专利名称：建立ca16病毒感染动物模型的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒学和免疫学技术领域，具体是涉及用于建立CA16病毒感染动物模型的病毒株、方法以及试剂盒等。
背景技术：
柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)属于小核糖核酸(RibonucleicAcid, RNA)病毒科(Picornaviridae)，肠道病毒属(Enterovirus)，是多种人类疾病的致病病原，致病谱广，可引起呼吸道感染、结膜炎、发热性皮疹、疱疹性咽峡炎、心肌炎、心肌病及无菌性脑膜炎、脑炎和急性弛缓性麻痹等疾病，CV不同于其他肠道病毒，自1948年Dalldorf首次在纽约成功分离时，即发现该病毒对新生小鼠具有很高的敏感性，根据病毒对乳鼠的致病力将其划分成A、B两组，共30个血清型。CA16是人类最早发现的柯萨奇病毒A组病毒成员之一，为20面立体对称球形颗粒，直径约23 30nm，无包膜和突起，由衣壳和核酸组成。核酸为单股正链RNA，全长约7410 个核苷酸，包含1个开放读码框架(Open Reading Frame, 0RF)，可分为PI、P2、P3三个区， 其中P2、P3区编码非结构蛋白；Pl区编码病毒的结构蛋白VPl VP4，该4个结构蛋白组成一个亚单位，60个亚单位组成病毒衣壳。CA16可引起5岁以下婴幼儿手足口部疱疹，是除肠道病毒71型(EV71)以外的另一个导致手足口病(Hand，Foot and Mouth Diszease,HFMD)的主要病原体。与EV71相比， CA16引起的HFMD多数症状较轻，不需特殊干预可自行痊愈，但在各地的流行中也不断出现少数CA16引发重症脑炎甚至引发死亡的报道。近几年亚洲地区HFMD发病和死亡人数的快速增长，经流行病调查显示多数流行呈EV71和CA16共同流行或交替流行的态势。由于EV71 是引起重症HFMD的主要病原体，EV71疫苗和治疗药物的研究在国家多方面的重点支持下得到了快速的发展，而CA16疫苗和治疗药物的研究相对滞后，急需更多关注，以配合EV71 防治工作共同构筑有效的HFMD防控体系。理想的病毒性疾病动物模型是研究病毒在体内的入侵、复制、传导、致病、转归等机理以及评价疫苗预防效果和药物疗效等的重要工具，虽然50年代就已明确CA16可引起新生乳鼠出现全身性肌炎而导致死亡，但至今尚无CA16动物模型成功建立和应用的报道， 成功的动物模型已成为直接影响疫苗保护效果评价和药物筛选的主要瓶颈。
发明内容
本发明成功筛选了适于建立CA16动物感染模型的病毒株，建立了稳定、有效的 CA16感染乳鼠动物模型，为CA16防治疫苗和药物的研发奠定了基础。具体地，本发明以21例2008年北京地区HFMD患儿的临床样本为研究对象，经 vero细胞连续传代获得可稳定复制的病毒株一株，命名为VR18。对VR18采用终末稀释法进行2次噬斑纯化获得纯化病毒VR18-8ac。经WHO分发的肠道病毒组合血清检测，该病毒只能被CA16血清中和证实为CA16病毒，经全基因序列检测，VR18的基因全长为7410nt，构建VPl区进化树显示VR18为CA16病毒Cl亚型，VR18-8ac的基因全长测序结果如序列表中SEQ ID N0:1所示。经挑选50个克隆，分别进行VPl区PCR扩增后基因序列检测，证实全部克隆均为VR18病毒。经外源因子检测，证实该病毒株无其他外源因子污染。经生物学特性分析，该病毒株病毒滴度为6. 1751gCCID50/ml，在VERO细胞上可形成明显噬斑，噬斑滴度为 5. 9841gPFU/ml。本发明从临床样本中成功分离纯化了用于建立CA16病毒感染动物模型的CA16C1 亚型病毒株VR18。其中经vero细胞连续传代获得的病毒株VR18，第四代VR18，经连续2 代噬斑纯化的VR18和经1代鼠脑纯化的VR18均于保藏日期在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京)进行了生物保藏，分别为柯萨奇病毒A组16型 (Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18，保藏号CGMCC No. 4851 ；柯萨奇病毒A组 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_4，保藏号CGMCC No. 4852 ；柯萨奇病毒 A 组 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_8ac，保藏号CGMCC No. 4853 ；柯萨奇病毒A组 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18-J，保藏号CGMCC No. 4854。 