专利名称：针对HCMV UL86基因的siRNA序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术，涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及针 对人巨细胞病毒UL86基因的siRNA序列的设计、筛选及其在体内外抑制人巨 细胞病毒的应用。
技术背景人巨细胞病毒(HCMV)属(3疱疹病毒亚科，在人群中感染广泛，但大多 为无症状的亚临床感染。HCMV感染在免疫功能低下的人群(如AIDS、器官 移植患者等)中则可引起多系统的严重疾病，且可能与多种恶性肿瘤的发生有 关。同时，HCMV也是导致先天畸形和新生儿出生缺陷的最主要的感染性因素。 因此，防治HCMV感染一直是国内外医学关注的热点之一。目前，HCMV的 治疗药物主要包括更昔洛韦(ganciclovir, GCV)、膦甲酸钠(fascarnet, FOS) 和西多福韦(cidofovir,CDV)，但是由于药物毒副作用和HCMV耐药株的出现， 急需探索新的治疗途径控制HCMV感染。HCMV的基因组表达具有一定时序性，可分为即刻早期(IE)、早期(E) 和晚期(L)三种时相蛋白。UL86编码HCMV的一种重要晚期蛋白——主要 衣壳蛋白(major capsidprotein, MCP)。 MCP是构成HCMV病毒颗粒的重要结 构蛋白，同时也是感染过程中HCMV刺激宿主产生特异性抗体的主要抗原之 一，对研究HCMV与宿主免疫系统的相互作用具有重要意义。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是序列特异的双链RNA (dsRNA) 使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性基因表达沉默的过程。它是机体 的一种小分子RNA介导的序列特异性免疫保护机制，可以对抗侵入性遗传因 子的作用。自1998年首次被报道以来，RNAi技术以其特有的优越性而被迅速 应用于抗病毒及其相关方面的研究中，目前已在HIV、 HBV、 HCV、流感病毒 等的抗病毒研究中取得重要进展。RNAi的作用主要由长约21~23nt的dsRNA介导，其中一类称为小干扰 RNA (small interfering RNA，siRNA)，它和目的mRNA序列具有严格的配对， 能引起相应mRNA降解。由于RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特异性降解，因此要产生有效RNAi的关键是选择合适的siRNA作用耙点。目前RNAi 靶点的选择原则可以概括为以下几点①选择GC含量在50%左右的mRNA 区域；②避免选择启动子起始部位下游50~100nt以内或终止子上游50~100nt 内的区域；③避免超过三个G或三个C的重叠，因为多聚G或多聚C能形成 类聚物而干扰RNAi的沉默机制；④选择以两个AA开始的序列，这将使合成 siRNA更加容易；⑤保证靶序列与其他基因没有同源性。目前，制备siRNA的方法主要有5种①化学合成法直接通过化学方法 合成两条互补的21 23nt的RNA单链，然后退火形成双链siRNA，缺点是价 格昂贵；②体外转录法以OligoDNA为模板，体外转录合成siRNA，此法效 率高，但不适用于大量研究；③长片段dsRNA经RNase III降解法将 200 1000bp的耙mRNA用体外转录法制备后，再用RNase III进行体外消化， 得到不同siRNA的混合物，该方法不适用于特定siRNA的研究，也有可能引 起非特异的基因沉默； siRNA表达载体法通过将含RNA聚合酶III启动子 的质粒或病毒载体转染到宿主细胞内，转录出短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)， shRNA在胞内被Dicer酶剪切为siRNA而发挥作用，此方法具有可 大量扩增和长时间研究的优点；⑤PCR制备的siRNA表达框法通过PCR方 法得到一个包含RNA聚合酶m启动子、编码shRNA的DNA模板和RNA聚 合酶III终止位点的表达框架，然后导入细胞内转录成siRNA，其优点是简单快 捷，但存在基因整合的潜在危险。 发明内容本发明的目的是提供针对HCMV UL86基因的有效siRNA的cDNA序列， 其核苷酸序列是5，-GCACGTCAGTTATCATCAACA-3，。本发明的另一个目的是提供该cDNA序列在制备治疗人巨细胞病毒感染 药物重的应用。本发明根据siRNA设计原则，构建针对HCMV UL86基因的siRNA真核 表达载体，转化大肠杆菌后提取质粒，转染AD293细胞，可有效抑制UL86 基因mRNA和蛋白表达水平，因此可应用于HCMV治疗药物的制备。本发明的有益之处是提供的siRNA序列针对HCMV的主要衣壳蛋白编 码基因UL86，目前国内外尚无用siRNA表达载体法筛选HCMVUL86基因有 效siRNA序列的报道。以此序列为基础的真核表达载体具有在细胞中持续、有 效抑制UL86基因mRNA和蛋白表达的优点，故可作为HCMV治疗药物开发 的一个新靶点。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步的说明。实施例一 siRNA真核表达载体体外抑制UL86-EGFP融合蛋白的表达1. siRNA的设计根据siRNA设计原则，从UL86 mRNA起始密码子AUG 下游lOOnt处搜索AA序列，其3'端相邻21nt序列作为候选靶点，从中选择 GC含量在40~55°/。的siRNA序列，并通过GenBank数据库的Blast功能与人 类基因组序列进行比对，确保无同源性。最终选择的siRNA其cDNA序列为 5，-GCACGTCAGTTATCATCAACA-3，， GC含量为42.9%，对应UL86 mRNA 中3161-3181核苷酸位点。2. 表达siRNA所需shDNA的合成与制备表达siRNA所需shDNA的正 义 链 序 列 为 0￡TTTTTA-3，，反 义 链 序 列 为TGACGTGCG-3，，委托生物公司合成后，将正、反义链退火形成双链。