专利名称：猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于猪细小病毒疫苗技术领域，具体涉及ー种猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
猪细小病毒病作为ー种重要的母猪繁殖障碍疾病，对母猪和种猪的危害都很大， 疫苗免疫预防是控制该病的主要手段。现在国内规模化猪场的存栏母猪及种猪场的种猪和后备种猪都需要进行该病的免疫预防接种。灭活疫苗作为预防PPV常用疫苗，具有安全、长效等很多优点，但存在常规白油佐剂疫苗免疫机体后不能产生较好的细胞免疫应答。常规铝佐剂具有注射部位偶有红疹、皮下结节、接触性过敏等症状和増加易感个体的敏感性等缺点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是制备ー种新型佐剂，提供一种猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法。本发明的技术方案是猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗，该疫苗由灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合制成。所述的猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下
(1)将猪细小病毒增值、纯化、灭活；
(2)制备纳米铝佐剂，将氯化铝溶于蒸馏水中，氯化铝与蒸馏水的质量比为1:20-30， 制成氯化铝溶液，将质量浓度分数为25-28%的氨水滴入氯化铝溶液中，调节pH为9. 0，搅拌10-15分钟，得到白色沉淀物，为氢氧化铝胶，然后采用超速离心法收集氢氧化铝胶沉淀，再用水洗，后转移至锥形瓶中，加入蒸馏水制成悬浮液，蒸馏水的加入量为氯化铝质量的10-15倍，在75-85°C下用磁力搅拌器不断搅拌，用I mol /L HCl调pH至3. 0-4. 0，反应持续8-10 h后得到透明的氢氧化铝胶，最后，氢氧化铝胶用双蒸水透析纯化24-28小时，将 PH调至6. 0，制成纳米铝胶佐剂；
(3)将灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合，振荡均匀，制成猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗。所述步骤(2)中的氯化铝为六水结晶氯化铝或无水氯化铝。本发明的有益效果是本发明在乳鼠和猪体上对疫苗进行了安全性评价，结果发现，免疫之后无ー只乳鼠死亡，无ー头仔猪发生致敏反应，同样也未观察到明显的全身和局部反应，充分证明本发明灭活疫苗是安全、可靠的。本发明猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗组在免疫第4周时⑶47⑶8+的比值显著高于其他疫苗组，其比值由2. 11提高到2. 97,说明该疫苗加强了小鼠的细胞免疫状态。本发明猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗能诱导IFN-Y的分泌表达，该疫苗能显著增强Thl型细胞产生免疫应答反应，诱导其分泌IFN-Y，从而增强细胞免疫水平，能产生较强的细胞免疫应答。
图I 为 PPV 灭活效果 PCR检测结果，M:· DNA marker DL2000 ；1.灭活 16 h ；2.灭活 20 h ；3.灭活 24 h ；4.灭活 36 h ；5.灭活 48h ；6.灭活 72 h ；
图2为血清抗体水平的检测结果；
图3为免疫后小鼠外周血CD3+细胞所占百分比；
图4为免疫后小鼠外周血⑶3+⑶4+细胞所占百分比；
图5为免疫后小鼠外周血CD3+CD8+细胞所占百分比；
图6为免疫后小鼠外周血⑶4+/⑶8+的动态变化；
图7为IL-4的标准曲线；
图8为接种疫苗后小鼠血清中IL-4水平；
图9为IFN-Y的标准曲线；
图10为免疫后小鼠血清中IFN-Y水平；
图11为免疫后血清中HI抗体动态变化(log2)；