并且申请人已经提供了上述生物材料的保藏证明和存活证明。除了上述进行生物保藏的VR18病毒株，由VR18病毒株连续传代，同时能够用于建立CA16病毒感染动物模型的病毒株，也是本发明保护的范围。一般来说，本发明涉及能够用于建立CA16病毒感染动物模型，并且基因序列与SEQ ID NO 1具有90%以上，95%以上， 98%以上和99%以上同源性的CA16病毒株。本发明也涉及基因序列为由SEQ ID N0:1进行一个或几个核苷酸取代，并能用于建立CA16病毒感染动物模型的CA16病毒株。本发明成功建立了一种CA16病毒感染动物模型的制备方法，其步骤包括使用上述CA16病毒株感染乳鼠。本发明还涉及上述CA16病毒株在建立CA16病毒感染动物模型中的用途。另外，本发明也涉及一种用于建立CA16病毒感染动物模型的试剂盒，所述试剂盒含有上述CA16病毒株。在CA16动物模型的建立中，分别使用了不同代次和不同纯化方法的V18病毒株，包括 VR18 (CGMCC No. 4851)，V18-4 (CGMCC No. 4852)，经连续 2 代噬斑纯化的 VR18-8ac (CGMCC No. 4853)和经1代鼠脑纯化的VR18-J (CGMCC No. 4854)。结果显示不同代次的VR18和不同纯化方式获得的VR18 (细胞培养噬斑纯化、鼠脑分离纯化)均可使模型动物出现不同程度的发病及死亡。根据病毒毒力和病毒纯度，优选VRlS-Sac病毒株建立CA16 动物感染模型。本发明分别采用颅内、腹腔、口服方式感染1日龄以内新生ICR乳鼠。结果显示3 种感染方式均不同程度使模型动物发病和死亡，其中颅内和腹腔方式均可在感染后短期内导致100%的死亡率。由于对于1日龄乳鼠颅内接种较腹腔接种更易操作，因此优选颅内接种方式构建CA16感染模型。本发明使用病毒株分别接种新生1、3、5、7、14日龄的ICR小鼠。结果表明新生1_5 日龄的ICR小鼠全部出现发病和死亡，发病和死亡时间随小鼠日龄的增长而延长；而对7日龄小鼠随可使其100%发病，但部分小鼠发病后逐渐恢复，病死率为67% ；14-21日龄小鼠则不出现发病和死亡。因此感染乳鼠的日龄可以是1-7日，优选为1日龄。本发明分别对VR18-8ac从1 :16_1 :524288进行8倍系列稀释后进行毒力研究，结果表明该模型临床症状鲜明、重现性良好，同时表现出明显的剂量依赖性、动物日龄依赖性。本发明建立的CA16动物模型，所用攻击病毒背景清晰、无外源因子污染、攻毒后实验动物临床症状清晰、典型，重复性好、同时具有良好的剂量依赖性。通过应用研究显示， 主动免疫CA16灭活病毒和被动免疫高效价CA16中和抗体均可保护实验动物免受致死量病毒攻击，可用于今后CA16疫苗或药物的免疫保护或疗效研究。
图1不同代次、不同纯化方式CA16的乳鼠敏感性比较图2IOOOLD5tl剂量CA16病毒感染乳鼠的发病和死亡情况图3100LD5(1剂量CA16病毒感染乳鼠的发病及死亡情况图4CA16中和抗体保护试验图5CA16灭活病毒免疫保护试验生物材料保藏菌种名称柯萨奇病毒A 组 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18， 保藏号CGMCC No. 4851 ；保藏日期2011年5月11日，保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；菌种名称柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_4， 保藏号CGMCC No. 4852 ；保藏日期2011年5月11日，保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；菌种名称柯萨奇病毒A 组 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株 VR18-8ac，保藏号CGMCC No. 4853 ；保藏日期2011年5月11日，保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；菌种名称柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_J， 保藏号CGMCC No. 4854，保藏日期2011年5月11日，保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；。
