专利名称：一种辣椒疫霉菌皱缩坏死蛋白PcCRN1基因克隆及其功能技术的制作方法
技术领域：
本发明属分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种皱缩坏死褪绿基因PcCRNl 的分离、瞬时表达、体外突变及其沉默技术方法。此外，系统证明了该基因通过引起寄主叶片褪绿而参与病菌的致病或破坏作用。
背景技术：
近年来，辣椒疫病发生危害日趋加重，抗病性鉴定及抗病育种工作进展缓慢，病害控制长期依据化防措施，农药对人类和环境污染日趋加重。因此，寻找或界定辣椒疫霉靶标致病因子，研制病害发生危害预警技术，建立病害化学药剂减量防控技术措施，有效的遏止病害发生与危害，一直是分子植物病理学领域研究的技术热点。研究表明植物病原细菌、真菌、卵菌及线虫等与寄主互作过程中，常产生一系列的调控侵染或防卫反应的效应分子，这些效应分子主要包括两类一类是胞质效应蛋白， 如RXLR效应蛋白和皱缩坏死蛋白(Crinkling and Necrosis protein :CRN)，主要通过附着胞或吸器等特殊结构进入植物活细胞；另一类是质外效应蛋白，主要分泌于胞外，并与胞外靶标和质外体表面受体发生作用。目前研究的效应蛋白主要有酶抑制剂(葡聚糖酶抑制蛋白GIPl和GIP2、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白EPIl和EPI10、半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白 EPICl 和 EPIC2)、激发子 INFl、PcF、NPP (necrosis-inducing protein)、转谷氨酰胺酶、 CBEL(Cellulose Binding, Elicitor and Lectin-like)、RXLR 蛋白家族(ATR、Avr3a 等) 和CRN蛋白家族等。Torto等人(2003年)首次于马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)胞外蛋白cDNA数据库中发现了皱缩坏死蛋白基因(CRN)，其在农杆菌介导的瞬时表达体系中导致本氏烟产生皱缩坏死症状。CRN是一类新的效应分子，目前该类基因仅发现于疫霉属病菌基因组中，相关研究信息很少。CRN基因由若干基因成员组成，致病疫霉(P. parasitica)中含196个CRN-like 序列，大豆疫霉(P. sojae)中含100个CRN-Iike序列，橡胶疫霉菌(P. ramorum)中含19个 CRN-like序列。而且大豆疫霉中的两个CRN基因(PsCRN63和PsCRN115)，氨基酸序列同源性达95. 7%，但功能特性相反，PsCRN63可激发细胞坏死，而PsCRNl 15可抑制NPP基因引起的坏死症状，表明CRN基因成员具功能多样性。2010年，Schornack和van Damme研究证明，CRN基因序列N-端保守基序LXLFLAK与RXLR基序功能相似，均可调控效应蛋白进入植物细胞内，但在寄主与病原菌互作过程中，CRN效应分子致病机理及作用靶标等资料甚少， 至此成为分子植物病理学领域研究的热点。世界范围内，植物病原卵菌易导致多种植物病害，给农业生产造成了严重损失，在此基础上，以重要致病效应因子为研究对象，借助基因和蛋白操作技术，探明关键基因功能特性，创建其研究技术体系，预期研究具重要的理论与实践意义。目前无公开发表过辣椒疫霉皱缩坏死蛋白靶标基因的研究信息。
发明内容
基于上述的原因，本发明提供了 1个克隆自辣椒疫霉的皱缩坏死蛋白基因PcCRNl 及其功能分析技术，特别涉及该蛋白基因的分离、瞬时表达、体外突变及其沉默突变体制备方法，证明了该基因通过引起寄主叶片产生褪绿症状而参与了病菌的致病或破坏作用；借助基因体外突变技术验证了两个保守基序对其功能的影响作用。由此证明了该基因是辣椒疫霉菌皱缩坏死基因簇的一个重要成员，本发明为进一步研制卵菌病害快速诊断与预警技术提供技术储备。本发明提供的辣椒疫霉的皱缩坏死蛋白基因PcCRNl基因，其基因序列如Seq ID No :1所示；其蛋白质氨基酸序列为Seq ID NO :2所示。该基因编码的农杆菌瞬时表达蛋白仅导致寄主叶片产生褪绿症状。该基因开放阅读框含1092个碱基，编码一种含有363个氨基酸的蛋白质，分子量为41. 4kDa,信号肽含有17个氨基酸(为氨基酸序列SEQ ID NO :2中1_17氨基酸)，1个 N-糖基化位点，无内含子。该基因经NCBI-BLAST在线比对，确认其属于皱缩坏死蛋白基因。