专利名称：军曹鱼MHC-Ⅱα基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种蛋白编码序列，尤其是涉及一种军曹鱼MHC-II α基因序列。
背景技术：
MHC(major histocompatibility complex)即主要组织相容性复合体，是指染色 体上由一系列紧密连锁的基因位点所组成的具有高度多态性的复合遗传系统或区域。是由 MHC编码的一类细胞表面转膜蛋白，能结合并呈递内源抗原和外源抗原给T淋巴细胞。根 据化学结构和功能的不同，MHC可分为MHCI类分子和MHCII类分子。其中，II类MHC分子 呈递的抗原多是细胞外源性多肽，它在内质网内由α、β和辅助分子Y链组装成完整三聚 体，蛋白酶水解Y链，抗原多肽与II类MHC分子结合，形成稳定的II类MHC-多肽复合体， 再运至细胞表面，外源性抗原在线粒体或溶酶体中与MHCII类分子结合后呈递给协助T淋 巴细胞(Th，CD4+)，从而触发免疫反应。鱼类MHCII类分子是由a链和β链以非共价键的 形式组成一个异二聚体。MHC广泛参与免疫应答的诱导与调节，激发机体特异性免疫反应，在免疫学上具有 极为重要的意义。由于MHC具有多态性、与疾病的相关性以及连锁不平衡性的特点，因此， 了解鱼类MHC基因的结构与功能，寻找与疾病相关联的易感基因或疾病抵抗基因，对预防 疾病具有很高的价值。此外，由于MHC的高度多态性，故可用于种群遗传学研究，并作为种 群分子进化的标记之一。再者，MHC具有的多态性、与疾病的关联及其连锁不平衡等特点可 以用来选育抗病品系。
发明内容
本发明的目的是提供一种军曹鱼MHC-II α基因序列。本发明通过以近源物种MHC-II α基因的⑶S序列的保守区设计的兼并引物，并用 PCR法扩增，结合RACE技术克隆到军曹鱼MHC-II α链基因的全表达序列；通过对MHC-II α 基因设计有效地鉴定引物，从而可以通过荧光定量PCR来分析该基因的组织分布情况，并 对经LPS刺激后的脾脏中的MHCII α的表达量进行了分析。具体DNA核苷酸及相应的氨基 酸序列如下agtcgactctaagattcacagacgctcagctcagtgacctgctgctgacgaagatgatga 60XMM 2tcaagctgctcctcttcctcccctgtctcatctctgtctctgctgaaagtctccatgtgg 120Leader pept i deX α domainIKLLLFLPCPISVSAESLHV 22accttgctatcactggctgttcagactctgatggagaggatatgtactctctggatggag 180DLAITGCSDSDGEDMYSLDG 42aagagatgtggtttgcagacttcgtcaatcaaaggggagtggagcctcagcccagcttcg 240
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图1是本发明在军曹鱼正常组织中的分布；图2是本发明经LPS刺激后军曹鱼脾脏组织中的MHC-II α基因随时间的表达变化图。
具体实施例方式1.总RNA的提取取健康的军曹鱼(体重约IOOOg)在养殖桶中养殖3日后，腹腔注射Iml的鲨鱼弧菌(JT2)。刺激192h后，解剖鱼体取出脾脏约250mg，放入-80°C冰箱备用。取备用组织约 IOOmg用剪刀剪碎加入Iml的Trizol (美国invitrogen公司)进行勻浆，按照试剂盒说明 提取总RNA。2. cDNA第一链的合成取军曹鱼总RNA5yg与反转录引物(oligodT接头引物)1 μ 1 (lOpmol/L)混合， 65°C加热5min后，立即放置冰上静置2min，然后加入5Xbuffer，IOmmol/LdNTP混合液， Ribonuclease Inhibitor，M-MLV 反转录酶，反应体系为 20 μ 1。反应程序为 37°C、60min， 最后放入-80°C保存备用。3.引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如人、鼠、虹鳟等)MHCII-α同源基因⑶S序列，利用 Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物(J2AF、J2AR)， 扩增片段大小约为324bp。引物设计后提交英骏生物工程技术服务有限公司进行DNA合成。4.对军曹鱼MHC-II α基因cDNA全序列的克隆以近源物种MHC-II α基因⑶S序列的保守区设计的兼并引物(J2AF、J2AR)，扩增 片段大小约为324bp。以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产 物用的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物 克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。 经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物(RCMC32A0UT、RCMC32AIN、 RCMC52A0UT、RCMC52AIN)，利用 cDNA 末端快速扩增技术(Rapid Amplificationof cDNA ends, RACE)对目的基因的3 ‘和5 ‘末端进行PCR扩增。