专利名称：一种含有CpG序列的PRRSV ORF5基因核酸疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因疫苗使用的佐剂和其制备方法，具体是一种含有CpG序列的 PRRSV 0RF5基因核酸疫苗。
2背景技术：
自从上世纪20年代以来，许多物质被尝试作为免疫佐剂，但只有铝胶佐剂 获得人类疫苗的许可，并大量用于猪疫苗。它作为抗原的储存库和载体，缓慢 释放抗原从而延长诱导机体的体液免疫反应，但缺点是仅诱导Th2体液免疫反 应，抗体以IgGl型为主，无TCL反应。油佐剂和弗氏完全佐剂虽能明显提高免 疫应答能力，但在实际应用中常出现不良反应，如注射部位肿胀、疼痛、发烧， 或发生过敏等，仅限用于实验室动物试验。206佐剂是目前商品化的高效动物疫 苗油佐剂，已广泛使用于动物疫苗中，实践证实是可靠的、有效的和安全的， 但需要进口，价格较高。
基因疫苗(gene vaccine)是近年来随着基因治疗而发展起来的第三代疫 苗。它是将编码某一特定保护性抗原蛋白的外源基因与真核表达载体进行重组 后，直接导入动物体内，利用免疫原基因在宿主体内表达出抗原蛋白质引起机 体的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。与常规疫苗相比，基因疫苗具 有如下优点免疫效果好；不散毒，无污染；保护性免疫持续时间长；方法简 便、价格低廉；核酸疫苗具有相同的理化性质，为联合免疫提供了可能；便于 贮藏和运输；不受个体已有的免疫反应(如母源抗体)的影响。
PRRSV基因组中0RF2 7编码病毒的结构蛋白，其中用于基因免疫方面研究 较多的是0RF5、 0RF3以及0RF4。据报道，0RF5有6个抗原决定簇，其中一个 是血清型特异性线性中和决定簇，能在体外中和病毒的感染性，这说明0RF5可 以诱导产生中和抗体。最近，Patrick等^又证明病毒的中和作用与抗GP5滴度 呈显著相关性，另外，Pirzadeh等报道说，用含编码0RF5的质粒进行DNA免 疫，可使接种猪产生抗0RF5的特异性中和抗体，接种猪免于强毒攻击造成的全 身性病毒血症和肺部病变，并使间质性肺炎和支气.管肺泡炎明显减轻。 Meulenberg等在LV株0RF4编码的蛋白GP4中鉴定了一个中和区，表明该蛋白 诱导的抗体具有中和作用。美国学者Molitor等又通过实验证明可以用含0RF5、0RF3的基因构建基因免疫质粒，进行基因免疫。由于目前用来防制PRRS的灭活 疫苗和弱毒疫苗均存在着不同程度的缺陷，因此利用生物技术手段开发新型疫 苗以取代现用的常规疫苗己经是势在必行。新型疫苗是以基因工程疫苗为核心， 主要包括核酸疫苗、亚单位疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、合成肽疫苗以 及抗独特型抗体疫苗等。虽然PRRS病毒的基因序列己经全部测定，但其致病机 理以及病毒结构蛋白的功能仍不十分清楚，所以这无疑为本病新型疫苗的研制 带来了重重困难，尽管如此，现在国外已有许多学者致力于这方面的研究，与 此同时，国内学者也正对其处于积极探索之中。如何进一步提高传统疫苗的免 疫效果是今后努力的方向。高效免疫增强剂的应用，能全面提高机体的整体免疫 水平，增强抗病防御和免疫应答能力，提高疫苗保护率。其中，CpG-ODN(CpG寡聚 脱氧核苷酸)的研究是其中的焦点。CpG序列已被证实能作为疫苗的高效免疫增 强剂，使用得当能够大幅度提高疫苗的免疫保护率和机体的免疫水平。近来大量 免疫学研究证实含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果(l)诱导B细胞增 殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗诱生的细胞凋亡；(3)诱导单核细胞 分泌IL-12及其他细胞因子；(4)活化自然杀伤(NK)细胞的裂解活性和干扰素 (IFN-y)分泌。
