专利名称：一种羊肚菌菌种鉴定方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及一种羊肚菌菌种的鉴定方法。
背景技术：
羊肚菌是羊肚菌属(Mordwlla)真菌的统称，全世界已报道50余种，中国已报道 10余种(关于羊肚菌属物种的界定，不同学者之间分歧较大，有些学者仅承认羊肚菌属的 3 6个物种名称)，它们全都是具有重要食用和药用价值的珍稀经济真菌。羊肚菌菌种是指生活于一定培养基上的羊肚菌菌丝体，是重要的生物资源，也是相关科研、教学上的重要材料。对羊肚菌的利用主要有两种途径。其一是利用羊肚菌的子实体，目前市场上的羊肚菌子实体主要来源于野外采集，因货源稀少，价格一直很高，国内市场价一般稳定在每公斤400 500元，国际市场价高达每公斤200美元左右。利用羊肚菌菌种通过人工栽培的方法生产其子实体，是百余年来真菌学家和食用菌栽培者竭力探索的课题之一，并且，国内外均有通过人工栽培生产出羊肚菌子实体的报道，但迄今未实现羊肚菌的商品化人工栽培。 已报道的羊肚菌人工栽培技术都停留在子实体偶然产生且产量很低的水平，距商品化生产还有相当大的差距。目前，在许多地方，关于羊肚菌人工栽培的探索仍在进行中。对羊肚菌开发利用的另一条途径是利用羊肚菌菌种通过工业发酵的方法生产菌丝体产品。国外从上世纪六十年代已开始商业化生产羊肚菌菌丝体作为调味品。无论是从事羊肚菌人工栽培探索等方面的科学研究，还是开展羊肚菌的工业发酵生产，都需要利用羊肚菌菌种。对羊肚菌菌种进行真伪鉴定，判别其是否真的是羊肚菌菌种，是相关科研、生产和菌种保藏单位的一项重要工作。羊肚菌是一种能产生大型子实体的真菌，属于大型真菌范畴，关于大型真菌的菌种鉴定，传统的方法是通过人工栽培使其产生子实体，然后依据子实体的特征进行鉴定。由于羊肚菌在人工栽培的条件下基本不产生子实体，只是很个别的单位在很偶然的情况下培养出过羊肚菌子实体，这使得依据子实体特征对羊肚菌菌种进行鉴定的方法很难实现。对于从事羊肚菌研究来讲，若应用的菌种是假的，其研究结果就不可能正确，这也是长期以来羊肚菌研究未取得明显进展的重要原因之一。对于从事羊肚菌菌丝体发酵生产的单位来讲，若应用的菌种是假的，还存在着造成严重危险的可能。分子生物学技术的发展使得人们可以利用真菌的菌丝体测出其特定的DNA序列， 然后依据其特定DNA序列进行羊肚菌等真菌的菌种鉴定。但这种基于分子生物学技术的鉴定，需要比较昂贵的仪器设备和专业的科技人员，花费的资金也较多，许多单位尚无法开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于菌丝体形态特征的羊肚菌菌种鉴定方法，克服以上所述两类羊肚菌菌种鉴定方法的缺点，实现在简易条件下对羊肚菌菌种的快速鉴定。
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本发明的目的是通过如下技术方案实现的先观察待鉴定菌种的培养基表面菌丝，若观察到的培养基表面菌丝具有羊肚菌培养基表面菌丝的典型形态特征，可初步判断该菌种是羊肚菌菌种，再进一步观察其基内菌丝，若观察到的基内菌丝具有羊肚菌基内菌丝的形态特征，即可判定该菌种就是羊肚菌菌种。具体步骤如下