在3' RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物RCMC32A0UT 和3’接头引物SMART 3a进行PCR反应，所得产物利用内侧特异性引物RCMC32AIN和3’接 头引物SMART 3a再进行PCR扩增。在5' RACE中，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly (C)尾后，以加尾后 的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物RCMC52A0UT和OligodG进行第一次PCR扩增，所得 PCR产物再利用内侧引物RCMC52AIN和OligodG进行第二次PCR扩增。所得到的PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化 后，克隆到PMD-18T载体中，转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13弓丨物 对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用DNAStar软件进行 拼接。5.对军曹鱼MHC-II α基因的测定所得到的PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化 后，克隆到PMD-18T载体中，转化大肠杆菌Τ0Ρ10感受态细胞，挑取阳性克隆。测序结果用 BLAST软件进行同源性测定，来确定为军曹鱼MHC-II α基因同源序列。6、MHC-II α基因在不同组织中的RT-PCR分析取健康的军曹鱼(185g)心脏、脾脏、鳃、头肾、肌肉、心、肠和脑等组织，以反转录合成的第一链cDNA为模板，应用Real-time PCR检测方法对军曹鱼的MHC-II α基因组织表达特点进行了研究(β-ActinF，β -ActinR, J2AF，J2AR)。如图1所示，MHC-II α基因 在正常军曹鱼组织中均有所表达，其中较强的表达于头肾中，中等程度表达于鳃、脾、脑，在 心、肠、肌肉中表达较弱。7、RT-PCR 检测 MHC-II α mRNA 的表达情况提取经LPS刺激的不同时间点的脾脏组织RNA，以反转录合成的第一链cDNA为模 板，应用Real-time PCR检测LPS刺激后的脾脏中表达调控规律(β-ActinF，β -ActinR, J2AF，J2AR)。利用2_δ Δετ法计算相对表达量，如图2所示，经LPS刺激后MHC-II α基因表 达呈现下降的趋势，相对于对照组都具有显著性差异。本发明使用的引物见下表
引物名称Prime 核酸序列(5' -3' )Nucleotide sequence应用范围
RCMC2AFTCCTCCTTCCACGCTCAT兼并引物
RCMC2ARAACACCGCAGGTCCGATA兼并引物
oligo-dT 接头引物 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)VN反转录
SMART 3aCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT3' RACE
RCMC32AOUTCAACAACGCATGACCAGGATCT3， RACE
RCMC32AINATCGGACCTGCGGTGTTC3' RACE
Olido-dGGGGGGGGGGGGGGGG(A/T/C)5， RACE
RCMC52AOUTAfiGTCCGATACTGGGCTGC5' RACE
RCMC52AINATGATGAGCGTGGAAGGAGG5' RACE
β -ActinFTGAGACCACCTACAACAGCRT-PCR 内参
β -ActinRCTGCATCCTGTCAGCGATRT-PCR 内参
J2AFTCGGTCTGACGGTCGGTTRT-PCR
J2ARTCTCTGAAGCAGGTGAAGCC_RT-PCR_
权利要求
一种军曹鱼MHC-IIα基因序列链基因序列，其特征在于它的DNA核苷酸及相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
全文摘要
本发明公开了一种军曹鱼MHC-IIα基因序列，它的DNA核苷酸及相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。本基因的获得不仅为研究鱼类MHC-IIα类分子的作用机理以及MHC-IIα基因多态性与鱼体抗病力的关系奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究新型的抗病免疫抗体成为现实。
文档编号C12N15/12GK101812458SQ201010109630
公开日2010年8月25日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者侯月娥, 冯娟, 徐力文, 王江勇, 苏友禄, 茅莉娜, 郭志勋 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所