图12为免疫后血清中ELISA抗体动态变化；
图13为灭活苗免疫后猪外周血CD3+细胞所占百分比；
图14为灭活苗免疫后猪外周血CD3+CD4+细胞所占百分比；
图15为灭活苗免疫后猪外周血CD3+CD8+细胞所占百分比；
图16为纳米铝胶佐剂的XRD表征图。
具体实施例方式猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗，该疫苗由灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合制成。所述的猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下
(1)将猪细小病毒增值、纯化、灭活；
(2)制备纳米铝佐剂，将氯化铝溶于蒸馏水中，氯化铝与蒸馏水的质量比为1:20-30，制成氯化铝溶液，将质量浓度分数为25-28%的氨水滴入氯化铝溶液中，调节pH为9. 0，搅拌 10-15分钟，得到白色沉淀物，为氢氧化铝胶，然后采用超速离心法收集氢氧化铝胶沉淀， 再用水洗，后转移至锥形瓶中，加入蒸馏水制成悬浮液，蒸馏水的加入量为氯化铝质量的 10-15倍，在75-85°C下用磁力搅拌器不断搅拌，用I mol /L HCl调pH至3. 0-4. 0，反应持续8-10 h后得到透明的氢氧化铝胶，最后，氢氧化铝胶用双蒸水透析纯化24小时，将pH调至6.0，制成纳米铝胶佐剂；
(3)将灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合，振荡均匀，制成猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗。不同佐剂猪细小病毒灭活疫苗的制备 I材料与方法
PK-15细胞购自中国兽药监察所，冻存；猪细小病毒标准株。试验动物2 4日龄清洁级昆明乳鼠购自郑州大学医学院实验动物中心；35日龄PPV阴性断奶仔猪，由郑州市某养猪场提供。主要仪器超净工作台，购自苏净集团安泰公司；小型台式离心机，购自德国Sigma公司；MiLLipak40型超纯水制备系统，购自德国MiLLipore公司；AB204_N电子分析天平购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，购自上海亚荣生化仪器厂；LEICA DMIL倒置显微镜，购自德国莱卡公司；C02培养箱，购自美国Thermo Forma公司。主要试剂胎牛血清购自Hyclone公司；RPMI_1640培养液购自GIBC0BR公司；甲醛溶液(分析纯)购自烟台市双双化工有限公司；胰蛋白酶购自Solarbio公司； MONTANIDE ISA206VG成品白油佐剂为法国赛比克公司产品。I. 2 方法
I.2. I PK-15细胞的培养
在无菌条件下，将冻存的PK-15细胞从液氮中取出，1000 rpm离心10 min去除冻存液， 再转入细胞培养瓶中，视培养瓶大小补加一定体积含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液，置于5%C02，37°C恒温培养箱中培养。待细胞长满单层吋，用0. 25%的胰蛋白酶液消化 3 5 min，经倒置显微镜下观察，待大部分贴壁的扁平细胞变圆并有少许脱落时即停止作用，加入培养液吹打数次至分散成单个细胞时，吸取适量细胞悬液转入另ー细胞培养瓶中， 继续培养3 5代，待PK-15细胞适应培养环境后即可使用。I. 2. 2病毒的增殖
常规培养PK-15细胞，用RPMI-1640培养液加10%无牛病毒性腹泻病毒抗体的胎牛血清作为PK-15细胞的培养液(pH 7. 2 7. 4);在细胞传代时同步接种猪细小病毒猪细小病毒第19代病毒液，按1000 TCID50接毒_，置于5%C02, 37°C恒温培养箱中培养，培养18 24 h后倒掉细胞培养上清液，换成不含胎牛血清的RPMI-1640培养液，继续培养48 72 h，待贴壁细胞出现80%的CPE时收获病毒，将收获的病毒反复冻融三次，8000 rpm离心 30min去除细胞碎片，冻于-80で保存备用。1.2.3病毒的纯化