(1)在一个培养皿中并列放两块载玻片(两块载玻片之间留间隙)，将融化并冷却至 45 50°C的PDA培养基倾倒在载玻片上，在每块载玻片上都制成厚度约2 3mm的平板培养基；用接种针从待鉴定菌种的菌落上取菌丝体分别接种到每块平板培养基的中部，盖上培养皿的盖，将其置于18 20°C的培养箱中培养；当待鉴定菌种在上述平板培养基上长出的新菌落半径达1 1. 5cm时，即可用于以下步骤的鉴定；
(2)将步骤(1)所述培养皿中的一块承载有待鉴定菌种菌落的载玻片取出，用擦镜纸将载玻片下面(无培养基的一面)擦净，在菌落边缘处滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片，用吸水纸从盖玻片边缘吸去多余的水；
(3)将经上述经步骤(2)处理的载玻片置显微镜下观察，以培养基表面菌丝的形态特征作为判断是否为羊肚菌的重要依据，若观察到的培养基表面菌丝具有羊肚菌培养基表面菌丝的典型形态特征，可初步判断该菌种为羊肚菌菌种；所述羊肚菌培养基表面菌丝的典型形态特征是菌丝有明显的主干，作为主干的菌丝较长，挺直，粗细比较均勻，隔膜较少，两侧生分枝；从主干上生出的分枝有两类，其中一类在很短的距离内多次分枝，呈聚集的树枝状，这些构成聚集树枝状分枝的小枝都较短，粗细不均勻，也不直；从主干上生出的另一类分枝与主干形态相似，可称为次级主干；次级主干上的分枝特性与主干相似，即可产生两类分枝，其中一类为再次一级的主干，另一类在很短的距离内多次分枝，呈聚集的树枝状；各级主干上虽可产生次级主干，但产生的次级主干数较少，产生的大多数分枝是短小且在很短的距离内多次分枝的聚集树枝状分枝(见图1 一图3)；
(4 )将步骤(1)所述培养皿中的另一块承载有待鉴定菌种菌落的载玻片取出，在有菌落的地方切取大小约为0. 3X0. 3cm的培养基小块，并用刀片切去该培养基小块表面厚约 Imm的部分(即切掉表面着生有菌落的一层培养基)；
(5)将步骤(4)所述切掉了表面的培养基小块切成厚约1 2 mm的薄片(切面与平板培养基的表面平行)，将切成的培养基薄片置于载玻片上的水滴中，盖上盖玻片，并按压盖玻片将培养基薄片挤压成一薄层，然后将载玻片置显微镜下观察，观察到的菌丝即是基内菌丝。若观察到的基内菌丝具有羊肚菌基内菌丝的形态特征，即可判定该菌种就是羊肚菌菌种。羊肚菌的基内菌丝是由该菌培养基表面菌丝上呈聚集树枝状分枝的顶端向培养基内部生长形成的，具有以下形态特征菌丝粗细不勻，不直，颜色比羊肚菌的培养基表面菌丝色浅，分枝多且不规律；总的来看，羊肚菌的基内菌丝与培养基表面的菌丝有很明显的差异。总之，若经过以上步骤，观察到的培养基表面菌丝和基内菌丝分别具有羊肚菌培养基表面菌丝和基内菌丝的特征，即可判定该菌种是羊肚菌菌种；若经过以上步骤，观察到的培养基表面菌丝不具有羊肚菌培养基表面菌丝的形态特征，或者观察到的基内菌丝不具有羊肚菌基内菌丝的形态特征，即可判定所鉴定的菌种不是羊肚菌菌种。本发明的优点是操作简单，不需要特的殊仪器和设备，成本低，鉴定结果容易判断，且鉴定结果较为可靠。
图1 3为羊肚菌的培养基表面菌丝； 图4 6为非羊肚菌的培养基表面菌丝。
具体实施例方式本发明的羊肚菌菌种鉴定方法，具体步骤如下
