专利名称：Nyggf4基因序列在制备影响脂肪细胞增殖药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及NYGGF4基因序列在制备影响脂肪细胞增殖药物中的应用。
背景技术：
肥胖，是一种常见的能量代谢性疾病，已成为日趋严重的全球性流行病。肥胖与冠心病、高血压、高脂血症、糖尿病、脑血管意外等多种疾病关系密切，严重危害着患者的身心健康。目前已知肥胖是机体在遗传、环境、行为因素或三者相互作用下能量代谢失衡的结果，并且随着遗传学和生物学的发展，遗传因素在肥胖发生中的重要性已倍受重视。已有研究结果指出，肥胖发生的病因中遗传因素占40-70％，开展肥胖病因的遗传学研究十分重要。
在前期研究工作中，发明人以抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization，SSH)技术筛选肥胖与正常人网膜脂肪组织中的差异表达基因(differentially expressedgenes)，获得表达差异基因片断后进一步筛查人脂肪组织cDNA文库，克隆到一条在肥胖者脂肪组织中表达显著上调的基因——发明人将此基因序列命名为NYGGF4(即SEQID No.1)，并将该序列登录GenBank(登录号AY317148)。该基因cDNA全长1527bp，开放阅读框长753bp(32～784)，编码250个氨基酸，分子量约28.271kDa。通过与基因库比对未发现相同序列，因此NYGGF4为一条新基因，其功能可能与肥胖的发生发展相关。
进一步为分析NYGGF4基因的生物学属性，发明人应用能够表达融合蛋白NYGGF4一绿色荧光蛋白的表达质粒(NYGGF4-pEGFP-N2)(购买自美国BD生物公司)，转染不同细胞，根据绿色荧光蛋白在荧光显微镜下可直接观察的特点，以融合蛋白NYGGF4一绿色荧光蛋白的亚细胞定位，初步判断NYGGF4蛋白(即由NYGGF4基因序列第32～784位编码的250个氨基酸的蛋白质)的亚细胞定位，结果发现该融合蛋白定位胞浆内，且有沿质膜内侧呈区域性聚集的现象。此与应用PSORT II、TMHMM、SMART等分析软件预测的结果相符亚细胞定位预测结果显示NYGGF4蛋白定位在胞浆；蛋白跨膜分析显示NYGGF4蛋白无跨膜螺旋结构，为一非分泌型蛋白。另外通过蛋白结构域分析，提示NYGGF4蛋白的N端有一较短的亲脂性靶向序列，C端有一PTB结构域(phosphotyrosine-binding domain，PTB domain)，因此NYGGF4蛋白作为一种胞浆分子，参与细胞增殖过程中的信号转导。但目前没有关于NYGGF4基因序列及其表达产物功能的报道。
发明内容
本发明的目的是针对NYGGF4基因序列功能不明的技术问题，提供了NYGGF4基因序列在制备影响脂肪细胞增殖药物中的应用。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的NYGGF4基因序列在制备影响脂肪细胞增殖药物中的应用。采用常规的基因工程技术将NYGGF4基因序列制备成基因工程药物(基因疫苗)，如将NYGGF4基因序列导入噬菌体、质粒，转染细胞，表达相应的多肽或蛋白质，从而可以利用这此表达载体或表达的产物制备促进脂肪细胞增殖的药物；在明确NYGGF4基因序列功能区域的基础上，也可以通过人工合成的方式合成相应的多肽或蛋白质；相反地，根据本发明提供的NYGGF4基因序列表达产物可以促进脂肪细胞增殖的研究结果，可以根据NYGGF4基因序列采用常规的基因工程技术制备抑制NYGGF4基因序列表达产物的功能的药物，如制备NYGGF4序列表达产物(多肽或蛋白质)的单克隆抗体，或者在基因表达的水平抑制NYGGF4序列表达，从而制备抑制脂肪细胞增殖的药物。
上述这些影响脂肪细胞增殖的药物可以作用于全身的脂肪组织，也可以与靶向定位物质结合，从而作用于特定部位，影响特定部位的脂肪细胞增殖。
本发明的有益效果本发明提供NYGGF4基因序列在制备影响脂肪细胞增殖药物中的应用，该应用显示在脂肪细胞中稳定表达NYGGF4蛋白，与阴性对照相比，明显促进脂肪细胞的增殖速度，从而可利用NYGGF4基因序列制备影响脂肪细胞增殖的药物。
图1是在稳定表达NYGGF4蛋白的细胞、空载转染对照细胞和未转染阴性对照细胞中应用NYGGF4特异性引物扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。其中1、3分别为空载转染对照和未转染细胞对照，无NYGGF4阳性条带；2为稳定表达NYGGF4的脂肪细胞，特异性扩增条带为753bp(蛋白编码框序列)；MMarker。
