专利名称：针对HCMV UL122基因的siRNA序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术，涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及针 对人巨细胞病毒(HCMV) UL122基因的siRNA序列的设计、筛选及其在体 内外抑制HCMV的应用。
背景技术：
1. HCMV的治疗现状HCMV属p疱疹病毒亚科，在人群中感染广泛，但大多为无症状的亚临床 感染。HCMV感染在免疫功能低下的人群(如AIDS、器官移植患者等)中则 可引起多系统的严重疾病，且可能与多种恶性肿瘤的发生有关。同时，HCMV 也是导致先天畸形和新生儿出生缺陷的最主要的感染性因素。因此，防治 HCMV感染一直是国内外医学关注的热点之一。目前，HCMV的治疗药物主 要包括更昔洛韦(ganciclovir, GCV)、膦甲酸钠(fascamet, FOS)和西多福韦 (cidofovir,CDV)，但是由于药物毒副作用和HCMV耐药株的出现，急需探索 新的治疗途径控制HCMV感染。2. UL122基因及其表达蛋白的研究现状HCMV的基因组表达具有一定时序性，可分为即刻早期(IE)、早期(E) 和晚期(L)三种时相蛋白。主要IE基因UL122经过选择性剪接产生长度分 别为2.25kb (外显子1，2，3,5)和1.70kb (外显子1， 2, 3， 5')的mRNA，分别 编码正286 (86kDa，580个aa)和正255 (55kDa, 425个aa)两种核磷蛋白。研 究表明，UL122基因是HCMV的增殖必需基因，缺失UL122的HCMV突变 株不能产生增殖性感染。UL122基因编码的正286蛋白在病毒复制和调节宿主 细胞周期等方面发挥关键作用。正286不仅能够反式激活多种病毒和细胞的启 动子，而且也能作为抑制子下调主要正蛋白的表达。另外，正286通过多种途 径抑制被感染宿主细胞的凋亡，包括与凋亡诱导因子p53结合使其失活；通 过干扰p53的修饰抑制其激活；阻止不依赖p53的凋亡通路如TNF调节的死 亡受体信号途径；诱导NF-zcB转录，在适当条件下NF-;cB通过诱导cIAPs阻 止细胞凋亡。3. RNA干扰的研究现状RNA干扰(RNA interference, RNAi)是序列特异的双链RNA (dsRNA) 使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性基因表达沉默的过程。它是机体 的一种小分子RNA介导的序列特异性免疫保护机制，可以对抗侵入性遗传因 子的作用。自1998年首次被报道以来，RNAi技术以其特有的优越性而被迅速 应用于抗病毒及其相关方面的研究中，目前已在HIV、 HBV、 HCV、流感病毒 等的抗病毒研究中取得重要进展。RNAi的作用主要由长约21~23nt的dsRNA介导，其中一类称为小干扰 RNA (small interfering RNA, siRNA)，它和目的mRNA序列具有严格的配对， 能引起相应mRNA降解。由于RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特异性 降解，因此要产生有效RNAi的关键是选择合适的siRNA作用耙点。目前RNAi 靶点的选择原则可以概括为以下几点①选择GC含量在50%左右的mRNA 区域；②避免选择启动子起始部位下游50 100nt以内或终止子上游50 100nt 内的区域；③避免超过三个G或三个C的重叠，因为多聚G或多聚C能形成 类聚物而干扰RNAi的沉默机制；④选择以两个AA开始的序列，这将使合成 siRNA更加容易；⑤保证靴序列与其他基因没有同源性。目前，制备siRNA 的方法主要包括化学合成法、体外转录法、长片段dsRNA经RNase III降解法、 siRNA表达载体转录法及PCR制备的siRNA表达框法等5种。 发明内容本发明的目的是提供一种针对人巨细胞病毒UL122基因的siRNA的 cDNA序列，其核苷酸序列是5'-GGAAGAACAGGGTGAAGAAGT-3'。本发明的另一个目的是提供该cDNA序列在制备治疗人巨细胞病毒感染 的药物中的应用。本发明根据siRNA设计原则，选择的siRNA其cDNA序列的GC含量为 47.6%，对应UL122 mRNA中618-638核苷酸位点；构建针对HCMV UL122 基因的siRNA真核表达载体，转化大肠杆菌后提取质粒，转染AD293细胞， 可有效抑制UL122基因mRNA和蛋白表达水平，因此可应用于HCMV治疗药 物的制备。本发明的有益之处是提供的siRNA序列针对HCMV的增殖必需基因 UL122,目前国内外尚无以此基因作为RNAi靶点的报道。以此序列为基础的 真核表达载体在细胞中能有效抑制UL122基因mRNA水平和蛋白表达水平， 因此可作为HCMV治疗药物开发的一个新靶点。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步的说明。实施例一 siRNA真核表达载体体外抑制UL122-EGFP融合蛋白的表达1. siRNA的设计根据siRNA设计原则，从UL122 mRNA起始密码子AUG 下游100nt处搜索AA序列，其3'端相邻21nt序列作为候选靶点，从中选择 GC含量在40~55%的siRNA序列，并通过GenBank数据库的Blast功能与人 类基因组序列进行比对，确保无同源性。最终选择的siRNA其cDNA序列为 5，-GGAAGAACAGGGTGAAGAAGT-3，， GC含量为47.6%，对应UL122 mRNA 中618-638核苷酸位点。2. 表达siRNA所需shDNA的合成与制备表达siRNA所需shDNA的正 义 链 序 列 为TCCTTTTTA隱3， ， 反义链序列 为TGTTCTTCCG-3，，委托生物公司合成后，将正、反义链退火形成双链。3. siRNA真核表达载体的构建具有U6启动子的真核表达质粒pSilencer 2.0-U6(美国Ambion公司)用BamHI和Hind III双酶切，与退火后的shDNA 双链连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a， 37。