(1)在一个培养皿中并列放两块载玻片(两块载玻片之间留有间隙)，将融化并冷却至 45 50°C的PDA培养基倾倒在载玻片上，在每块载玻片上都制成厚度约2 3mm的平板培养基；用接种针从待鉴定菌种的菌落上取菌丝体分别接种到每块平板培养基的中部；盖上培养皿的盖，将其置于18 20°C的培养箱中培养；当待鉴定菌种在上述平板培养基上长出的新菌落半径达1 1. 5cm时，即可用于以下步骤的鉴定；
(2)将步骤(1)所述培养皿中的一块承载有待鉴定菌种菌落的的载玻片取出，用擦镜纸将载玻片下面(无培养基的一面)擦净，在菌落边缘处滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片，用吸水纸从盖玻片边缘吸去多余的水；
(3)将上述载玻片置显微镜下观察，以培养基表面菌丝的形态特征作为判断是否为羊肚菌的重要依据；若观察到的培养基表面菌丝具有羊肚菌培养基表面菌丝的形态特征(如图1 3所示)，可初步判断该菌种为羊肚菌菌种。羊肚菌培养基表面菌丝的形态特征是 菌丝有明显的主干，作为主干的菌丝较长，挺直，粗细比较均勻，隔膜较少，两侧生分枝；从主干上生出的分枝有两类，其中一类在很短的距离内多次分枝，呈聚集的树枝状，这些构成聚集树枝状分枝的小枝都较短、粗细不均勻，也不直；从主干上生出的另一类分枝与主干形态相似，可称为次级主干。次级主干上的分枝特性与主干相似，即可产生两类分枝，其中一类为再次一级的主干，另一类在很短的距离内多次分枝，呈聚集的树枝状。各级主干上虽可产生次级主干，但产生的次级主干数较少，产生的大多数分枝是短小且在很短的距离内多次分枝的聚集树枝状分枝；
(4 )将步骤(1)所述培养皿中的另一块承载有待鉴定菌种菌落的的载玻片取出，在有菌落的地方切取大小约为0. 3X0. 3cm的培养基小块，并用刀片切去该培养基小块表面厚约Imm的部分(即切掉表面着生有菌落的一层培养基)；
(5)将上述切掉了表面的培养基小块切成厚约1 2mm的薄片(切面与平板培养基的表面平行)，将切成的培养基薄片置于载玻片上的水滴中，盖上盖玻片，并按压盖玻片将培养基薄片挤压成一薄层，然后将载玻片置显微镜下观察，观察到的菌丝即是基内菌丝；若观察到的基内菌丝具有羊肚菌基内菌丝的形态特征，即可判定该菌种就是羊肚菌菌种。羊肚菌基内菌丝的形态特征如下菌丝粗细不勻，不直，颜色比羊肚菌在培养基表面的菌丝色浅，分枝多且不规律。总的来看，羊肚菌的基内菌丝与培养基表面的菌丝有很明显的差异。 羊肚菌的基内菌丝是由羊肚菌的培养基表面菌丝上呈聚集树枝状分枝的顶端向培养基内部生长形成的。若经过以上步骤，观察到的培养基表面菌丝不具有羊肚菌培养基表面菌丝的典型形态特征，或者观察到的基内菌丝不具有羊肚菌基内菌丝的形态特征，即可判定所鉴定的菌种不是羊肚菌菌种。用本发明的方法和基于rDNA内转录间隔区(ITS)序列的分子鉴定方法(对照)分别对包括有羊肚菌菌种的近百个菌种材料进行了鉴定试验，试验证实，两种鉴定结果完全一致。见下表
本发明的鉴定方法与分子鉴定法的鉴定结果对比
权利要求
1.一种羊肚菌菌种鉴定方法，其特征在于，先观察待鉴定菌种在培养基表面的菌丝，若观察到的培养基表面菌丝具有羊肚菌培养基表面菌丝的典型形态特征，可初步判断该菌种是羊肚菌菌种，再进一步观察其基内菌丝，若观察到的基内菌丝具有羊肚菌基内菌丝的形态特征，即可判定该菌种就是羊肚菌菌种。