当前养猪业重大疫病发生和流行愈加复杂的形势——旧病未除，新病又起， 疫情不断，这就要求我们必须运用新的科学理论和生产技术来发展猪用安全、 高效疫苗预防和控制各种疫病的发生和流行，而佐剂研制是疫苗研究的主要组 成部分。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的供猪免疫疫苗使用的基因佐剂的制备方法，即一 种含有CpG序列的PRRSV 0RF5基因核酸疫苗的制备方法。
本发明的基因佐剂的优越性有1)在宿主体内表达所需要的DNA分子，在 构象上接近天然分子结构，活性不受影响；2) —次少量给予即可长时间低量表 达，无需多次给药；3)制备简单，质量易于控制，易规模化生产，成本低廉， 易于保存和运输；4)安全性好。细胞因子是机体内本身存在的免疫调节分子， 对人体无毒副作用，同时也受机体免疫调节网络的控制；5)易于构建和改造。 利用分子生物学技术在基因水平的操作，实现人们所期望的免疫应答强度和类 型。
经相关的实验表明，本发明的基因佐剂具有可使低应答或无应答以及应答不全的疫苗产生有效的免疫反应的作用。
本发明的含有CpG序列的PRRSV 0RF5基因核酸疫苗的制备方法包括如下步
骤
(1) 选用CpG-ODN序列引物
A: 5， "CTCAT，TCCTA巡ATCCTA，TOCTA，TOCTA巡ATCCTA巡ATGGGCC-3， B: 5， -CATCGATAGGATCGATAGGATcgATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC-3，
(注1、两端含有Apa I限制性内切酶位点，供克隆连接使用；划线部分需硫 代修饰；2、 A和B以引物形式合成，合成PAGE 2.00D以上)
(2) 采用基因工程重组技术，选择合适的含酶切位点，将目的基因和CpG-ODN 序列克隆入真核细胞表达载体pVAXl;
(3) 用步骤(2)所得的重组质粒载体转化原核宿主菌，挑选阳性克隆，测 序鉴定后，再进行扩增培养；
(4) 大量提取和纯化目的基因的重组质粒DNA。
(5) 免疫原性的检测
(6) 动物试验 具体步骤如下
1) PCR扩增0RF5基因
设计扩增0RF5基因的引物为
P5s: 5， -AATCTAGCTAGCCGCCACCATGTTGGA-3 ，， P5r: 5， -GCGCgg076CTCACTGGCGTGTAG-3 ，。
为便于克隆，在上游引物和下游引物中分别添加了 Nhe I酶切位点和Not I 酶切位点。
以质粒pIRES—0RF50RF6为扩增模板，扩增0RF5基因，反应体系如下 10XPCR buffer 5W; dNTP Mixture 4Ml; P5s 2W; P5r; 模板2W; Ex Taq E 0. 5W;用ddH20补至50W。扩增条件预变性95°C 5min; 变性 94°C lmin退火50°C lmin延伸72°C lmin共30 Cycles最终延伸72°C lOmin。
2 ) pVAXl—0RF5载体的构建
用限制性内切酶Notl/Nhe I消化PCR纯化产物和pVAXl，分别获得0RF5基 因片段和线性载体pVAXl，将产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳，按照上海生工胶 回收试剂盒说明书进行。连接、转化、挑菌、提质粒、用限制性内切酶Notl/NheI鉴定。
3) CpG-pVAXl- 0RF5重组质粒的构建
将合成的两条CpG序列引物A、 B按l:l比例混合于95"C加热5min，后置于室 温冷却，退火2h，获得CpG-ODN短序列。用限制性内切酶ApaI消化质粒pVAXl-0RF5，将pVAX1- 0RF5和CpG-0DN按1: 3比例进行连接、转化、挑菌、质粒小提、 用限制性内切酶Notl/Nhe I鉴定。将含有CpG-pVAX1-0RF5重组质粒的菌样送往 联合基因有限公司生物公司，用Thermol Cyling全自动测序仪进行序列测定。
4) 重组质粒的纯化和转染细胞
