专利名称：PPA-linker-Thanatin融合蛋白及制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及到用大肠杆菌表达重组蛋白的基因工程制备及其在临床应用中的价值。
背景技术：
近年来国际顶级杂志Cell、Nature、Science等纷纷发表综述、专论、论著评述炎症与肿瘤之间关系的研究进展及其意义，引起了各国学者的兴趣和重视。研究表明炎症与肿瘤关系密切，慢性炎症与1/4以上癌症发生相关。炎症微环境中细胞因子、自由基、前列腺素、生长因子等炎性应答介质能诱导DNA甲基化、抑癌基因点突变和翻译后修饰等基因和表观学变化，引起维持正常细胞内环境稳定关键通路的改变并导致癌症的发生和演进。 一般的抗肿瘤药物鲜有抗菌的作用。所以在新药的开发中，抗菌消炎的抗肿瘤药物的研发有巨大的应用价值。为了更好的发挥不同种类的多肽的药物效果，采用化学合成或者分子克隆生产重组多肽药物的技术已经非常成熟。Boman的研究小组通过化学合成的将其中一种抗菌肽-抗菌肽A (Cecropin) N端的1_7号氨基酸与蜂毒素的N端5_12号氨基酸连接起来，这样连接起来的杂合肽(CAM)的大小相当于抗菌肽A的40%，但抗菌活性并没有因此而降低，反而增强。李艳红等用基因工程的方法获得了这种杂合肽，将化学合成出来的杂合肽 CA (1-7)M(5-12)基因通过接头连接到E. coli分泌表达载体pIN的外膜蛋白A(OmpA2)信号肽的基因序列上，在Lpp启动子和Lac启动子/操纵子的调控下进行分泌表达。为了达到预定的多肽重组表达，天蚕抗菌肽和溶菌酶(Mdc-hly)的克隆基因被克隆到pET3h上，在 E. coli菌株BL21(DE3)表达，重组蛋白的抗菌能力得到了显著的提高。总体来说，运用基因工程表达重组多肽是一种的可行方法。本发明利用基因克隆的方法在大肠杆菌中表达掌叶半夏凝集素和死亡素的融合蛋白，特异性的修饰掌叶半夏凝集素的抗菌效果，为新型的抗菌抗肿瘤药物的研究提供基础。掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)是天南星科多年生草本植物，主要分布于中国、朝鲜和日本。在我国中药研究中，掌叶半夏主要以块茎入药，它具有凝血、镇咳、镇痛、抗溃疡、抗心律失常、降血脂、抗肿瘤、抗虫、镇静催眠等药理作用。掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin, PPA)是一种从掌叶半夏中分离出来具有凝血活性的植物性掌叶半夏蛋白，具有与甘露糖及其聚合物专一结合的性质，有凝血、抗肿瘤、杀虫等重要的生理功能。抗菌肽(Protegrin)是生物体内一种具有抗菌活性的动物蛋白，广泛存在于植物和动物体中，它是最早发展的一类内生免疫原性的分子机制，它代表了寄主抵抗外来微生物第一层防御系统。死亡素(Thanatin)，又称死亡肽，是在昆虫斑腹刺益蝽 (Podisus maculiventris)中发现的由21个氨基酸残基组成的抗菌肽，结构简单，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和某些真菌都有抑制作用，但是对酵母影响不大，对哺乳动物细胞也不表现出溶血性。掌叶半夏凝集素和死亡素均以在大肠杆菌中表达成功表达的掌叶半夏凝集素具有很好的凝血活性，并在体外抑制人肝癌细胞QGY7703-3生长；表达的死亡素具有很好的抗菌效果，分别对革兰氏阳性菌株和革兰氏阴性菌株有抑制生长的效果。这些都为本发明提供了技术基础。在利用大肠杆菌表达掌叶半夏凝集素和死亡素的融合蛋白中，也克服了一些问题三步PCR过程即融合基因的构建中，碱基的缺失、突变都会造成融合蛋白的表达，所以必须进行每一步PCR的退火温度的优化并且PCR结果要克隆到T载体上进行测序分析；在 37°C利用IPTG诱导表达过程中，融合蛋白表达活性较低，尝试利用低温诱导表达，并且诱导时间和IPTG浓度适当加高后，融合蛋白的活性得到了明显的提高。同时，为了充分发挥掌叶半夏凝集素和死亡素各自不同的生物学功能，我们用柔性肽(Linker)来融合两个多肽。总之，利用基因克隆的方法，将不同来源的两中蛋白进行融合表达，为新型的抗菌抗肿瘤药物的研究提供了一定的基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种PPA-Iinker-Thanatin融合蛋白及其制备方法，该掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物具有生物学活性，且对肿瘤细胞的生长具有抑制作用。为了解决上述技术问题，本发明提供一种PPA-Iinker-thanatin融合蛋白，其为 SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本发明还同时提供了上述PPA-I inker-thanatin融合蛋白的制备方法通过两步PCR的方法获得重组掌叶半夏凝集素和死亡素的目的基因，并用目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET48a-C(+)，通过IPTG诱导获得表达蛋白，该表达蛋白为 PPA-Iinker-thanatin融合蛋白(也即掌叶半夏凝集素_死亡素表达产物)。作为本发明的PPA-Iinker-thanatin融合蛋白的制备方法的改进掌叶半夏凝集素目的基因的获取是通过RT-PCR方法合成的，通过设计两对引物在掌叶半夏凝集素基因全长的ORF终止密码子前3’端扩增死亡素63bp基因；第二对引物设计引入酶切位点Nco I 和Bio I，通过两步PCR方法将掌叶半夏凝集素和死亡素的编码基因连接重组，获得PCR目的基因产物，连接到T载体中保存。作为本发明的PPA-Iinker-thanatin融合蛋白的制备方法的进一步改进将 PMD18-T载体质粒经Nco I.Xho I双酶切和pETj8a-C (+)质粒经双酶切后，连接成为重组表达载体质粒pET-28a-c (+)。