专利名称：新疆出血热病毒核蛋白抗原基因及其重组蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗原基因技术领域，是一种新疆出血热病毒核蛋白抗原基因 (XHFNP235)及其重组蛋白和应用。
背景技术：
克里米亚-刚果出血热(Crimean-CongoHemorrhagic Fever, CCHF)是一种广泛 流行于非洲、亚洲、东欧和中东等地区经蜱传播的病毒性自然疫源性疾病，其病原体为克里 米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus, CCHFV)，平均病死率 在 10% -50%。克里米亚-刚果出血热在我国又称新疆出血热(Xinjiang Hemorrhagic Fever, XHF)，该病原体新疆出血热病毒(Xinjiang Hemorrhagic Fever Virus，，XHFV)是目前我 国存在的唯一被证实有自然暴发流行的生物安全四级(Laboratory Biosafety Level 4， BSL-4)病原体。由于该病毒可在人_人间传播，平时发病较少，临床医生没有诊断该病的经验，误 诊极易导致医院内暴发流行，类似SARS，危害极大；同时，战争、未知疫源地内的大规模经 济开发和生物恐怖袭击(该病毒被列为重要生物恐怖战剂之一)都会造成该病的严重流行 和危害。新疆出血热已在新疆发生数次局部暴发流行。目前，还没有有效地针对CCHF的预 防和治疗手段。CCHFV属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)内罗病毒属(Nairovirus)，病毒基因 组由大(L gene)、中(M gene)、小(S gene)三股负链RNA片段组成，分别编码RNA聚合酶 (RNA-d印endent-polymerase)、糖蛋白(GP)及核蛋白(NP)。新疆出血热病毒核蛋白抗原 位点呈线性分布且性质稳定，是病毒诱导机体产生早期体液免疫和细胞免疫的主要抗原。S 基因编码的核蛋白已表达于不同的系统，并证明可做为克里米亚_刚果出血热病的诊断性 抗原。通过基因重组的方法获得具有相同或相似抗原特异性，而不再具有完整蛋白毒性的 抗原片段，已成为预防和诊断新疆出血热病理想的候选诊断性抗原试剂。
发明内容
本发明提供了一种从新疆出血热病毒中得到的新疆出血热病毒核蛋白抗原基因 (XHFNP235)及其重组蛋白和应用，特别是在制备预防或诊断新疆出血热病的诊断性抗原试 剂中的应用。本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的一种从新疆出血热病毒中得到 的新疆出血热病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原基因，其具有序列1的核苷酸序列。下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或改进通过设计一对引物，从新 疆出血热病毒中得到的新疆出血热病毒核蛋白抗原基因XHFNP235，该引物分别为Ji 游弓丨· (Primer)5 ‘ —ccggatcccttgccaagcttgcagagactgaagggaagggagt g-3'，
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下游引物(Primer) 5' -ccgaattcctatcaatctgtgcaccctgtgcacgaagtgcagacgagtt tttgt-3'。本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的上述的新疆出血热病毒核蛋白 抗原基因即XHFNP235抗原基因的重组蛋白。本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的上述的新疆出血热病毒核蛋白 抗原基因即XHFNP235抗原基因在制备预防或诊断新疆出血热病的诊断性抗原试剂中的应用。本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的上述的重组蛋白在制备预防或 诊断新疆出血热病的诊断性抗原试剂中的应用。本发明从新疆出血热病毒中得到新疆出血热病毒核蛋白抗原基因XHFNP235及其 重组蛋白。通过PCR扩增，克隆，转化，表达质粒构建，诱导表达，免疫学检测，新疆出血热抗 原表位定位在NP蛋白的第235-305位氨基酸区域，这个区域也是NP蛋白的一个高度保守 的氨基酸区域，进一步表明XHFNP235重组蛋白可以成为新疆出血热病的候选诊断抗原，为 新疆出血热病的诊断和应用提供一条新的途径。
