.5mg八1+++/1111)的氢氧化铝佐剂。将1ml佐剂悬液加入15mlFalcon试管内的4ml抗原溶液中，翻转该混合物并于室温培育。先在第0时，然后在第5、10、20、30、60、90和120分钟时取样。对照是单独的抗原(10mMPBS，pH7.7)或单独的佐剂(10mMPBS，pH7.7)。立即以4000rpm离心样品以沉淀吸附的物质进行分析。通过BioRad蛋白质测定和非变性SDS-PAGE检测蛋白质含量。两种毒株的吸附研究结果如下所示，只有抗原的对照的蛋白质含量标准化为100%:样品悬液中的悬液中的A/NewCaledonia蛋白质A/Wyoming蛋白质抗原对照100100佐剂对照0.00.3o分钟3.81.25分钟1.70,710分钟2.20.620分钟2.20.630分钟1.60.860分钟1.40.590分钟1.80.5120分钟1.90.5因此非常快地发生高度吸附。各时间点的差异不显著。为证实这些结果，上清液的SDS-PAGE分离采用SYPRO红宝石染料染色。佐剂对照、0、5、10、20或30分钟样品中未见蛋白质条带。因此存在的任何蛋白质低于该方法的检测限，该方法足够灵敏从而能检测l-2ng的蛋白质。结果显示至少97%的抗原快速吸附到佐剂上。出乎意料的是，吸附基本上是瞬间发生，从而能分发佐剂配制的流感疫苗而无需预先吸附到佐剂上。因此，21可以更快速地制备佐剂疫苗，这在流行情况中最有用。利用两种不同的甲型流感病毒毒株得到了这些结果，完全可以预料用其它毒株和基于不可溶铝盐的其它佐剂可以观察到同样效果。游維伊舰减毒橫制备A/Vietnam/1203/2004xA/PR8/8/34(H5Nl)流感病毒2:6重配株的纯化表面抗原制剂。经SRID测定血凝素含量估计为41叫HA/ml。利用Ultrafree-15离心过滤装置将30mlA/H5N1浓縮至约15ml。通过Bio-Rad蛋白质试验，利用0-50pg/mlY球蛋白标准曲线测得原始和浓縮A/H5N1的蛋白质总含量。利用该结果计算HA与总蛋白之比。然后用该值计算60pgHA/ml的A/H5N1溶液所需的终体积。将0.7ml2mg/ml的氢氧化铝佐剂加入1.5ml微量离心管的0.7ml60昭HA/mlMBP中。通过翻转来混合诸溶液，室温下(约2(TC)培育。在第5分钟、10分钟、30分钟、2小时、8小时和24小时一式两份取样。对照是0.7mL10mMPBS，pH7.7力卩入0.7mL60|igHA/mLMBP;和0.7mL10mMPBS，pH7.7加入0.7mL2mg/mL氢氧化铝。室温下以13000rpm离心样品l分钟以除去悬浮的氢氧化铝，将上清液倾倒入作了标记的7ml无菌小杯(bijou)中。如上所述，利用SYPRO染料通过BioRadTM蛋白质试验和非变性SDS-PAGE分析结果，结果如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>A/H5N1制剂的结果与利用等价A/NewCaledonia和A/Wyoming制品所进行实验的结果相当。对所有样品的上清液进行拜尔-雷得(Bio-Rad)蛋白质试验检测到的蛋白质水平非常低，证明几乎所有蛋白质保持与氢氧化铝沉淀物结合。SDS-PAGE分离后对样品进行灵敏的SYPRO红宝石染料染色显示佐剂对照或6个时间的任一样品中没有蛋白质条带。因此存在的任何蛋白质低于该方法的检测限。任何时间点的蛋白质浓度没有明显差异。氢氧化铝对照和诸时间样品的所有样品吸附性和随后的蛋白质浓度估计值均低于5-50pg/ml标准曲线的下限。因此，数据表明A/H5N1蛋白质瞬间吸附到铝盐佐剂，并能维持稳定至少24小时。乂嫌教薪如参考文献93所报道的，在随机标签公开的无对照I期试验中，300位志愿者接受6种灭活的单价裂解流感A/Vietnam/1194/2004(H5N1)疫苗制剂，包括含或不含氢氧化铝佐剂的3种不同剂量的HA(7.5(ig、15吗或30吗)。诸个体接受两次疫苗接种，通过血凝反应抑制和微量中和法分析血液样品。采用批准用于生产VAXIGRIPTM流行间期疫苗的方法[94]，在含胚的鸡蛋中制备疫苗。疫苗毒株是NIBSC制备的流感A/Vietnam/1194/2004/NIBRG14(H5N1)参比毒株。该毒株含有高致病性禽流感毒株A/Vietnam/1194/2004的修饰血凝素和神经氨酸酶及流感A/PR/8/34(H1N1)的其它病毒蛋白质。修饰血凝素以除去切割位点的多碱性氨基酸序歹U(multibasicaminoacidsequence)。给0.5ml注射器(23号，1英寸针头)装填用不含佐剂的磷酸缓冲盐溶液配帝lj，血凝素水平为7.5吗、15吗或30吗的裂解疫苗。对于未用佐剂的疫苗接种，直接在患者中使用这些注射器。然而，对于使用佐剂的疫苗接种，与含氢氧化铝佐剂的注射器内含物一样，将注射器的内含物注入无菌小瓶中。该混合可恰在使用前在床边实施，混合10秒后，将诸内含物抽入新的注射器(23号，l英寸针头)，轻柔回荡以使抗原/佐剂悬液均质化，然后肌肉内(三角肌)注射入患者。注射体积是0.5ml，除了佐剂配制的30pg制剂(lml体积)。疫苗的最终佐剂含量是600pg。混合抗原和佐剂的基础研究显示所有三种抗原剂量有相似的吸附系数。各参与者接受两次肌肉内注射，间隔21天(第0天和第21天)。在第0、21和42天采集血液样品。所有6种制剂耐受良好，在第0天和第42天之间没有严重的副作用，没有严重的注射部位疼痛，没有口腔温度超过38'C的发热事件报道。所有制剂均引发了免疫应答，一些个体仅在一次给药后即检测到有反应。对于血凝反应抑制，第21天各组有6%-34°/。