专利名称：纳米粒油佐剂疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米粒油佐剂疫苗的制备方法。
背景技术：
新城疫是由新城疫病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，现在几乎世界上绝大部分国家都有本病流行的报道，严重危害和威胁世界养禽业，被世界动物卫生组织(OIE) 列为A类传染病。目前大多数国家都采用预防接种作为控制新城疫的主要措施。灭活疫苗的制造工艺简单、免疫原性好、易于制造多价疫苗。使用方法通常是经注射途径，进入机体后可直接引起免疫应答，但不能生长繁殖，因此比较安全、稳定。但灭活疫苗所特供的免疫力较为短暂，为完成免疫操作，需进行多次接种。壳聚糖(chitosan，CS)是甲壳素经脱乙酰化后得到的一种带正电荷的亲水性多糖，化学名为β (1，4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，是一种来源丰富的天然的聚阳离子氨基线性多糖。它具有良好的生物学特性，无毒、无刺激性、无抗原性、组织相容性良好，在体内可降解吸收。大量的研究已证实壳聚糖具有免疫增强和免疫调节作用。经过化学改性得到的壳聚糖衍生物，其物理化学性质得到改善，使其应用范围大大拓展。通过在壳聚糖分子的-NH2I引入亲水性强的羟丙基三甲基氯化铵基团，制备Ν-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(壳聚糖的衍生物)，改善了壳聚糖的水溶性，保持了分子的阳离子性能。因此以壳聚糖及其衍生物纳米粒为载体的给药方式的开发及应用研究已得到了医药界的密切关注。
发明内容
本发明提供一种纳米粒油佐剂疫苗的制备方法。本发明纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，按以下步骤进行一、取5mL浓度为O. 5 2mg/mL的壳聚糖溶液或5mL浓度为O. 5 2mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，向其中滴加I. 25 7. 5mL新城疫L-系病毒液，搅拌均匀，获得溶液A ;二、将溶液A在室温、无菌条件下以900 1300r/min磁力搅拌30s,然后向溶液A中滴加2. 5mL浓度为 O. 5 3mg/mL的三聚磷酸钠，搅拌均匀后匀速滴加ImL pH值7. 4的PBS缓冲液，搅拌均匀后再匀速滴加ImL的司班-80，获得溶液B ;三、将溶液B于4°C、13000r/min离心30min，吸取上清液，为溶液B1，沉淀经去离子水悬浮，为溶液B2 ;四、将94份注射用白油于160°C高温灭菌30min，然后加入6份司班-80，在160°C维持lOmin，然后冷却至室温，得溶液C1 ;取96 份溶液B1，加入4份吐温-80，混合均匀，得溶液C2 ;五、将溶液C1置于组织捣碎器内搅拌，同时滴加溶液C2,于8000 10000r/min搅拌5 20min，得溶液C ;六、将溶液C置于磁力搅拌器内搅拌，同时滴加溶液B2,于900 1300r/min搅拌5 15min，即得到纳米粒油佐剂疫苗；其中步骤五中溶液C1与溶液C2的体积比为I 3 : I ;步骤六中溶液C和溶液B2的体积比是I 2 : Iο壳聚糖和N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖都是带正电的高分子，因而能够与带负电的高分子发生静电相互作用。利用壳聚糖和N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的游离氨基与交联剂三聚磷酸钠的阴离子发生分子间或分子内交联反应，从而形成壳聚糖纳米粒。该反应条件温和，不使用任何有机溶剂；用离子交联法制备的壳聚糖纳米粒子和 N-2-轻丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒子粒径比较均勻，介于250 900nm之间，纳米粒子表面带有正电荷；对疫苗具有很高的负载能力。纳米粒的比表面积大、表面反应活性高、表面活性中心多、黏附能力强等这些优异性质为疫苗研究提供了新的思路。本发明制备载病毒纳米粒粒径小，包封率高、载药量大、制备条件温和、制备工艺简单，生产成本较低，易于规模化生产。本发明制备载病毒纳米粒油佐剂疫苗黏度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。本发明以壳聚糖及其衍生物制成的载病毒纳米疫苗同时含有裸病毒粒子和缓释微粒，在免疫前期主要是裸病毒粒子刺激免疫系统产生抗体，一段时间后缓释微粒开始释放被包裹的抗原，不断地刺激免疫系统。
图I为具体实施方式
六中负载新城疫L-系病毒的壳聚糖纳米粒的透射电镜图；图 2为具体实施方式
六中负载新城疫L-系病毒的壳聚糖纳米粒的粒径分布图；图3为具体实施方式