图2是稳定表达NYGGF4蛋白的脂肪细胞和对照细胞生长曲线图。其中 稳定表达NYGGF4蛋白的脂肪细胞(NYGGF4)； 空载转染对照细胞(Emptyvector)； 未转染阴性对照细胞(Normal 3T3-L1)。
图3是稳定表达NYGGF4蛋白的脂肪细胞和对照细胞24小时细胞各周期分布图。其中NYGGF4-pCDNA3.1 3T3-L1稳定表达NYGGF4蛋白的细胞，pCDNA3.1 3T3-L1空载转染对照细胞，3T3-L1未转染阴性对照细胞；G1染色质合成前期，S染色质合成期，G2/M染色质合成后期及分裂期。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明实施例11.材料和方法1.1 试验材料本试验所需的具有新霉素抗性的真核表达载体pCDNA3.1myc/his a(-)购自美国invitrogen公司。脂肪前体细胞3T3-L1购自美国ATCC细胞库，细胞筛选的新霉素G418购自美国sigma公司。本试验过程中所采用的酶、pMD-18T载体、大肠杆菌感受态细胞、dNTP等生化试剂均购自大连宝生物公司。
1.2 表达载体的构建采用Trizol提取人网膜下脂肪组织RNA(具体步骤参考invitrogen产品操作手册)，经反转录成cDNA，然后利用NYGGF4的特异性引物上游引物的序列为5′-ATGTTCAGCCTGCCCCTTAG-3′(SEQ ID No.2)，下游引物的序列为5′-GCCATCATCGGATTCCAATTC-3′(SEQ ID No.3)，扩增出包含NYGGF4蛋白编码序列的PCR产物，直接连接入pMD-18T载体，进行测序验证NYGGF4序列已插入并且序列无错误。以此重组载体为模版，PCR扩增两头带HindIII和EcoRI酶切位点产物。将扩增后产物与真核表达载体pCDNA3.1myc/his a(-)采用上述两种酶进行酶切，酶切后纯化连接产物，转化入大肠杆菌来源的感受态细胞，挑克隆送测序。测序验证NYGGF4插入无误后抽提质粒待用。
1.3 NYGGF4稳定表达细胞的筛选与建立将构建好的NYGGF4真核表达载体转染脂肪前体细胞3T3-L1，以空载转染和未转染的脂肪前体细胞3T3-L1作为对照。转染后24小时，用新霉素G418(浓度为800μg/ml)进行筛选。筛选维持两周，含有NYGGF4表达的阳性细胞株存活，其余无表达的细胞死亡，G418降至200μg/ml维持，细胞繁殖扩增。将转染NYGGF4基因、空载转染以及未转染的3T3-L1抽提RNA并反转录，应用NYGGF4特异性引物进行PCR扩增，验证NYGGF4的表达。通过电泳结果表明NYGGF4蛋白只在转染后的细胞中存在，而空载转染和未转染的对照细胞中均无NYGGF4蛋白的表达，证明稳定转染成功。(见图1)1.4 脂肪细胞增殖的测定A.将稳定表达NYGGF4蛋白的细胞、空载转染对照细胞及未转染阴性对照细胞，接种于96孔细胞培养板，接种密度约为每孔500个细胞，以DMEM高糖培养基培养一周。每天取细胞进行细胞生长活力(MTT)测定，连续7天后，根据MTT吸光度值画出生长曲线(见图2)。
B.将稳定表达NYGGF4蛋白的细胞、空载转染对照细胞及未转染阴性对照细胞，培养于细胞培养瓶。以无胎牛血清的DMEM高糖培养基培养48小时后，使细胞同步化，停留于G0期。恢复含胎牛血清的DMEM高糖培养基进行培养，并在恢复含血清培养后的第0、12、18、24小时收取细胞，70％冰乙醇固定后经流式细胞仪检测细胞各周期分布，计算不同时间点S期细胞(染色质合成期)分布(代表细胞增殖能力)。
2.结果通过MTT试验发现在7天中，稳定表达NYGGF4蛋白的细胞增殖速度明显快于空载转染对照细胞和未转染对照细胞，细胞个数明显增加。通过细胞周期检测发现，在恢复含血清的培养基后第12、18、24小时，稳定表达NYGGF4蛋白的细胞中S期细胞组分明显大于两对照组，表明染色质合成期细胞增多，细胞增殖速度变快(见图3)。