采用差速离心法纯化病毒，将增殖的病毒液于4°C 8000 rpm离心30 min，取上清液于 40C 30 000 rpm超速离心3 h，弃上清液，用适量PBS缓冲液悬浮沉淀后，经两次差速离心， 用适量PBS液溶解沉淀，将溶解液置于4°C 8000 rpm离心30 min，取上清，即为纯化的病毒液，分装，-20°C保存备用。1.2.4病毒滴度TCID50的測定
将消化吹散的PK-15细胞悬液加入96孔细胞培养板，于5%C02，37°C恒温培养箱中培养至贴壁，弃上清，用2%的RPMI-1640培养液将猪细小病毒病毒液作连续倍比稀释KT1 IO-8,每个稀释度各作8个重复，分别接种96孔细胞培养板，每孔100ML，设一行正常细胞生长对照孔。逐日观察细胞病变并统计结果，按照Reed-Muench法计算TCID5(I。I. 2. 5病毒血凝效价的测定
在96孔“V”型微量反应板上，每孔加入25 ML PBS液于96孔微量反应板的第I孔到第12孔，在第I孔中加入25 ML纯化后的病毒液，按1:2、1:4、1:8…等倍比稀释至第11孔， 弃去25 ML，第12孔为阴性对照孔。每孔加入0.6%的豚鼠红细胞悬液25 ML，在微量振荡器上混匀，室温静置I 2 h观察結果。I. 2. 6病毒的灭活及其灭活检验 1.2.6. I灭活时间的确定
取10 ii L甲醛溶液加到5 mL病毒液中，使其终浓度为0. 2%，混匀，放入37°C温箱中进行灭活，其间每隔2 h摇动病毒悬液一次。分别于16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、72 h取出病毒液进行检测，同时设不加甲醛溶液的病毒液对照组。1.2.6.2灭活病毒液的检测
I.2. 6. 2. I灭活效果检测
将不同灭活时间段取出的病毒液和不加甲醛的对照组接种到长成单层的PK-15细胞上，连续盲传3代，期间观察细胞病变；盲传3代后反复冻融3次收集病毒液，检测病毒液血凝活性以及通过PCR扩增，设计一对扩增PPV NSl部分基因的特异性引物，预计扩增片段长度为312bp，采用蛋白酶K法提取病毒DNA。以PPV株DNA为模板，进行PCR扩增反应，通过对PCR扩增条件优化，确定如下扩增方案Premix Ex Taq DNA聚合酶25 μ L，模板DNA 4 yL，上、下游引物各I yL，补超纯水至50 y L。混匀后于PCR仪上进行扩增，同时设无模板的阴性对照。反应条件为95°C预变性5 min ；94°C I min,55°C 50 s,72°C 50 s，共30个循环；最后72°C延伸10 min。反应结束后，取5 μ PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶(含O. 5 Pg/mL EB)进行电泳检测PCR结果。来检测灭活效果。I. 2. 6. 2. 2灭活病毒液无菌检验
将灭活病毒液接种于普通肉汤和普通营养琼脂中，37 °C培养24 48 h，观察有无细菌生长。I. 2. 7不同佐剂猪细小病毒灭活疫苗的制备
1.2.7. I猪细小病毒油乳佐剂灭活疫苗的制备将法国赛比克公司的成品白油佐剂 MONTANIDE ISA206VG与经O. 2%甲醛灭活20 h的病毒液按I: I的比例，用力震摇使之充分混匀并形成水包油包水的油乳剂型，即为PPV油乳剂疫苗。I. 2. 7. 2猪细小病毒铝胶佐剂灭活疫苗的制备
I.2. 7. 2. I氢氧化铝胶的制备
称取12. 5 g无水三氯化铝，用50 mL去离子水配成25%溶液，加热溶化，使用时再稀释成8%，加温至56 60°C ;将氢氧化钠配成4%溶液，加温至56 60°C ;化学合成时，将三氯化铝维持温度60°C边搅边缓慢加入氢氧化钠溶液，测混合液PH值达到5. 6 6. O时，即为终点，继续搅拌10 min，分装，高压灭菌，即为试验用氢氧化铝胶佐剂，透明略带乳光液体。I. 2. 7. 2. 2铝胶佐剂灭活疫苗制备
将灭活病毒液与氢氧化铝胶按4:1的比例配制，充分摇匀、静置沉淀，重复三次，即制成PPV铝胶佐剂疫苗。I. 2. 7. 3猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备