四
附图1为本发明新疆出血热病毒核蛋白抗原XHFNP235重组质粒琼脂糖凝胶电泳 结果，其中，M为DL2000 ；1为本发明XHFNP235的重组质粒双酶切EcoR I和BamH I产物。附图2为本发明XHFNP235重组蛋白SDS-PAGE电泳分析结果，其中，1为pGEX_KG 载体表达蛋白，2为pGEX-KG NP核蛋白全长表达蛋白，3为本发明pGEX-KG_XHFNP235表达 蛋白，4为pGEX-KG-XHFNP235纯化蛋白，M为蛋白分子量marker。附图3为用抗新疆出血热病毒的多克隆兔血清对本发明XHFNP235重组蛋白 Western-blot免疫学检测分析结果，其中，1为pGEX-KG表达蛋白，pGEX-KGNP表达蛋白， pGEX-KG XHFNP235 重组蛋白。
五具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可依据本发明的技术方案和实际情况来确定具体 的实施方式实施例1 利用聚合酶链式反应(PCR)技术和基因重组技术大量获得本发明新疆 出血热病毒核蛋白N235抗原基因。根据新疆出血热病毒S基因序列分别设计引物，以cDNA为模板，PCR扩增目的 片段。PCR 反应体系为cDNA2yL，10XEx Taq Buffer2 μ L, Sterilized dH2012. 9μ L, Ex Taq (5U/ μ L)0. 5μ L, Plprimer (20 μ M)0. 3 μ L, P2primer (20 μ M)0. 3 μ L, dNTP Mixture (each 10mM)2yLo根据新疆出血热病毒核蛋白基因序列，设计引物。上游引物Pl (Primer)5 ‘ -ccggatcccttgccaagcttgcagagactgaagggaagggagtg-3‘，下游引物P2 (Primer)5' -ccgaattcctatcaatctgtgcaccctgtgcacgaagtgcagacgagtttttgt—3‘。
PCR扩增本发明XHFNP235基因的反应条件为94°C，10分钟；32循环包括94°C 30 秒，61°C 30秒，720C 1分钟；最后72°C持续10分钟。利用PCR扩增仪扩增，扩增产物经1. 0% 琼脂糖凝胶电泳进行检测，并测序正确后，将PCR扩增获得片段XHFNP235基因片段克隆到 pGEX-KG的多克隆位点(EcoR I和BamH I)。重组质粒pGEX-KG_XHFNP235经酶切鉴定，大 小为5110bp，酶切条带与预期大小相符。如附图1所示。实施例2 获取本发明XHFNP235重组蛋白。将本发明XHFNP235基因片段克隆到pGEX_KG原核表达载体上，转化至大肠杆菌 BL21(具有表达功能)中，接种于含氨卞青霉素(50yg/mL)的3mL LB培养基中，37°C， 220rpm/min振荡培养过夜后，按1 100接种于含相同浓度氨卞青霉素的LB培养基中， 370C，220rpm/min,培养3h后，至OD600 ^0.4时，加入IPTG至终浓度为0. 4mmol/L,继续振 荡培养3h，于4°C，4000rpm/min,离心12min，收集细菌。用适量PBS悬浮菌体，加入上样缓 冲液 W. 08M Tris/HCl(pH 6. 8)，2% SDS，10%甘油，5% β -巯基乙醇，0. 005%溴酚蓝]， 煮沸lOmin，12000Xg离心10分钟，取5μ L上清液进行12% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝 R-250染色。在电泳图的32KDa处可见本发明XHFNP235重组蛋白表达，其附图2所示，表明 本发明XHFNP235重组蛋白成功表达。实施例3 采用本发明XHFNP235重组蛋白为抗原，采用ELISA方法检测采自新疆 出血热流行区的动物血清样本的应用。3. 1以XHFNP235重组蛋白为抗原建立XHFV抗体的ELISA检测方法(1)制备抗原板用包被液(0. 