六获得的负载新城疫L-系病毒的壳聚糖纳米粒油佐剂疫苗的成品照片；图4为具体实施方式
六中鸡新城疫HI抗体消长曲线图；图5为具体实施方式
七中负载新城疫L-系病毒的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的透射电镜图；图6为具体实施方式
七中负载新城疫L-系病毒的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的粒径分布图；图7为具体实施方式
七获得的负载新城疫L-系病毒的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒油佐剂疫苗的成品照片。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，按以下步骤进行 一、取5mL浓度为O. 5 2mg/mL的壳聚糖溶液或5mL浓度为O. 5 2mg/mL的N-2-轻丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，向其中滴加I. 25 7. 5mL新城疫L-系病毒液，搅拌均匀，获得溶液A ;二、将溶液A在室温、无菌条件下以900 1300r/min磁力搅拌30s，然后向溶液A中滴加2. 5mL浓度为O. 5 3mg/mL的三聚磷酸钠，搅拌均匀后匀速滴加ImL pH值7. 4的PBS 缓冲液，搅拌均匀后再匀速滴加ImL的司班-80，获得溶液B ;三、将溶液B于4°C、13000r/ min离心30min，吸取上清液，为溶液B1，沉淀经去离子水悬浮，为溶液B2 ;四、将94份注射用白油于160°C高温灭菌30min，然后加入6份司班-80，在160°C维持lOmin，然后冷却至室温，得溶液C1 ;取96份溶液B1，加入4份吐温-80，混合均匀，得溶液C2 ;五、将溶液C1置于组织捣碎器内搅拌，同时滴加溶液C2，于8000 10000r/min搅拌5 20min，得溶液C ;六、 将溶液C置于磁力搅拌器内搅拌，同时滴加溶液B2,于900 1300r/min搅拌5 15min, 即得到纳米粒油佐剂疫苗；其中步骤五中溶液C1与溶液C2的体积比为I 3 : I ;步骤六中溶液C和溶液B2的体积比是I 2 I。步骤一中所述新城疫L-系病毒液在使用前需经过4%甲醛灭活。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中壳聚糖溶液的制备方法为称取壳聚糖分散于灭菌的去离子水中，在磁力搅拌下，用质量浓度为1%的乙酸溶解，用0.22 μ m滤器过滤，静置至气泡消去。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液的制备方法为称取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖分散于灭菌的去离子水中，在磁力搅拌下，用质量浓度为1%的乙酸溶解，用O. 22μπι滤器过滤，静置至气泡消去。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中每 O. ImL新城疫L-系病毒液的病毒含量> IO7EID50O其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤二中三聚磷酸钠的滴加速率为O. 5mL/min, PBS的滴加速率为O. 2mL/min，司班-80的滴加速率为 O. 2mL/min。其它与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，按以下步骤进行 一、取5mL浓度为lmg/mL的壳聚糖溶液，向其中滴加5mL新城疫L-系病毒液，搅拌均匀，获得溶液A ;二、将溶液A在室温、无菌条件下以1300r/min磁力搅拌30s，然后向溶液A中滴加2. 5mL浓度为2mg/mL的三聚磷酸钠，搅拌均匀后匀速滴加ImL pH值7. 4的PBS缓冲液， 搅拌均匀后再匀速滴加ImL的司班-80，获得溶液B，即为负载新城疫L-系病毒的壳聚糖纳米粒；三、将溶液B于4°C、13000r/min离心30min，吸取上清液，为溶液B1，沉淀经去离子水悬浮，为溶液B2 ;四、将94份注射用白油于160°C高温灭菌30min，然后加入6份司班-80， 在160°C维持lOmin，然后冷却至室温，得溶液C1 ;取96份溶液B1，加入4份吐温-80，混合均匀，得溶液C2 ;五、将溶液C1置于组织捣碎器内搅拌，同时滴加溶液C2,于9000r/min搅拌 lOmin，得溶液C ;六、将溶液C置于磁力搅拌器内搅拌，同时滴加溶液B2，于1200r/min搅拌 IOmin,即得到负载新城疫L-系病毒的壳聚糖纳米粒油佐剂疫苗；其中步骤五中溶液C1与溶液C2的体积比为2 I ;步骤六中溶液C和溶液B2的体积比是I : I。本实施方式步骤一中所述新城疫L-系病毒液在使用前需经过4%甲醛灭活。