将灭活的病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合，振荡均勻，即制成PPV纳米铝胶佐剂疫苗。I. 2. 8猪细小病毒油乳佐剂灭活疫苗的检验
按兽用生物制品质量标准对PPV油乳剂疫苗进行物理性状的检验。I. 2. 8. I外观检测肉眼观察疫苗的外观。I. 2. 8. 2冷水表面试验取一清洁吸管，吸取少量疫苗缓慢滴于冷水中，观察油滴是否扩散。I. 2. 8. 3粘稠度检验取口径为1.2 mm的I mL吸管于室温下吸满I mL油乳剂苗，以吸管呈垂直状态时自然流出O. 4 mL疫苗所需的时间作为判定标准。
I. 2. 8. 4稳定性检验将油乳剂疫苗加满5 mL小离心管,3000 rpm离心15 min, 以不分层为稳定性良好；37°C放置21d，观察是否有破乳、分层现象。I. 2. 9不同佐剂猪细小病毒灭活疫苗的无菌检验和安全性检验
1.2. 9. I无菌检验
将3种灭活疫苗接种于普通肉汤，普通营养琼脂，血琼脂培养基，37°C培养观察3天，无菌生长为合格。I. 2. 9. 2安全性检验:
(I)将3种灭活疫苗各皮下接种5只2 4日龄昆明乳鼠，每只0.1 mL，观察7d，看是否出现由疫苗接种引起的任何局部或全身不良反应，同时设不接种对照组。(2)将3种灭活疫苗各肌肉注射PPV HI阴性健康仔猪2头，每头接种10 mL,观察 21d，看是否出现由疫苗接种引起的任何局部或全身不良反应，同时设不接种对照组。2 结果
2.I病毒滴度TCID5tl的測定结果
常规培养PK-15细胞，接毒后通过倒置显微镜观察，待细胞出现脱落、拉网等明显的CPE后，统计并按Reed-Muench方法计算毒株的TCID5tl,结果得出纯化后的猪细小病毒 TCID50 为 I(T5 6A). I mL。2. 2病毒血凝效价的测定结果
经检测，所纯化的PPV猪细小病毒血凝效价为2'2. 3病毒灭活效果检验
2.3. I病变观察
用0.2%甲醛灭活病毒，分别将经甲醛灭活16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、72 h的病毒液取出，在PK-15细胞上盲传3代的同时观察细胞病变，均没有细胞病变产生。2. 3. 2灭活病毒液的血凝性检验
分别将灭活16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、72 h的病毒液取出，在PK-15细胞上盲传3 代后收集病毒液，反复冻融3次，2000 rpm离心10 min，取上清进行血凝效价的測定。灭活
16h病毒液的血凝效价为24,与灭活前比较有所下降,而灭活20 h、24 h、36 h、48 h、72 h 的病毒液血凝效价均为2°，測定结果见表I。表I PPV灭活病毒液血凝性测定结果
灭活时间/h162024364872HA 效价 /25 u L242°2°2°2°2°
2.3.3灭活病毒液PCR检测
分别将16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、72 h灭活的病毒液取出，盲传3代后收集病毒液， 反复冻融3次，提取DNA进行PCR检测(如I)。由图可知，在37°C、0. 2%甲醛作用20 h时无特异性电泳条带出现，说明PPV被完全灭活。2. 4灭活病毒液的无菌检测
取灭活后的病毒液分别接种于琼脂平板与营养肉汤中，37°C培养24 28 h后观察无细菌生长，符合生物制品规程要求。2. 5油乳剂灭活疫苗的鉴定 2. 5. I外观检测
疫苗下层为淡紅色，摇匀后外观呈乳白色均质乳剂，符合质量标准。
2. 5. 2冷水表面试验
制备的疫苗剂型为水包油包水型。将制备的油乳剂灭活苗滴于冷水表面，结果为先不扩散，再缓慢向四周散去。2.5.3黏度测定
用I mL吸管(内径约为I. 2 mm)在25°C室温下吸满I mL油乳剂灭活疫苗，垂直放出
0.4 mL需3秒。在2 6秒范围内，说明疫苗黏度合格，适合于注射用。2. 5. 4稳定性测定