综合所述，本发明的优点如下将植物性蛋白掌叶半夏凝集素和动物性蛋白死亡素首次在PET原核表达系统中表达，并得到掌叶半夏凝集素-死亡素融合蛋白，这种融合蛋白兼有掌叶半夏凝集素抗肿瘤细胞的效果和死亡素广谱抗菌的效果，为抗肿瘤新药开发奠定基础，具有十分重大的新药市场开发应用前景。为此，本发明采用pET原核表达系统在大肠杆菌中表达具有极高临床应用价值的掌叶半夏凝集素-死亡素蛋白，在新西兰大白兔中做抗血清检测，为新型抗肿瘤药物打下坚定的基础。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是掌叶半夏块茎中总RNA反转录为cDNA的电泳图谱；M :15kb DNA marker ；1 :cDNA ；图2是编码掌叶半夏ppa基因的克隆；M :15kb DNA marker ；1,2 =Oligo 组反转录 cDNA 组 PCR 结果；4,5. 6 随机组反转录cDNA组PCR结果；图3是ppa基因酶切鉴定分析；M:5kb DNA marker ；1 :pEasy Tl_ppa(01igo 组)；2 :pEasy Tl-ppa(Random 组)图4ppa基因序列分析结果；图5ppa基因序列BLAST结果；图 6 是 ppall PCR 产物和 ppall_pMD18_T Hind III, EcoR I 双酶切鉴定;图 7 是 ppal2-pMD18_T 质粒和 ppal2_pMD18_T 的 Hind III、EcoR I 双酶切鉴定；图 8 是 ppal3 PCR 产物和 ppal3_pMD18_T Hind III，EcoR I 双酶切鉴定；图9 是 pET28a_pt 的鉴定；M Ikb Marker ； 1 以 pET28a_pt 为模板 PCR 产物；2 阴性对照；3 :pET28a_pt 的 SalLXhoI双酶切鉴定；图 10 Mi ppa-linker-thanatin (pt) ；粗体(且带双下划线)的为编码thanatin的基因，斜体(且带单下划线)的为 linker基因，其余为编码ppa基因；图11是pET28a-ppa-linker_thanatin (pt)重组载体的表达形式鉴定；M 低分子量蛋白 marker ；1 :pET28a_pt/BL21 诱导组；2 诱导组 pET28a_pt/BL21 上清；3 诱导组 pET28a-pt/BL21 沉淀；4 :pET28a_pt/BL21 未诱导组；图12是掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物的纯化；M 低分子量蛋白marker ；1 纯化后的蛋白；图13是掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物的凝血活性检测；1 阴性对照；2 =PPA-Iinker-Thanatin处理后凝血分析；图14是掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物的MTT法抗肿瘤效果检测。
具体实施例方式实施例1、掌叶半夏凝集素的cDNA基因的获得从掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott) ±夬莲中提取总RNA，参照 TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 使用说明书，掌叶半夏总 RNA 反转录成单链cDNA。First-Strand cDNA 的合成体系如下
权利要求
1.一种PPA-Iinker-thanatin融合蛋白，其特征在于为SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的PPA-Iinker-thanat in融合蛋白的制备方法，其特征在于通过两步PCR的方法获得重组掌叶半夏凝集素和死亡素的目的基因，并用目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pETISa-c (+)，通过IPTG诱导获得表达蛋白，该表达蛋白为 PPA-I inker-thanat in 融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的PPA-linker-thanatin融合蛋白的制备方法，其特征在于 所述的掌叶半夏凝集素目的基因的获取是通过RT-PCR方法合成的，通过设计两对引物在掌叶半夏凝集素基因全长的ORF终止密码子前3’端扩增死亡素63bp基因；第二对引物设计引入酶切位点Nco I和B10 I，通过两步PCR方法将掌叶半夏凝集素和死亡素的编码基因连接重组，获得PCR目的基因产物，连接到T载体中保存。
4.根据权利要求2所述的PPA-linker-thanatin融合蛋白的制备方法，其特征在于 将PMD18-T载体质粒经Nco I.Xho I双酶切和pETj8a-C (+)质粒经双酶切后，连接成为重组表达载体质粒pET-28a-c (+)。
全文摘要
本发明公开了一种PPA-linker-thanatin融合蛋白，为SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了上述PPA-linker-thanatin融合蛋白的制备方法通过两步PCR的方法获得重组掌叶半夏凝集素和死亡素的目的基因，并用目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a-c(+)，通过IPTG诱导获得表达蛋白，该表达蛋白为PPA-linker-thanatin融合蛋白，也即掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物。该掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物具有生物学活性，且对肿瘤细胞的生长具有抑制作用。
文档编号C12N15/70GK102241778SQ20111016298
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者刘学锋, 吕正兵, 徐涛, 田辉 申请人:浙江理工大学