本实施方式步骤一中壳聚糖溶液的制备方法为称取壳聚糖分散于灭菌的去离子水中，在磁力搅拌下，用质量浓度为I %的乙酸溶解，用O. 22 μ m滤器过滤，静置至气泡消去。步骤一中每O. ImL新城疫L-系病毒液的病毒含量> IO7EID5tlt5步骤二中三聚磷酸钠的滴加速率为O. 5mL/min, PBS的滴加速率为O. 2mL/min，司班-80的滴加速率为O. 2mL/min。本实施方式步骤二得到的负载新城疫L-系病毒的壳聚糖纳米粒的透射电镜图如图I所示，负载新城疫L-系病毒的壳聚糖纳米粒的粒径分布图如图2所示。本实施方式获得的负载新城疫L-系病毒的壳聚糖纳米粒油佐剂疫苗的成品如图3所示。本实施方式制得的纳米粒油佐剂疫苗黏度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。将20只7日龄SPF鸡随机分为4组。第一组滴鼻O. ImL PBS,三周时肌肉注射 O. 5mLPBS ;第二组滴鼻O. ImL空白N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒，三周时肌肉注射O. 5mL空白N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒；第三组滴鼻O. ImL新城疫活疫苗 (LaSota株，购买自哈药集团生物疫苗有限公司，批号201137)，三周时肌肉注射O. 5mL新城疫灭活苗(La Sota株，购买自哈药集团生物疫苗有限公司，批号201102);第四组滴鼻
O.ImL新城疫活疫苗(La Sota株，购买自哈药集团生物疫苗有限公司，批号201137)，三周时肌肉注射O. 5mL本实施方式制备的负载新城疫L-系病毒的壳聚糖纳米粒油佐剂灭活疫苗(La Sota株，灭活前病毒含量为108 2EID5(l/0. ImL);定期进行ND抗体检测。鸡新城疫HI 抗体消长曲线如图4所示，图4中- -为第一组的鸡新城疫HI抗体消长曲线，-■-为第二组的鸡新城疫HI抗体消长曲线，-·-为第三组的鸡新城疫HI抗体消长曲线，-▲-为第四组的鸡新城疫HI抗体消长曲线，结果表明，本实施方式制备的负载新城疫L-系病毒的壳聚糖纳米粒油佐剂灭活疫苗在较长时间内具有比传统灭活疫苗更好的免疫效果。
具体实施方式
七本实施方式纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，按以下步骤进行 一、取5mL浓度为lmg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，向其中滴加5mL新城疫 L-系病毒液，搅拌均匀，获得溶液A ;二、将溶液A在室温、无菌条件下以1300r/min磁力搅拌30s，然后向溶液A中滴加2. 5mL浓度为2mg/mL的三聚磷酸钠，搅拌均匀后匀速滴加ImL pH值7. 4的PBS缓冲液，搅拌均匀后再匀速滴加ImL的司班_80，获得溶液B，即为负载新城疫L-系病毒的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒；三、将溶液B于4°C、13000r/min 离心30min，吸取上清液，为溶液B1,沉淀经去离子水悬浮，为溶液B2 ;四、将94份注射用白油于160°C高温灭菌30min，然后加入6份司班-80，在160°C维持lOmin，然后冷却至室温， 得溶液C1 ;取96份溶液B1，加入4份吐温-80，混合均匀，得溶液C2 ;五、将溶液(^置于组织捣碎器内搅拌，同时滴加溶液C2，于9000r/min搅拌lOmin，得溶液C ;六、将溶液C置于磁力搅拌器内搅拌，同时滴加溶液B2,于1200r/min搅拌lOmin，即得到负载新城疫L-系病毒的 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒油佐剂疫苗；其中步骤五中溶液C1与溶液C2的体积比为2 I ;步骤六中溶液C和溶液B2的体积比是I : I。本实施方式步骤一中所述新城疫L-系病毒液在使用前需经过4%甲醛灭活。本实施方式步骤一中N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液的制备方法为称取 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖分散于灭菌的去离子水中，在磁力搅拌下，用质量浓度为