将油乳剂灭活疫苗经3000 rpm离心15 min后无分层和破乳现象，37°C放置21d后也无破乳、分层现象，说明该疫苗具有一定的稳定性。2. 6不同佐剂灭活疫苗的无菌检验
3种疫苗接种于普通琼脂、营养肉汤培养基和血琼脂培养基37°C培养24 48 h后，均无细菌生长。2.7不同佐剂灭活疫苗的安全性检验
3种不同佐剂灭活疫苗各接种5只2 4日龄健康乳鼠，每只O. I mL，观察7d，乳鼠均无任何不良反应，精神状态良好、食欲正常，未观察到明显的全身和局部反应，与阴性对照无显著差异，证明制备的3种灭活疫苗对乳鼠是安全的。3种不同佐剂的灭活疫苗各免疫2头健康仔猪，逐日观察，均无体温升高现象，未见注射部位有肿块出现，精神状态良好，食欲正常，接种部位无肿胀发热等不良反应。同等条件下的阴性对照组也无不良反应，说明接种后对猪是安全、可靠的。3结论与讨论
3.I猪细小病毒的增殖情况
良好、稳定、特异性高的病毒抗原对试验的后续工作是十分重要的，本试验采用的病毒抗原是本实验室分离鉴定并保存的猪细小病毒。经过试验证明，该株病毒具有良好的稳定性、特异性和重复性，可应于抗体的检测。而病毒滴度高，细胞培养物的胎牛血清含量低，佐剂与机体相溶性好，是灭活疫苗研究要重点着手解决的问题。本研究在降低细胞培养物中胎牛血清含量方面取得了理想的试验效果，在细胞接毒培养24 h后换维持液，且维持液中不添加胎牛血清，大大降低了病毒培养物中胎牛血清的含量，减少了灭活疫苗的副反应。猪细小病毒病毒滴度和血凝效价在20代时已基本稳定，所以本试验选用第20代病毒液制备疫苗，经测定，纯化后病毒液的TCID5tl为10_5_6/0. lmL，血凝效价为21(1，均符合《兽用生物制品质量标准》中对病毒的要求，为猪细小病毒灭活疫苗的制备奠定了基础。3. 2灭活剂的选择
本试验研究的关键在于降低猪用灭活疫苗的副作用和提高疫苗的安全性。灭活剂中和或水解充分是保证猪用灭活疫苗安全高效的主要前提之一。不同的微生物、活性物质所采用的灭活方法、灭活剂也不尽相同，常用的灭活剂有甲醛、苯酚、β-丙烯内酯、N-乙酰乙烯亚胺(AEI)和二乙烯亚胺(BEI )。一般化学灭活剂的作用随着灭活剂浓度的增加、灭火温度的升高而增强。所以我们在选用灭活剂时，应在保证生物制品安全和效力的前提下，采用低灭活剂量、低作用温度和短时间处理为最佳。甲醛是最为古老和常用的灭活剂，其灭活的原理是氧化还原作用， 该灭活剂虽容易破坏病毒表面的抗原结构，但其副作用较小，只要保证在一定的使用浓度范围内，其对动物机体的影响较小。甲醛与病毒作用后，如果直接进行细胞感染的检测，残留的甲醛会破坏正常的细胞，影响最終的结果判定，所以本试验在进行灭活效果检测时采用非同步解毒的方法以消除甲醛对细胞的毒副作用。本试验病毒液经甲醛灭活后，灭活病毒液接种PK-15细胞培养盲传3代，细胞均未出现CPE，通过灭活效果的检测，最终确定为
0.2%的甲醛灭活20 h即能将猪细小病毒完全灭活。3. 3佐剂的选择
佐剂在增强兽用疫苗的效カ方面起着极为重要作用。佐剂选择的好坏与疫苗的副反应和安全性有直接的关系。国内张超范等都进行了 PPV灭活苗的佐剂对比试验，结果表明国外进ロ油佐剂要优于国内矿物质白油佐剂和铝胶佐剂。舒银辉等研究了不同佐剂PPV灭活疫苗的效果比较试验，得出法国佐剂对仔猪副反应小，产生抗体效价高的结论。结合相关文献报道，我们在试验中制备灭活苗时，选用法国ISA206油佐剂，进ー步验证了其效果，其纯度高，粘度低，非常适合动物疫苗的免疫吸收。目前铝佐剂仍是应用最多、最重要的疫苗佐剂，并且可联合其他佐剂以增强免疫应答。韩孝成等研制了猪细小病毒氢氧化铝疫苗，该疫苗具有较好的安全性，其具有免疫原性好、耐热、免疫程序简单、免疫剂量小等特点。本试验采用三氯化铝与氢氧化钠合成法制备的氢氧化铝铝胶，透明无沉淀，注射部位无硬结反应。如果将铝佐剂纳米化，其比表面积将会大大增加，吸附カ增强，在增强佐剂活性的同时还可以提高抗原的靶向投递，大大降低副作用。目前对于纳米铝佐剂已有相关方面的研究，如第三军医大学设计了油相包围水相(W/0)的微乳液体系和原位合成的方法制备纳米铝佐剂，目前已建立稳定的技术平台，制备的佐剂平均粒径稳定在70 nm左右，疫苗的吸附度约为常规铝佐剂的10倍，能提高疫苗效能，节约成本，并快速激活免疫应答。本试验所用纳米铝胶采用水热法在最优条件下制备，其平均粒径在12. 28 nm左右，纯化以后直接用作佐剂。3. 4疫苗的理化、无菌及安全性检验