具体实施例方式实施例1CA16病毒的选择根据文献报道，CA病毒通过颅内感染方式可使1日龄以内的新生乳鼠出现全身性肌炎而死亡，因此本研究选用1日龄ICR乳鼠作为模型动物，分别对相同剂量的不同代次的VR18(VR18、VR18-4)、经连续2代噬斑纯化VR18 (VR18_8ac)和经1代鼠脑纯化 VR18 (VR18-J)进行颅内感染研究，结果VR18-4、VR18-8ac、VR18-J均使模型动物在感染后 4d出现后肢麻痹，感染后5d全部死亡。而VRl8感染动物症状相对较轻，在感染后4d陆续开始出现后肢麻痹，至感染后14d除2只动物发病后逐渐恢复外其余6只全部死亡，死亡率为75% (见图1)。结果显示不同代次VR18和不同纯化方式获得的VR18(细胞培养噬斑纯化、鼠脑分离纯化)均可使模型动物出现不同程度的发病及死亡。根据病毒毒力和病毒纯度，优选VRlS-Sac采用颅内方式感染1日龄以内新生ICR乳鼠建立CA16动物模型。实施例2感染方式的选择
用相同剂量VRlS-Sac病毒株分别采用颅内、腹腔、口服方式感染1日龄以内新生 ICR乳鼠。结果三种感染方式的动物死亡率分别为100^^100^^67% ；开始发病时间分别为4d、4d和5d ；全部死亡时间分别为5d、4d、12d (见表1)。显示3种感染方式均不同程度可使模型动物发病和死亡，其中颅内和腹腔方式均可在感染后短期内导致100%的死亡率。 由于对于1日龄乳鼠颅内接种较腹腔接种更易操作，因此优选颅内接种构建CA16感染模型。表1不同感染方式的比较
权利要求
1.一种可以稳定复制和传代的CA16病毒株VR18。
2.根据权利要求1所述的病毒株VR18，其特征在于其基因序列如SEQIDNO :1所示，或者其基因序列与SEQ ID NO :1具有90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性，又或者其基因序列是由SEQ IDNO 1经过一个或几个核苷酸取代获得的。
3.根据权利要求1所述的病毒株VR18，其特征在于其选自生物材料保藏编号分别为 CGMCC No. 4851，CGMCC No. 4852，CGMCC No. 4853 和 CGMCC No. 4854 的病毒株的组。
4.一种CA16病毒感染动物模型的制备方法，其特征在于所述制备方法的步骤包括使用权利要求1-3任一项所述的CA16病毒株感染乳鼠。
5.根据权利要求4中所述的方法，其特征在于所述的乳鼠是ICR乳鼠。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于乳鼠的日龄是1-7日。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述感染的方式是颅内、腹腔或口服方式感染，感染的剂量是1 OOLD5tl-IOOOLD5tl。
8.权利要求1-3任一项所述的病毒株在制备CA16病毒感染动物模型中的用途。
9.一种用于建立CA16病毒感染动物模型的试剂盒，其特征在于包含权利要求1-3任一项所述的CA16病毒株。
10.根据权利要求1-3任一项所述的CA16病毒株在制备建立CA16病毒感染动物模型的试剂盒中的用途
11.使用权利要求4-所述的方法制备的动物模型在CA16病毒感染疫苗开发中的用途
全文摘要
本发明成功筛选了适于建立CA16动物感染模型的病毒株VR18，并利用VR18病毒株感染乳鼠建立了CA16病毒感染的动物模型，同时本发明也涉及建立CA16动物感染模型的方法，所用的试剂盒，以及病毒株VR18在建立CA16动物感染模型中的用途等。本发明为CA16疫苗的研发提供了宝贵的实验资料。
文档编号C12R1/93GK102286432SQ20111016203
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者李凤翔, 梁争论, 毛群颖, 王一平, 王军志, 貌盼勇 申请人:中国食品药品检定研究院