的滴度为32或更高，在第42天该比例增加至28-67%。中和抗体应答的模式与血凝反应抑制的那些类似。佐剂配制的30pg制剂诱导了最强的应答(两次疫苗接种后血凝反应-抑制血清转化率为67%)。具体地说，用佐剂配制的30pgH5Nl疫苗实施两剂量方法显示免疫应答符合批准季节性流感疫苗的欧洲管理要求。应该知道，只是借助实施例描述了本发明，可以作出改进而仍属于本发明的范围的构思。参考文献(其内容通过弓I用纳入本文)《疫苗》(Vaccines),(Plotkin和O画tein编)，第4版，2004，ISBN:0-7216-9688-0.美国专利6,372,223.[3]WO00/15251.[4]WOO1/22992.Hehme等(2004)VirusRes.103(1-2):163-71.WO2005/089837.美国专利6,692,468.WO00/07647.WO99/17820.美国专利5,971,953.美国专利4,060,082.[12]EP-A-0520618.WO98/01174.[14]W096/37624.[15]W098/46262.[16]WO02/28422.[17]WO02/097072.[18]WO2005/113756.[19]WO02/067983.[20]WO02/074336.[21]WO01/21151.Huckriede等(2003)MethodsEnzymol373:74-91.世界卫生组织(2005)EmergingInfectiousDiseases11(10):1515-21.Herlocher等(2004)JInfectDis190(9):1627-30.Le等(2005)Nature437(7062):1108.Hoffmann等(2002)Vaccine20:3165-3170.Subbarao等(2003)Virology305:192-200.Liu等(2003)Virology314:580-590.Ozaki等(2004)J.Virol78:1851-1857.Webby等(2004)Lancet363:1099-1103.WO00/60050.WO01/04333.美国专利6649372.Neumann等(2005)ProcNatlAcadSciUSA102:16825-9.[35]WO2006/067211.[36〗WO01/83794.Hoffmann等(2000)Virology267(2):310-7.[38]WO97/37000.Brands等(1999)DevBiolStand98:93-100.Halperin等(2002)Vaccine20:1240-7.Tree等(2001)Vaccine19:3444-50.Kistner等(1998)Vaccine16:960-8.Kistner等(1999)DevBiolStand98:101-110.25[44]Bruhl等(2000)Vaccine19:1149-58.Pau等(2001)Vaccine19:2716-21.http:〃www.atcc.org/http:〃locus.umdnj.edu/WO03/076601.WO2005/042728.WO03/043415.WO01/85938.WO2006/108846.EP-A陽1260581(WO01/64846).WO2006/071563.WO2005/113758.WO2006/027698.EP-B-0870508.美国专利5948410.名为"残留细胞DNA水平低的细胞衍生病毒疫苗"(CELL-DERIVEDVIRALVACCINESWITHLOWLEVELSOFRESIDUALCELLDNA)的国际专利申请，2006年11月1日提交，要求US-60/732786的优先权.WO03/023021[61]WO03/023025.[62]WO97/37001.Treanor等(1996)JInfectDis173:1467-70.Keitel等(1996)ClinDiagnLabImmunol3:507-10.美国专利6534065.Frey等(2003)Vaccine21:4234-7.Bozkir和Hayta(2004)DrugTarget12:157-64.Cooper等(2004)Vaccine22:3136-43.[69]Guebre陽Xabier等(2003)JVirol77:5218-25.Peppoloni等(2003)ExpertRevVaccines2:285-93.Pine等(2002)JControlRelease85:263-70.Baldridge等(2000)Vaccine18:2416-25.WO94/19013.EP-A-0721782.美国专利5292506.《疫苗设计亚单位和佐剂方法》(VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach)(PowelI禾卩Newman)普莱纳姆出版社(PlenumPress)1995(ISBN0-306-44867-X).英国专利申请GB-A-2220211.Myers等(1990)《内毒素反应的细胞和分子方面》(Cellularandmolecularaspectsofendotoxinreactions),第145-156页.Ulrich(2000)《疫苗设计…》(VaccineDesign...),第16章(第273-282页)(1995)Powe11和Newman编ISBN:030644867X.Johnson等(1999)JMedChem42:4640-9.Baldrick等(2002)RegulatoryToxicolPharmacol35:398-413.Gennaro(2000)《雷明顿药学科学和实践》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.)