质粒的大量制备及纯化，按常规方法进行，溶于TE (pH 8.0)中，测定质 粒DNA纯度，贮存于-2(TC。质粒DNA的定量以TE(pH8. O)为空白对照，用TZK-800Z 紫外分光光度计测定波长260nm和280nm的核酸溶液光密度(0D)值。用含10%小 牛血清的MEM培养基，在37。C， 5%C02的条件下培养C0S-7细胞，待细胞长至对 数生长期质粒转染细胞。采用脂质体法按说明书进行，设立空载体对照组。
5) RT-PCR检测ORF5基因的转录情况收集筛选后稳定表达的细胞，按常规 方法提取细胞总R N A ，经反转录后用引物P 5 s禾n P 5 r扩增。
6) 间接免疫荧光实验(IFA)
将质粒转染到长有70%C0S-7细胞单层的玻片上，5%C02、 37i:培养三天后， 取出玻片，用PBS液冲洗三次，100。/。冷丙酮固定15 30min，再用PBS液洗涤三 次；用含有5%BSA封闭2h，冲洗三次，每次5min;加入一抗(猪抗PRRSV血清)， 37。C作用2h后，冲洗3次；加入二抗(异硫氰荧光素标记的山羊抗猪IgG)， 室温避光作用lh，冲洗3次；吸干，滴加50%甘油水溶液，倒置于载玻片上， 荧光显微镜下观察。
7) 免疫动物
6周龄雌性SPF昆明小鼠，体重18 26 g ,购于青岛药检所实验动物中心。 免疫6周龄雌性SPF昆明小鼠，取脾淋巴细胞检测T淋巴细胞亚群的数量和淋巴细 胞转化实验。采用间接ELISA方法分别测定了小鼠血清中抗PRRSV抗体水平的变 化。将全部血清均做l: 40倍稀释，最后测OD值。
4周龄长白仔猪，经ELISA检测其PRRS抗体阴性。随机分为5组，每组5 只，按如下五组免疫(A)正常对照组(注射生理盐水)；(B)空载体PVAX1 组；(C) PVAX1-E组；(D) CpG-pVAXl-E组；(E)灭活疫苗组；B、 C、 D实 验组剂量均为800ug/只，用前混合均匀，肌肉注射，免疫三次，间隔21天；正常对照组注射lml生理盐水，灭活疫苗组(E组)按说明书接种。于每次免疫后 IO天和攻毒后四周采血，分离血清，-20'C保存备用。 8)动物试验
分别进行淋巴细胞转化试验(MTT法)，用IDEXX试剂盒检测猪外周血抗体 水平，用IL-2的定量检测试剂盒检测IL-2的含量，猪体内PRRSV的RT-PCR检 测，攻毒后4周将猪宰杀，取肺脏、肝脏、脾脏、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠 系膜淋巴结、肩前淋巴结、心脏、肾脏、脑组织、十二指肠等组织器官观察病 理变化。
9)试验结果
1) 通过巧妙的设计构建成CpG-pVAXl-0RF5重组质粒，经测序正确。为了 检测重组质粒的免疫原性，将重组质粒转染C0S-7细胞。将处理好的细胞玻片 置于荧光显微镜下观察，发现转有重组质粒质粒pVAXl-0RF5、 CpG-pVAXl-0RF5 的细胞玻片上有明显的黄绿色荧光，位置在细胞浆内，而质粒pVAXl和空白细 胞对照则无特异性荧光出现。通过提取转染质粒的细胞和对照细胞总RNA进行 RT-PCR 0RF5目的基因的特异性扩增。结果表明，转有质粒pVAXl-0RF5和 CpG-pVAXl-0RF5细胞中扩增到约700bp的0RF5片段，而转有pVAXl的细胞中和 正常细胞未出现扩增条带，证明目的基因在真核细胞中进行了转录。
2) 免疫6周龄雌性SPF昆明小鼠，取脾淋巴细胞检测T淋巴细胞亚群的数 量和淋巴细胞转化实验。采用间接ELISA方法分别测定了小鼠血清中抗PRRSV 抗体水平的变化。将全部血清均做l: 40倍稀释，最后测0D值。其结果表明 重组核酸疫苗能诱导机体产生特异性抗抗体，且抗体水平明显高于PBS组和 pVAXl组，差异显著，且pVAXl-0RF5组和CpG-pVAXl- E实验组所得到的0D值 较高，某些值可达O. l以上，同时还发现实验免疫组CpG-pVAX1-0RF5组小鼠三 免后采血清能获得最高的0D值可达0. 121。