本试验制备的PPV油乳剂灭活苗从自然垂直的I mL吸管中流出0. 4 mL时为3秒，表明该疫苗为稀薄乳剤；而且3000 rpm离心15 min不分层，说明制备的疫苗的稳定性较好， 对制备的3种疫苗进行无菌检验结果表明，制备的3种疫苗均无菌生长。理想的灭活疫苗不但能使免疫动物获得较好的免疫保护，更应具备良好的安全性。因此，对疫苗进行安全评价是研制疫苗过程中的必备环节。本研究在乳鼠和猪体上对疫苗进行了安全性评价，结果发现，免疫之后无ー只乳鼠死亡，无ー头仔猪发生致敏反应， 同样也未观察到明显的全身和局部反应，充分证明该3种灭活疫苗是安全、可靠的。不同佐剂猪细小病毒灭活疫苗小鼠免疫效果研究 I材料与方法
市售猪细小病毒油乳剂灭活疫苗购自中牧实业股份有限公司(批号1009006-2);市售猪细小病毒蜂胶灭活疫苗购自山东绿都安特动物药业有限公司(批号100803)。试验动物 20g左右清洁级昆明小鼠，60只，购自郑州大学医学院实验动物中心。主要仪器超净工作台，购自苏净集团安泰公司；小型台式离心机，购自德国Sigma公司；MiLLipak40型超纯水制备系统，购自德国MiLLipore公司；AB204_N电子分析天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Thermo Multiskan MK3型酶标仪，购自上海雷勃分析仪器有限公司。主要试剂猪细小病毒ELISA诊断试剂盒购自BioXL公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠 IgG抗体购于北京鼎国生物技术发展公司；小鼠细胞因子IL-4和IFN-Y ELISA检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯。I. 2 方法
1.2. I动物分组免疫
60只小鼠随机分为6组(见表2)，每组10只，雌雄各半。其中I为PPV油乳剂疫苗组， 每只O. 2 mL ; II为PPV铝胶佐剂疫苗组，每只O. 2 mL JII为PPV纳米铝胶佐剂疫苗组，每只
0.2 mL ;IV为市售油佐剂疫苗组，每只O. 2 mL ; V为市售蜂胶佐剂疫苗组，每只0.2 mL ；VI 为生理盐水对照组，每只O. 2 mL，免疫途径均采用皮下多点注射免疫，两周后用同样的剂量进行第二次免疫，免疫方案见表3-1
表2试验小鼠分组及免疫情况
组别免疫种类剂量IPPV油乳剂疫苗O. 2mL/ 只IIPPV铝胶佐剂疫苗O. 2mL/ 只IIIPPV纳米铝胶佐剂疫苗O. 2mL/ 只IV市售PPV油乳剂疫苗O. 2mL/ 只V市售PPV蜂胶疫苗O. 2mL/ 只VI生理盐水O. 2mL/ 只
I.2. 2抗体水平的测定
分别于免疫后0、1、2、3、4、5、6周，每组随机抽取3只小鼠断尾采血，分离血清，56 °C水浴30 min灭活补体。按照猪细小病毒ELISA诊断试剂盒(BioXL公司)使用说明书进行操作(试剂盒中酶标羊抗猪IgG换为辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG)，应用间接ELISA方法检测小鼠血清中抗PPV的抗体，通过测定标记酶的OD63tl值检测抗体水平。I. 2. 3细胞免疫水平的测定 1.2.3. I T淋巴细胞亚群测定
分别于免疫后0、1、2、3、4周，每组随机抽取3只小鼠经眼球采血lmL，柠檬酸钠抗凝， 用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用PBS溶液将细胞数调至5. OX 106/mL，流式细胞仪检测 T淋巴细胞亚群。I. 2. 3. 2细胞因子IL-4和IFN- Y的测定