序列表<110>郭锡熔 王玢 陈荣华 倪毓辉 彭宇竹<120>NYGGF4基因序列在制备影响脂肪细胞增殖药物中的应用<160>3<210>1<211>1527<212>DNA<213>天然序列，来源人类组织细胞<400>1atgaaaagcc ttgtacaaga ggcttcgtgc catgttcagc ctgcccctta gccttccact 60gtgtgaggac acagcattcc ttccttccaa gtgctgcagc tctcacaaga caatcaaaca 120agcccgcacc ttgatcatga tcttcctagc ctccggaacg cactttcaga ccatgctgaa 180gtctaaattg aatgtcttaa cactgaaaaa ggaacctctc ccagcggtca tcttccatga 240gccggaggcc attgagctgt gcacgaccac accgctgatg aagacaagga ctcacagtgg 300ctgcaaggtt acctacctgg gcaaagtctc caccactggc atgcagtttt tgtcaggctg 360cacagaaaag ccagtcattg agctctggaa gaagcacacg ctagcccgag aggatgtctt 420tccggccaat gccctcctgg aaatccggcc attccaagtt tggctccatc atctcgacca 480caaaggggag gccacagtgc acatggatac cttccaggtg gcccgcatcg cctactgcac 540cgccgaccac aacgtgagcc ccaacatctt cgcctgggtc tacagggaga tcaatgatga 600cctgtcctac cagatggact gccacgccgt ggagtgcgag agcaagctcg aggccaagaa 660actggcccac gccatgatgg aggccttcag gaagactttc cacagtatga agagcgacgg 720gcggatccac agcaacagct cctccgaaga ggtttcccag gaattggaat ccgatgatgg 780ctgaatgaac ttgagacgct tcagcaaagg cagcattggt cacggagttc aagggaatag 840atgagtaagc aacgtttcaa atttgggatg aaaagactgc caaactattg gctgaccaag 900gtttttaaat tcagaagagc aattctaaat ctaaagaaat gtatcattaa agtaattacg 960ttacattgaa acctgctgct gctgtgactg tgaggagggt gggagtgtgg atggggagga 1020aggttctagg ctctcttctt atttttctca tttcccaatg cctctctgtg ggagagcttc 1080atgccagttt tcaccacgct caggcaaata ctctgcagct gttattggat gggccattcc 1140gatctgcctt atgaaattcc acaagaatgt taggggcacc ctctttcccc ttctaacatc 1200
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<223>上游引物<400>2atgttcagcc tgccccttag 20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>下游引物<400>3gccatcatcg gattccaatt c 2权利要求
1.NYGGF4基因序列在制备影响脂肪细胞增殖药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于NYGGF4基因序列在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于NYGGF4基因序列在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，公开了NYGGF4基因序列在制备影响脂肪细胞增殖药物中的应用。本发明针对NYGGF4基因序列功能不明的技术问题，提出了NYGGF4基因序列在制备影响脂肪细胞增殖药物中的应用的技术方案，包括利用NYGGF4基因序列在制备促进或抑制脂肪细胞增殖药物中的应用，从而可利用NYGGF4基因序列制备影响脂肪细胞增殖的药物。
文档编号A61P3/04GK1907490SQ200610041169
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月10日 优先权日2006年8月10日
发明者郭锡熔, 王玢, 陈荣华, 倪毓辉, 彭宇竹, 龚海霞, 张敏, 刘峰, 辜楠, 范红旗, 邱洁, 池霞, 费莉, 潘晓勤, 郭梅, 钱玲梅, 夏黎, 顾筱琪, 韩树萍, 刘茹, 童梅玲 申请人:郭锡熔, 王玢, 陈荣华, 倪毓辉, 彭宇竹