用流式细胞仪检测10000个细胞，将所得数据进行统计学分析(数据的描 述采用x士SD，组间比较采用非配对t检验)。结果表明与PBS对照组及空 质粒pVAXl对照组比较，用所构建的重组表达质粒pVAXl-0RF5、 CpG-pVAXl-0RF5 免疫的各试验组小鼠的T淋巴细胞亚类CD4+和CD8+的数量显著提高(p<0. 05)， 对照组CD4+最髙为23. 42，而实验组CD4+最低则达到37. 05，而对照组CD8+最 高为11. 98，实验组CD8+最低达到15. 09。且实验组中以CpG-pVAXl-0RF5免疫 组的脾T淋巴细胞亚类数量较多，CD4+为40.8， CD8+为20.18。
8淋巴细胞转化实验说明pVAXl-0RF5组和CpG-pVAXl- E均能不同程度的刺 激淋巴细胞的增殖，但两组间差异不显著。二免后10d pVAXl-0RF5组和 CpG-pVAXl- E组的淋巴细胞增值能力与对照组差异显著；CpG-pVAX1- E组的OD 值较pVAXl-0RF5组的OD值有所增高，但差异不显著。三免后10d CpG-pVAXl- E 组的淋巴细胞增值能力与对照组及pVAXl-0RF5差异显著，证明CpG-ODN作为佐 剂均能有效的刺激淋巴细胞增殖。
通过以上小鼠免疫实验结果表明，所构建的CpG-pVAXl-0RF5实验组核酸表 达质粒接种小鼠后，均能不同程度的诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。
3)为了检验插入的CpG-ODN对猪的免疫增强作用，我们选择了4周龄长白 仔猪25只，经ELISA检测其PRRS抗体阴性。随机分为5组，每组5只，按如
下五组免疫(A)正常对照组(注射生理盐水)；(B)空载体PVAX1组；(C)
PVAX1-E组；(D) CpG-pVAXl-0RF5组；(E)灭活疫苗组；B、 C、 D实验组剂 量均为800ug/只，用前混合均匀，肌肉注射，免疫三次，间隔21d;正常对照 组注射lmL生理盐水，灭活疫苗组(E组)按说明书接种。于每次免疫后10d和 攻毒后四周采血，分离血清，-20。C保存备用。于三免后2周对猪鼻内接种PRRSV SD1细胞毒TCID5。= 10—55，剂量为每头猪2 mL。攻毒后观察猪的临床表现。
分别进行淋巴细胞转化试验(MTT法)，用IDEXX试剂盒检测猪外周血抗体 水平，用IL-2的定量检测试剂盒检测IL-2的含量，猪体内PRRSV的RT-PCR检 测，攻毒后4周将猪宰杀，取肺脏、肝脏、脾脏、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠 系膜淋巴结、肩前淋巴结、心脏、肾脏、脑组织、十二指肠等组织器官观察病 理变化。
猪淋巴细胞转化试验结果表明
免疫前各组淋巴细胞增值能力差异不显著(P〉0.05下同)； 一免疫后10dC 组、D组、E组0D值均升高，明显高于对照组的OD值，并且差异显著(P<0.05 下同)，说明CpG-pVAXl-0RF5组、灭活疫苗组均能不同程度的刺激淋巴细胞的 增值，但疫苗组及CpG-pVAXl-0RF5组间差异不显著。CpG-pVAXl-0RF5组及疫苗 组的淋巴细胞增值能力与对照组差异显著；二、三免后CpG-pVAXl-0RF5组及 疫苗组的淋巴细胞增值能力差异不显著，但与对照组及pVAXl-0RF5差异显著， 从而证明CpG-pVAXl-0RF5作为佐剂均能有效的刺激淋巴细胞增值。攻毒后10d 各组0D值均有不同程度的下降，CpG-pVAXl-0RF5组及疫苗组的淋巴细胞增值能 力差异不显著，但与对照组及pVAXl-0RF5差异显著，表明CpG-ODN能延长疫苗
9的保护期；CpG-pVAXl-0RF5组的CpG-ODN对淋巴细胞增值能力的影响较为显著。 免疫前后按常规方法静脉采血，分离血清，血清的抗体效水平的检测结果 表明
免前各组抗体水平均为阴性，差异不显著(P〉0.05下同)，符合试验要求。 一免、二免后10dPVAXl-E组、CpG-pVAXl-0RF5组、灭活疫苗组的抗体水平明 显高于正常对照组(注射生理盐水)、空载体PVAX1组；CpG-pVAXl-0RF5组、 灭活疫苗组与空载体pVAXl对照组、生理盐水正常对照组抗体水平差异显著 (P〈0.05下同)；CpG-pVAXl-0RF5组、灭活疫苗组间的抗体水平差异不显著。 三免后10d各组抗体水平均有一定程度的降低，但疫苗组的抗体水平比 CpG-pVAXl-0RF5组下降速度快，与对照组差异显著；CpG-pVAXl-0RF5组与空 载体PVAX1组抗体水平差异显著，而与灭活疫苗组疫苗+CpGl组差异不显著。攻 毒后10d ， PVAX1-0RF5组、CpG-pVAXl-0RF5组、灭活疫苗组的抗体水平下降， 灭活疫苗组的下降趋势快于CpG-pVAXl-0RF5，证明CpG-pVAXl-0RF5中的CpG能 延缓抗体水平的降低。