分别于免疫后0、1、2、3、4周，随机抽取3只小鼠断尾采血，分离血清，按照IL-4和 IFN-y ELISA诊断试剂盒使用说明书进行操作，检测小鼠血清中IL-4和IFN-Y的含量。 以测定标准品的OD值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。查出浓度再乘以样品稀释倍数即得出IL-4和IFN-Y的具体含量。I. 2. 4数据处理
用SPSS11. 5及Excel统计软件将所得数据进行统计学处理，计算其平均值，数据以 Means 土 SD表示,并用SPSS软件进行Duncan’ s多重分析。2 结果
2.1小鼠免疫后抗体水平测定
分别对每周收集的血清进行ELISA抗体水平检测，对各组所测数据进行统计分析，结果见表3，得到抗体消长曲线如图2。经统计分析表明，免疫前各组之间抗体水平无显著差异(P > 0. 05)，免疫后各疫苗组抗体水平都明显升高，首次免疫后第3周，PPV油乳剂疫苗抗体效价达到最高水平，且与生理盐水对照和其他疫苗组差异显著(P〈0. 05)，随后呈下降趋势；ニ免后第3周，市售油乳剂疫苗抗体效价达到最高水平，且与其他疫苗组差异显著 (P〈0. 05)，但仍低于PPV油乳剂疫苗产生抗体的最高水平；说明PPV油乳剂疫苗组抗体效价上升较快，且抗体水平较高。表3血清抗体水平的检测结果(Means ±5 )
权利要求
1.猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗，其特征在于该疫苗由灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以质量比为1:2的比例混合制成。
2.根据权利要求I所述的猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，它的步骤如下(1)将猪细小病毒增值、纯化、灭活；(2)制备纳米铝佐剂，将氯化铝溶于蒸馏水中，氯化铝与蒸馏水的质量比为1:20-30，制成氯化铝溶液，将质量浓度分数为25-28%的氨水滴入氯化铝溶液中，调节pH为9. 0，搅拌 10-15分钟，得到白色沉淀物，为氢氧化铝胶，然后采用超速离心法收集氢氧化铝胶沉淀，再用水洗，加入蒸馏水制成悬浮液，蒸馏水的加入量为氯化铝质量的10-15倍，在75-85°C下用磁力搅拌器不断搅拌，用I mol /L HCl调pH至3. 0-4.0，反应持续8-10 h后得到透明的氢氧化铝胶，最后，氢氧化铝胶用双蒸水透析纯化24-28小时，将pH调至6. 0，制成纳米铝胶佐剂；(3)将灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以质量比为1:2的比例混合，振荡均匀， 制成猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗。
3.根据权利要求2所述的猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的氯化铝为六水结晶氯化铝或无水氯化铝。
全文摘要
本发明公开了一种猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗，该疫苗由灭活的猪细小病毒病毒液与纳米铝佐剂以1:2的比例混合制成。本发明在乳鼠和猪体上对疫苗进行了安全性评价，结果发现，免疫之后无一只乳鼠死亡，无一头仔猪发生致敏反应，同样也未观察到明显的全身和局部反应，充分证明本发明灭活疫苗是安全、可靠的。本发明猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗组在免疫第4周时CD4+/CD8+的比值显著高于其他疫苗组，其比值由2.11提高到2.97，说明该疫苗加强了小鼠的细胞免疫状态。本发明猪细小病毒纳米铝胶佐剂疫苗能诱导IFN-γ的分泌表达，该疫苗能显著增强Th1型细胞产生免疫应答反应，诱导其分泌IFN-γ，从而增强细胞免疫水平，能产生较强的细胞免疫应答。
文档编号A61K39/39GK102580079SQ20121008802
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者宋美荣, 崔保安, 王亚宾, 王瑞宁, 耿静微, 胡慧, 魏战勇 申请人:河南农业大学