3. siRNA真核表达载体的构建具有U6启动子的真核表达质粒pSilencer 2.0-U6 (美国Ambion公司)用BamH I和Hind III双酶切，与退火后的shDNA 双链连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a， 37"C培养过夜，挑取克隆抽提质 粒送上海英骏公司进行DNA测序鉴定，选取测序结果正确的质粒扩增、保存。4. siRNA表达质粒体外抑制UL86-EGFP融合蛋白表达的实验(1) 报告质粒pUL86-EGFP:为表达绿色荧光蛋白(EGFP)和UL86融合 蛋白的质粒，由UL86基因cDNA插入pEGFP-Nl(美国Clontech公司)的Hind III禾口 EcoRI位点构建而成，由于EGFP位于UL86的下游，且共用一个启动子， 故EGFP的表达情况可间接反映UL86的表达。(2) siRNA表达质粒与报告质粒共转染AD293细胞人胚肾细胞AD293接 种12孔细胞培养板后，待细胞达到80%~90%融合率，用Invitrogen公司 Lipofectamine 2000试剂将siRNA表达质粒与报告质粒pUL86-EGFP共转染细 胞，操作方法参照试剂说明书，同时设转染空质粒pSilencer 2.0-U6的阴性对 照组和不转染质粒的空白对照组，5小时后换培养液(含10%新生牛血清的 DMEM)继续培养。(3) 荧光定量RT-PCR检测AD293细胞中UL86mRNA的表达质粒转染后48h，收集AD293细胞，Trizol法抽提细胞总RNA，采用TAKARA公司的 SYBR PrimeScript RT-RCP Kit检测病毒UL86的mRNA，实验方法参照试剂盒 说明书。UL86基因PCR引物序列为上游弓I物序列5 ，-GACGCTGGCCGCCATGTTAT-3 ，，下游引物序列5'-GCATTGCGCTCGGACATGCT-3 ，。内参照采用GAPDH， PCR弓I物序列为上游引物序列5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ，，下游引物序列5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，。结果显示，与阴性对照组相比，siRNA表达质粒对UL86mRNA表达的抑 制率为56.6%。(4)流式细胞仪检测AD293细胞中UL86蛋白表达情况质粒转染后72h， 收集每孔内细胞，用PBS缓冲液洗涤2次后重悬于PBS中。用流式细胞仪在 488nm激发波长下检测每孔细胞平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)及荧光阳性细胞比率a，计算每孔细胞的总荧光强度(total fluorescence intensity, TFI) = MFIx a 。结果显示，与阴性对照组相比，siRNA表达质粒对 UL86蛋白表达的抑制率为74.2%。本发明系结合最佳实施例进行描述，在阅读了本发明的上述内容后，本领 域技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利 要求书所限定的范围内。本发明涉及的序列 <210> 1 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根据HCMV UL86基因设计的siRNA的cDNA序列 <400> 1GCACGTCAGT TATCATCAAC A 21<210>2 <211>57 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>制备UL86基因siRNA所需shDNA正义链的序列 <400> 2<210>3 <211>57 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>制备UL86基因siRNA所需shDNA反义链的序列 <400> 357<210>4 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220><223> UL86基因PCR上游引物序列 <400> 4GACGCTGGCC GCCATGTTAT 20<210> 5 <211>20<212>DNA <213>人工序列 <220><223> UL86基因PCR下游引物序列 <400> 5GCATTGCGCT CGGACATGCT 20<210>6 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列 <220><223> GAPDH基因PCR上游引物序列 <400> 6GAAGGTGAAG GTCGGAGTC 19<210> 7 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220><223> GAPDH基因PCR下游引物序列 <400> 7GAAGATGGTG ATGGGATTTC 20
权利要求
1.一种针对人巨细胞病毒UL86基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是5’-GCACGTCAGTTATCATCAACA-3’。
2. 权利要求1所述的cDNA序列在制备治疗人巨细胞病毒感染的药物中 的应用。
全文摘要
本发明提供一种针对人巨细胞病毒UL86基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是5’-GCACGTCAGTTATCATCAACA-3’。本发明根据siRNA设计原则，选择的siRNA其cDNA序列的GC含量为42.9％，对应UL86 mRNA中3161-3181核苷酸位点，构建针对HCMV UL86基因的siRNA真核表达载体，转化大肠杆菌后提取质粒，转染AD293细胞，可有效抑制UL86基因mRNA和蛋白表达水平，可在制备治疗人巨细胞病毒感染的药物中的应用。
文档编号A61P31/00GK101333525SQ200810063308
公开日2008年12月31日 申请日期2008年8月1日 优先权日2008年8月1日
发明者尚世强, 段群军, 胡妙凤, 赵正言, 然 陶 申请人:浙江大学