2.根据权利要求1所述的羊肚菌菌种鉴定方法，其特征在于，具体步骤如下(1)在一个培养皿中并列放两块载玻片，将融化并冷却至45 50°C的PDA培养基倾倒在载玻片上，在每块载玻片上都制成厚度约2 3mm的平板培养基；用接种针从待鉴定菌种的菌落上取菌丝体分别接种到每块平板培养基的中部；盖上培养皿的盖，将其置于18 20°C的培养箱中培养；当待鉴定菌种在上述平板培养基上长出的新菌落半径达1 1. 5cm 时，可用于以下步骤的鉴定；(2)将步骤(1)所述培养皿中的一块承载有待鉴定菌种菌落的载玻片取出，用擦镜纸将载玻片下面擦净，在菌落边缘处滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片，用吸水纸从盖玻片边缘吸去多余的水；(3)将上述经步骤(2)处理的载玻片置显微镜下观察培养基表面的菌丝，若观察到的培养基表面菌丝具有羊肚菌培养基表面菌丝的典型形态特征，可初步判断该菌种为羊肚菌菌种；(4 )将步骤(1)所述培养皿中的另一块承载有待鉴定菌种菌落的的载玻片取出，在有菌落的地方切取大小约0. 3cmX0. 3cm的培养基小块，并切去该培养基小块表面厚约Imm的部分；(5)将步骤(4)所述切掉了表面的培养基小块切成厚约1 2 mm的薄片(切面与平板培养基的表面平行)，将切成的培养基薄片置于载玻片上的水滴中，盖上盖玻片，并按压盖玻片将培养基薄片挤压成一薄层，然后将载玻片置显微镜下观察，观察到的菌丝即是基内菌丝，若观察到的基内菌丝具有羊肚菌基内菌丝的形态特征，即可判定该菌种就是羊肚菌菌种。
3.根据权利要求1或2所述的羊肚菌菌种鉴定方法，其特征在于，所述羊肚菌培养基表面菌丝的典型形态特征是菌丝有明显的主干，作为主干的菌丝较长，挺直，粗细比较均勻， 隔膜较少，两侧生分枝；从主干上生出的分枝有两类，其中一类在很短的距离内多次分枝， 呈聚集的树枝状，这些构成聚集树枝状分枝的小枝都较短，粗细不均勻，也不直；从主干上生出的另一类分枝与主干形态相似，可称为次级主干；次级主干上的分枝特性与主干相似， 即可产生两类分枝，其中一类为再次一级的主干，另一类在很短的距离内多次分枝，呈聚集的树枝状；各级主干上虽可产生次级主干，但产生的次级主干数较少，产生的大多数分枝是短小且在很短的距离内多次分枝的聚集树枝状分枝。
4.根据权利要求1或2所述的羊肚菌菌种鉴定方法，其特征在于，所述羊肚菌基内菌丝的形态特征是菌丝粗细不勻，不直，颜色比羊肚菌的培养基表面菌丝色浅，分枝多且不规律，羊肚菌的基内菌丝是由羊肚菌的培养基表面菌丝上呈聚集树枝状分枝的顶端向培养基内部生长形成的。
全文摘要
本发明属于微生物技术领域,涉及一种羊肚菌菌种的鉴定方法。本发明的方法是先观察待鉴定菌种在培养基表面的菌丝，若观察到的培养基表面菌丝具有羊肚菌培养基表面菌丝的典型形态特征，可初步判断该菌种是羊肚菌菌种，再进一步观察其基内菌丝，若观察到的基内菌丝具有羊肚菌基内菌丝的形态特征，即可判定该菌种就是羊肚菌菌种。本发明的羊肚菌菌种鉴定方法操作简单，不需要特殊的仪器和设备，成本低，鉴定结果容易判断，且鉴定结果可靠。
文档编号C12Q1/04GK102242183SQ201110162490
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者侯军, 张华 , 张洋, 林晓民, 王少先 申请人:河南科技大学