05M pH9. 6的碳酸盐缓冲液)稀释XHFNP235重组 蛋白至1 μ g/ml，酶标板每孔0. 2ml，置37°C温箱2h后转至4°C冰箱过夜，翌日PBST洗液冲 洗5遍后拍干备用。(2)抗原板每孔加1/100稀释的羊血清100 μ 1，将酶标板置湿盒内37°C温箱反 应lh，同时需做阳性、阴性、空白对照；PBST洗液洗4-5遍后拍干，加1/500稀释的兔抗 羊IgG-HRP酶标记物100 μ 1，置湿盒内37°C温箱反应Ih ；PBST洗液洗4_5遍后拍干，加 TMB (四甲基联苯胺)显色液，A液B液各100μ1，37 孵育lOmin，加2Μ H2SO4终止液，每孔 200 μ 1，置酶标仪0D45(1、OD630双波长读取结果。3. 2对来自新疆出血热流行区动物血清中XHFV抗体的检测共对来自新疆出血热流行区尉犁县实验组羔羊(采用药物驱蜱组)血液份85，对 照组(未采用药物驱蜱组)37份，以及XHFV抗体阳性对照组羊血清10份，共计132份进行 检测。阳性对照组阳性率为100%，实验组CCHFV抗体阳性数19份，阳性率22.3%，对照组 阳性17份，阳性率45. 9%。经卡方检验具有极显著性差异，表明药物驱蜱抑制带有XHFV侵 袭羔羊可以有效控制羔羊感染新疆出血热。通过以上实验表明，本发明XHFNP235重组蛋白能够检测人和动物血清是否感染 有出血热病毒，可以成为检测新疆出血热病的候选诊断抗原。综上所述，通过XHFNP235基因的克隆，转化，诱导表达和血清检测实验，进一步表 明XHFNP235重组蛋白可以成为检测新疆出血热病的候选诊断抗原，为新疆出血热病的诊 断和应用提供一条新的途径。本发明新疆出血热病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原基因的核苷酸的序列1 见序列表。
权利要求
一种从新疆出血热病毒中得到的新疆出血热病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原基因，其特征在于具有序列1的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的新疆出血热病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原基因，其 特征在于通过设计一对引物，从新疆出血热病毒中得到的新疆出血热病毒核蛋白抗原基因 XHFNP235，该引物分别为J^iit弓L (Primer)5‘ -ccggatcccttgccaagcttgcagagactgaagggaagggagtg-3‘，下游弓 I物(Primer) 5 ‘ -ccgaattcctatcaatctgtgcaccctgtgcacgaagtgcagacgagtttttg t-3'。
3.一种含有权利要求1或2所述的新疆出血热病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原 基因的重组蛋白。
4.一种根据权利要求1或2所述的新疆出血热病毒核蛋白抗原基因即XHFNP235抗原 基因在制备预防或诊断新疆出血热病的诊断性抗原试剂中的应用。
5.一种根据权利要求3所述的重组蛋白在制备预防或诊断新疆出血热病的诊断性抗 原试剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及抗原基因技术领域，是一种新疆出血热病毒核蛋白抗原基因(XHFNP235)及其重组蛋白和应用，该基因具有序列1的核苷酸序列。本发明从新疆出血热病毒中得到新疆出血热病毒核蛋白抗原基因XHFNP235及其重组蛋白。通过PCR扩增，克隆，转化，表达质粒构建，诱导表达，免疫学检测，新疆出血热抗原表位定位在NP蛋白的第235-305位氨基酸区域，这个区域也是NP蛋白的一个高度保守的氨基酸区域，进一步表明XHFNP235重组蛋白可以成为新疆出血热病的候选诊断抗原，为新疆出血热病的诊断和应用提供一条新的途径。
文档编号C12N15/40GK101921781SQ20101010949
公开日2010年12月22日 申请日期2010年2月12日 优先权日2010年2月12日
发明者孙素荣, 张渝疆, 魏鹏飞 申请人:新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心