第20版，ISBN:0683306472.Banzhoff(2000)ImmunologyLetters71:91-96.Nony等(2001)Vaccine27:3645-51.Potter和Oxford(1979)BrMedBull35:69-75.Greenbaum等(2004)Vaccine22:2566-77.Zurbriggen等(2003)ExpertRevVaccines2:295-304.Piascik(2003)JAmPharmAssoc(华盛顿，哥伦比亚特区).43:728-30.Mann等(2004)Vaccine22:2425-9.Halperin等(1979)AmJPublicHealth69:1247-50.Herbert等(1979)JInfectDis140:234-8.[92]Chen等(2003)Vaccine21:2830-6.Bresson等(2006)Lancet.DOI:10.1016/S0140-6736(06)68656-X.[94]Lina等(2000)Biologicals28:95-103.权利要求1.一种试剂盒，其装有(i)包含流感病毒抗原的抗原组分；和(ii)包含铝盐的佐剂组分，2.如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，所述组分之一或两者装在小瓶中。3.如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，所述组分之一或两者装在注射器中。4.如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，所述组分之一装在注射器中，而另一种组分装在小瓶中。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原组分装在注射器中。6.如以上权利要求中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述流感病毒抗原是灭活病毒。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述流感病毒抗原包含完整的病毒、裂解病毒或纯化的表面抗原。8.如以上权利要求中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述流感病毒抗原来自H1、H2、H3、H5、H7或H9甲型流感病毒亚型。9.如以上权利要求中任一项所述的试剂盒，其特征在于，从卵培养的流感病毒制备所述流感病毒抗原。10.如权利要求1-8中任一项所述的试剂盒，其特征在于，从细胞培养物培养的流感病毒制备所述流感病毒抗原。11.如权利要求1-8中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述流感病毒抗原组分不含卵白蛋白、卵类黏蛋白和鸡DNA。12.如权利要求IO所述的试剂盒，其特征在于，所述流感病毒抗原组分含有少于10ng细胞培养宿主的细胞DNA。13.如以上权利要求中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述流感病毒抗原组分在该组分中含有0.1-50pg血凝素/病毒毒株。14.如以上权利要求中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述佐剂组分包括氢氧化铝佐剂。15.如以上权利要求中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述佐剂组分包括磷酸铝佐剂。16.—种包含流感病毒抗原的抗原组分，和一种包含铝盐的佐剂组分，二者同时单独使用或顺序使用。17.—种免疫原性组合物，其包含流感病毒抗原和铝盐佐剂，其中通过在使用时临时混合所述抗原和佐剂来制备该组合物。18.—种制备流感疫苗的方法，所述方法包括以下步骤(i)制备包含流感病毒抗原的抗原组分；(ii)制备包含铝盐的佐剂组分；和(iii)将所述抗原和佐剂组分组合装在试剂盒中。19.一种制备和给予流感疫苗的方法，所述方法包括以下步骤(i)混合权利要求1所述试剂盒的诸组分；和(ii)将混合的组分给予患者。20.—种制备和给予流感疫苗的方法，所述方法包括以下步骤(a)组合(i)包含流感病毒抗原的抗原组分和(ii)包含铝盐的佐剂组分；和(b)将疫苗在实施步骤(a)的12小时内给予患者。21.如权利要求1-15中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒被用于医学。22.(i)流感病毒抗原和(ii)包含铝盐的佐剂组分在制备用于在患者体内产生免疫应答的药物中的应用，其中所述药物包含的抗原和佐剂是单独的组分。全文摘要佐剂配制的流感疫苗的抗原和佐剂组分不在生产期间混合，而是作为在使用时临时混合的单独组分提供，例如作为装有以下组分的试剂盒(i)包含流感病毒抗原的抗原组分；和(ii)包含铝盐的佐剂组分。文档编号A61K39/145GK101330926SQ200680047572公开日2008年12月24日申请日期2006年11月6日优先权日2005年11月4日发明者A·科尔盖特,P·赛泽申请人:诺华疫苗和诊断有限公司