I%的乙酸溶解，用O. 22 μ m滤器过滤，静置至气泡消去。步骤一中每O. ImL新城疫L-系病毒液的病毒含量> IO7EID500步骤二中三聚磷酸钠的滴加速率为O. 5mL/min, PBS的滴加速率为O. 2mL/min，司班-80的滴加速率为O. 2mL/min。本实施方式步骤二得到的负载新城疫L-系病毒的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的透射电镜图如图5所示，负载新城疫L-系病毒的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的粒径分布图如图6所示。本实施方式获得的负载新城疫L-系病毒的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒油佐剂疫苗的成品如图7所示。本实施方式制得的纳米粒油佐剂疫苗黏度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。
权利要求
1.纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，其特征在于纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，按以下步骤进行一、取5mL浓度为O. 5 2mg/mL的壳聚糖溶液或5mL浓度为O. 5 2mg/mL的 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，向其中滴加I. 25 7. 5mL新城疫L-系病毒液，搅拌均匀，获得溶液A ;二、将溶液A在室温、无菌条件下以900 1300r/min磁力搅拌30s，然后向溶液A中滴加2. 5mL浓度为O. 5 3mg/mL的三聚磷酸钠，搅拌均匀后匀速滴加ImL pH 值7. 4的PBS缓冲液，搅拌均匀后再匀速滴加ImL的司班-80，获得溶液B ;三、将溶液B于 40C、13000r/min离心30min，吸取上清液，为溶液B1，沉淀经去离子水悬浮，为溶液B2 ;四、将 94份注射用白油于160°C高温灭菌30min，然后加入6份司班-80，在160°C维持lOmin，然后冷却至室温，得溶液C1 ;取96份溶液B1，加入4份吐温-80，混合均匀，得溶液C2 ;五、将溶液C1置于组织捣碎器内搅拌，同时滴加溶液C2,于8000 10000r/min搅拌5 20min，得溶液C ;六、将溶液C置于磁力搅拌器内搅拌，同时滴加溶液B2,于900 1300r/min搅拌5 15min,即得到纳米粒油佐剂疫苗；其中步骤五中溶液C1与溶液C2的体积比为I 3 I ； 步骤六中溶液C和溶液B2的体积比是I 2 I。
2.根据权利要求I所述的纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，其特征在于步骤一中壳聚糖溶液的制备方法为称取壳聚糖分散于灭菌的去离子水中，在磁力搅拌下，用质量浓度为 I %的乙酸溶解,用0. 22 μ m滤器过滤,静置至气泡消去。
3.根据权利要求I所述的纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，其特征在于步骤一中N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液的制备方法为称取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖分散于灭菌的去离子水中，在磁力搅拌下，用质量浓度为1%的乙酸溶解，用0. 22μπι滤器过滤， 静置至气泡消去。
4.根据权利要求I或2所述的纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，其特征在于步骤一中每0.ImL新城疫L-系病毒液的病毒含量彡IO7EID500
5.根据权利要求4所述的纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，其特征在于步骤二中三聚磷酸钠的滴加速率为0. 5mL/min, PBS的滴加速率为0. 2mL/min，司班-80的滴加速率为、0.2mL/min。
全文摘要
纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，涉及一种纳米粒油佐剂疫苗的制备方法。本发明提供一种纳米粒油佐剂疫苗的制备方法，如下取壳聚糖溶液或N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，加新城疫病毒液，得溶液A；向溶液A加三聚磷酸钠，再加PBS缓冲液，搅拌后加司班-80，得溶液B；将溶液B离心，取上清液，为溶液B1，沉淀经去离子水悬浮，为溶液B2；将注射用白油高温灭菌，加入司班-80，冷却得溶液C1；取溶液B1，加入吐温-80，得溶液C2；将溶液C1中加溶液C2，搅拌得溶液C；向溶液C中加溶液B2，搅拌即得纳米粒油佐剂疫苗。本发明制备载病毒纳米粒粒径小，包封率高、载药量大、制备条件温和、制备工艺简单，生产成本较低。
文档编号A61K39/39GK102580083SQ20121009963
公开日2012年7月18日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者赵凯, 陈刚 申请人:黑龙江大学