对IL-2浓度的检测结果表明 一免、二免后10d PVAX1-E组、 CpG-pVAXl-0RF5组、灭活疫苗组的IL-2水平明显高于正常对照组(注射生理盐 水)、宇载体PVAX1组；CpG-pVAXl-0RF5组、灭活疫苗组与空载体pVAXl对照 组、生理盐水正常对照组IL-2水平差异显著(P<0. 05下同)；CpG-pVAXl-0RF5 组、灭活疫苗组间的IL-2水平差异不显著。
取攻毒前、攻毒后2周及攻毒后4周的血清，用针对PRRSV SD1株0RF5 的引物对进行RT-PCR，检测血清中的病毒血症。检测结果表明攻毒前所有猪 血清的RT-PCR反应均为阴性。攻毒后正常对照组(注射生理盐水)、空载体PVAX1 组均为阳性，且反应较强；CpG-pVAXl-0RF5组在攻毒后4周有l头猪RT-PCR结 果为阴性，病毒血症的累计阳性率为20%，比pPVAXl-0RF5重组质粒组减少了 20Q%;疫苗组在攻毒后4周所有猪表现RT-PCR反应阳性，病毒血症的累计阳性 率为40%，但反应较弱。其余猪在攻毒后2周及攻毒后4周进行的检测均为阳 性。检测结果表明，CpG-pVAXl-0RF5可部分抑制病毒血症的出现。 免疫猪攻毒后4周的病理变化经3次免疫后攻毒，并于攻毒后4周将猪宰杀。 剖检发现，攻毒后，免疫猪攻肺脏出现轻微出血(1/5)、肠系膜淋巴结出血并 极度肿大(1/5)、腹股沟淋巴结出血(3/5)以及肾脏出血(1/5);生理盐水组 的肩前淋巴结出血(3/5)及十二指肠山血(2/5); PVAX1 -E组组肩前淋巴结出血(1/5) ; CpG-pVAXl-0RF5组的组织未见异常。结果表明，真核表达质粒 CpG-pVAXl-0RF5组的DNA重组质粒免疫后，可使猪的病理变化减轻。研究结果 还表明接种PRRSV SD1 CpG-pVAXl-0RF5组能够有效地抵抗经鼻攻毒，可以保护 猪轻微病毒血症，也不表现临床症状，对肺的损害能提供部分保护。CpG的加入 可使免疫猪的病变减轻或消失。
CpG-pVAXl-0RF5重组质粒中的插入片段测序结果如下:
GACCGCGGGCCGTTGCTCGCGATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCCGTTCTGTTTTGCTGTGCT
TGAATGGCACAGATTGGCTGGCTAACAAATTTGATTGGGCAGTGGAGAGTTTTGTCATCTTTCCCG
TCCM TCGA TCC77\ 7"CGA 7"CC77\ rCG/\ rGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCC
TCCCACTGTCCTT
标注划线字母是0RF5基因的上下游引物，引物之间是0RF5基因序列；斜 体划线字母部分
抗体效价的检测结果如下
组别免前—免后10天二免后10天三免后10天攻毒后10天
生理盐水组0. 168±0. 12a0. 169±0. 42a0. 19±0. 35a0. 19±0. 22a0. 23±0. 19a
PVAX1组0. 165±0. 15a0. 194±0, 26b0.21±0. 30b0. 22±0. 45b0. 31±0. 16b
PVAX1—E组0. 170±0. 25a0. 56±0. 25c0. 67±0, 58c0. 63 ±0. 48°0. 59±0. 14c
CpG-pVAX1-E0. 171 ±0. 23a0. 62 ±0. 34be0, 78 ±0. 35bc0. 82 ±0. llcd0. 67±0. 31"组.