C培养过夜，挑取克隆抽提质 粒送上海英骏公司进行DNA测序鉴定，选取测序结果正确的质粒扩增、保存。4. siRNA表达质粒体外抑制UL122-EGFP融合蛋白表达的实验(1) 报告质粒pUL122-EGFP:为表达绿色荧光蛋白(EGFP)和UL122融 合蛋白的质粒，由UL122基因cDNA插入pEGFP-Nl (美国Clontech公司)的 Hind m和EcoRI位点构建而成，由于EGFP位于UL122的下游，且共用一个 启动子，故EGFP的表达情况可间接反映UL122的表达。(2) siRNA表达质粒与报告质粒共转染AD293细胞人胚肾细胞AD293 接种12孔细胞培养板后，待细胞达到80%~90%融合率，用Invitrogen公司 Lipofectamine 2000试剂将siRNA表达质粒与报告质粒pUL122-EGFP共转染细 胞，操作方法参照试剂说明书，同时设转染空质粒pSilencer 2.0-U6的阴性对 照组和不转染质粒的空白对照组，5小时后换培养液(含10%新生牛血清的 DMEM)继续培养。(3) 荧光定量RT-PCR检测AD293细胞中UL122 mRNA的表达质粒转染 后48h，收集AD293细胞，Trizol法抽提细胞总RNA，采用TAKARA公司的SYBR PrimeScript RT-RCP Kit检测病毒UL122的mRNA，实验方法参照试剂 盒说明书。UL122 基因 PCR 引物序列为上游 5，國CGGCTGTATCGTGATCTCTG-3， ， 下 游5'-CAGGAGGAGGAAGACGAAGA-3'。内参照采用GAPDH， PCR引物序列 为 上 游 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，， 下 游 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。结果显示，与阴性对照组相比，siRNA 表达质粒对UL122 mRNA表达的抑制率为59.4%。(4)流式细胞仪检测AD293细胞中UL122蛋白表达情况:质粒转染后72h， 收集每孔内细胞，用PBS缓冲液洗涤2次后重悬于PBS中。用流式细胞仪在 488nm激发波长下检测每孔细胞平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)及荧光阳性细胞比率a，计算每孔细胞的总荧光强度(total fluorescence intensity, TFI) = MFI x a 。结果显示，与阴性对照组相比，siRNA表达质粒对 UL122蛋白表达的抑制率为82.0%。本发明系结合最佳实施例进行描述，在阅读了本发明的上述内容后，本领 域技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利 要求书所限定的范围内。本发明涉及的序列<210> 1<211>21<212> DNA<213>人工序列<220><223>根据HCMV UL122基因设计的siRNA的cDNA序列 <400> 1GGAAGAACAG GGTGAAGAAG T 21<210>2 <211>57 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>制备UL122基因siRNA所需shDNA正义链的序列 <400> 2<210> 3 <211>57 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>制备UL122基因siRNA所需shDNA反义链的序列 <400> 3<210>4 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220><223> UL122基因PCR上游引物序列 <400> 4CGGCTGTATC GTGATCTCTG 20<210> 5 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220>〈223〉UU22基因PCR下游引物序列 <400> 5CAGGAGGAGG AAGACGAAGA 20<210>6 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列 <220><223> GAPDH基因PCR上游引物序列 <400> 6GAAGGTGAAG GTCGGAGTC 19<210> 7 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220><223> GAPDH基因PCR下游引物序列 <400> 7GAAGATGGTGATGGGATTTC 20
权利要求
1.一种针对人巨细胞病毒UL122基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是5’-GGAAGAACAGGGTGAAGAAGT-3’。
2. 权利要求1所述的cDNA序列在制备治疗人巨细胞病毒感染的药物中 的应用。
全文摘要
本发明提供一种针对HCMV UL122基因的siRNA的cDNA序列5’-GGAAGAACAGGGTGAAGAAGT-3’。本发明根据siRNA设计原则，选择的siRNA其cDNA序列为5’-GGAAGAACAGGGTGAAGAAGT-3’，GC含量为47.6％，对应UL122 mRNA中618-638核苷酸位点，构建针对HCMV UL122基因的siRNA真核表达载体，转化大肠杆菌后提取质粒，转染AD293细胞，可有效抑制UL122基因mRNA和蛋白表达水平，可在制备治疗人巨细胞病毒感染的药物中的应用。
文档编号A61K31/713GK101333528SQ20081006331
公开日2008年12月31日 申请日期2008年8月1日 优先权日2008年8月1日
发明者尚世强, 段群军, 胡妙凤, 赵正言, 然 陶 申请人:浙江大学