灭活疫苗组0, 169±0. 37a0. 63 ±0. 54bc0. 82±0. 32b0. 74±0.46cd0, 64±0. 26d
注带有相同字母的表示差异不显著P〉0. 05;带有不同字母的表示差异显著 P〈0. 05SEQUENCE LISTING 〈110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所
〈120〉 一种含有CpG序列的PRRSV 0RF5基因核酸疫苗的制备方法 <160> 5
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1 <211> 59 〈212>丽 〈213〉人工序列 〈220〉 <223>引物 〈400> 1
ctcatcgatc ctatcgatcc tatcgatcct atcgatccta tcgatcctat cgatgggcc 59
〈210〉 2 〈211〉 59 <212> DNA 〈213〉人工序列 <220> 〈223>引物 〈400> 2
catcgatagg 3tcgatagga tcgataggat cgataggatc gataggatcg atgagggcc 59
〈210〉 3 〈211〉 27 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <220> 〈223>引物 〈400〉 3
aatctagcta gccgccacca tgttgga 27
〈210〉 4 〈211> 24 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220> 〈223>引物 〈400> 4
gcgcggccgc tcactggcgt gtag 24<210> 5 〈211〉 997 〈212> DNA <213〉人工序列 <220>
<223>重组质粒 <400> 5
tttaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattctgcag60
atatccagcacagtggcggccgcgccacaacccgggatccgctagccgccaccatgttgg120
agaaatgcttgaccgcgggccgttgctcgcgattgetttetttgtggtgtatcgtgccgt180
tctgttttgctgtgctcgccaacgccagcactcccatctacagctgattt240
ac肌cttgacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggctaacaaatttgattggg300
cagtggagagttttgtcatctttcccgttttgactcacattgtctcctatggtgccctca360
ctaccagccatttccttgacacagtcgctttagtcactgtgtctaccgccgggtttgttc420
tgtcctaagtagcatctacgcggtctgtgccctggctgcgttgacttget480
tcgtcattaggtttgcaaagaattgcatgtcctggcgctacgcgtgtaccagatatacca540
actttcttctggacactaagggcggactctatcgttggcggtcgcctgtcatcatagaga600
agttgaggtcgaaggtcatctgatcgacctc犯肌gagttgtgcttgatg660
gttccgtggcaacccctataaccagagtttcageggaacaatggggtcgtccttegatga720
cttctgtcatg咖gracggetc cacaaaaggtgcttttggcgttttctattacctacac780
gccagtgagcggccggttccCttt兆tg3gtcgagtctagagggccctcatcgatcctat840
cgatcctatcgatcctatcgatcctatcgatcctatcgatgggcccgttta犯cccgctg900
atcagcctcgactgtgccttetagttgecagccatctgttgtttgcccctcccccgtgcc960
ttccttgaccctggaaggtgCC￡lCtCCC3Ctgtcctt99权利要求
1、一种含有CpG序列的PRRSV ORF5基因核酸疫苗的制备方法，其特征在于制备步骤如下1)选用CpG-ODN序列引物A5’-CTCAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATCCTAT<u>CG</u>ATGGGCC-3’B5’-CATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC-3’2)PCR扩增ORF5基因设计扩增ORF5基因的引物为P5s5’-AATCTA<u>GCTAGC</u>CGCCACCATGTTGGA-3’，P5r5’-GC<u>GCGGCCGC</u>TCACTGGCGTGTAG-3’；为便于克隆，在上游引物和下游引物中分别添加了NheI酶切位点和NotI酶切位点；以质粒pIRES—ORF5ORF6为扩增模板，扩增ORF5基因，反应体系如下10×PCR buffer 5μl；dNTP Mixture4μl；P5s 2μl；P5r 2μl；模板2μl；Ex Taq E 0.5μl；用ddH2O补至50μl；扩增条件预变性95℃ 5min；变性94℃ 1min退火50℃ 1min延伸72℃ 1min共30 Cycles最终延伸72℃10min；3)pVAX1—ORF5载体的构建用限制性内切酶NotI/Nhe I消化PCR纯化产物和pVAX1，分别获得ORF5基因片段和线性载体pVAX1，将产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳，按照上海生工胶回收试剂盒说明书进行；连接、转化、挑菌、提质粒、用限制性内切酶NotI/NheI鉴定；4)CpG-pVAX1-ORF5重组质粒的构建将合成的两条CpG序列引物A、B按1∶1比例混合于95℃加热5min，后置于室温冷却，退火2h，获得CpG-ODN短序列；用限制性内切酶ApaI消化质粒pVAX1-ORF5，将pVAX1-ORF5和CpG-ODN按1∶3比例进行连接、转化、挑菌、质粒小提、用限制性内切酶NotI/Nhe I鉴定；将含有CpG-pVAX1-ORF5重组质粒的菌样送往联合基因有限公司生物公司，用Thermol Cyling全自动测序仪进行序列测定；5)重组质粒的纯化和转染细胞质粒的大量制备及纯化，按常规方法进行，溶于TE(pH8.0)中，测定质粒DNA纯度，贮存于-20℃；质粒DNA的定量以TE(pH8.0)为空白对照，用TZK-800Z紫外分光光度计测定波长260nm和280nm的核酸溶液光密度(OD)值，用含10％小牛血清的MEM培养基，在37℃，5％CO2的条件下培养COS-7细胞，待细胞长至对数生长期质粒转染细胞；采用脂质体法按说明书进行，设立空载体对照组；6)RT-PCR检测ORF5基因的转录情况收集筛选后稳定表达的细胞，按常规方法提取细胞总R N A，经反转录后用引物P5s和P5r扩增；7)间接免疫荧光实验(IFA)将质粒转染到长有70％COS-7细胞单层的玻片上，5％CO2、37℃培养三天后，取出玻片，用PBS液冲洗三次，100％冷丙酮固定15～30min，再用PBS液洗涤三次；用含有5％BSA封闭2h，冲洗三次，每次5min；加入一抗(猪抗PRRSV血清)，37℃作用2h后，冲洗3次；加入二抗(异硫氰荧光素标记的山羊抗猪IgG)，室温避光作用1h，冲洗3次；吸干，滴加50％甘油水溶液，倒置于载玻片上，荧光显微镜下观察；8)动物免疫6周龄雌性SPF昆明小鼠，体重18～26g，购于青岛药检所实验动物中心；免疫6周龄雌性SPF昆明小鼠，取脾淋巴细胞检测T淋巴细胞亚群的数量和淋巴细胞转化实验；采用间接ELISA方法分别测定小鼠血清中抗PRRSV抗体水平的变化；将全部血清均做1∶40倍稀释，最后测OD值；4周龄长白仔猪，经ELISA检测其PRRS抗体阴性；随机分为5组，每组5只，按如下五组免疫(A)正常对照组(注射生理盐水)；(B)空载体PVAX1组；(C)PVAX1-E组；(D)CpG-pVAX1-E组；(E)灭活疫苗组；B、C、D实验组剂量均为800ug/只，用前混合均匀，肌肉注射，免疫三次，间隔21天；正常对照组注射1ml生理盐水，灭活疫苗组(E组)按说明书接种；于每次免疫后10天和攻毒后四周采血，分离血清，-20℃保存备用；9)动物试验分别进行淋巴细胞转化试验(MTT法)，用IDEXX试剂盒检测猪外周血抗体水平，用IL-2的定量检测试剂盒检测IL-2的含量，猪体内PRRSV的RT-PCR检测，攻毒后4周将猪宰杀，取肺脏、肝脏、脾脏、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、肩前淋巴结、心脏、肾脏、脑组织、十二指肠等组织器官观察病理变化。
全文摘要
本发明为一种含有CpG-ODN和表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的核酸疫苗的制备方法。该方法是通过构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5，经酶切鉴定和序列测定，将重组质粒转染COS-7细胞，经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠和猪，检测鼠和猪的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平。试验结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠和猪产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。有效地提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果。
文档编号A61K39/12GK101422608SQ20081001406
公开日2009年5月6日 申请日期2008年1月23日 优先权日2008年1月23日
发明者任慧英, 吴家强, 顺 周, 宋春阳, 张秀美, 俊 李, 温建新, 王金宝 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所