该基因的具体克隆制备方法为其步骤如下PcCRNl基因克隆具体步骤A 利用参试辣椒疫霉菌株CBS121657 (荷兰菌种保藏中心提供)提取辣椒疫霉总 RNA,反转录成cDNA ；B:通过对已报道的其它卵菌中同类基因序列比对，界定该类基因的保守基序 LQLFLAK和WL，从辣椒疫霉基因组数据库中筛选PcCRN基因，并BLAST比对分析，设计特异引物PcCRNl-F1，其序列如Seq ID No 5所示和PcCRNl-R，其序列如Seq ID No 6所示，从 cDNA中分离目的基因PcCRNl，阳性克隆测序获得基因全长序列；本发明所述Pcnppl基因在辣椒烟草内瞬时表达的具体步骤A 根据PcCRm基因和表达载体pGR106酶切位点，设计引物，其序列如Seq ID No 11-12所示，构建PcCRNl基因PVX表达载体，将目的基因克隆至表达载体PVX-pGR106中；B 提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，利福平及卡那霉素筛选农杆菌抗性转化子；C:阳性农杆菌转化子利用LB液体培养基(含卡那霉素和利福平各50mg/ml)震荡培养，收集菌体后，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入辣椒、烟草叶片中，进行瞬时表达。本发明所述的PcCRm基因，其保守位点突变后在辣椒本氏烟叶内的瞬时表达的方法，具体步骤如下A 根据PcCRm基因的保守位点设计引物，其序列如Seq ID No :7_10所示，分别突变PcCRNl基因的保守位点LQLFLTK和WL ；B:突变序列经测序验证后，利用引物其基因序列如Seq ID Νο:13_14构建 PVX-pGR106表达载体，提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，利福平及卡那霉素筛选农杆菌抗性转化子；C 筛选的农杆菌转化子用LB液体培养基(含卡那霉素和利福平各50mg/ml)震荡培养，收集菌体后，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入辣椒本氏烟叶片，进行瞬时表达，检测保守位点突变效果。本发明所述的PcCRNl基因，其基因稳定沉默表达载体构建及其沉默菌株制备的方法，具体步骤如下A 根据PcCRNl基因和PHAM34酶切位点，设计特异引物pHCRNl-F，其序列如Seq ID No 15所示和pHCRNl-R，其序列如Seq ID No 16所示，构建PcCRNl基因沉默表达载体，将目的基因克隆至沉默表达载体PHAM34中；B 制备辣椒疫霉菌原生质体，并提取重组表达质粒及标记质粒PHSPNpt，按比例混合后转化辣椒疫霉原生质体，同时以野生型辣椒疫霉菌株及仅转化标记质粒PHSPNpt菌株为对照，筛选抗G418的转化子；C 转化子再培养，诱导产生游动孢子后接种辣椒叶片进行致病性测定；D 分别提取转化子菌株及对照菌株RNA，设计PcCRNl基因特异引物RT_CRN1_F，其序列如Seq ID No :3所示和RT-CRN1-R，其序列如Seq ID No :4所示，并设计辣椒疫霉内参基因actinA特异引物RT_Actin_F，其序列如Seq ID No 17所示和RT_Actin_R，其序列如 Seq ID No 18所示，然后分别借助反转录PCR及荧光定量PCR检测PcCRm基因的沉默效率；E 制备沉默转化子游动孢子悬浮液，接种辣椒叶片，与对照组，包括野生型辣椒疫霉菌株，选自菌株CBS121657 (荷兰菌种保藏中心提供)及转化标记质粒PHSPN菌株相比较，检测致病性变化。本发明所用的载体和宿住菌均为常见，pUC19为PcCRNl基因宿主载体，DH5 α为宿主细胞，PVX(pGR106)为PcCRNl基因表达载体，农杆菌GV3101为该基因的表达宿主菌， PHAM34为沉默表达载体，PHSPNpt为沉默表达的标记质粒。综上所述，本发明提供了 1个克隆自辣椒疫霉的皱缩坏死蛋白基因PcCRNl及其功能分析技术，特别涉及该蛋白基因的分离、瞬时表达、体外突变及其沉默突变体制备方法， 证明了该基因通过引起寄主叶片产生褪绿症状而参与了病菌的致病或破坏作用；借助基因体外突变技术验证了两个保守基序对其功能的影响作用。由此证明了该基因是辣椒疫霉菌皱缩坏死基因簇的一个重要成员，本发明为进一步研制卵菌病害快速诊断与预警技术提供技术储备。
图1. PcCRNl基因重组表达载体示意图；图中Kana为卡那抗性，Sal I、Not I、SmaI和ClaI为酶切位点，PcCRNl为目的基因。图2. PcCRNl基因烟草中瞬时表达结果灰度示意图；图中A =PcCRNl基因农杆菌转化子接种烟草7天后产生褪绿症状(灰度图中叶片中间发白部分)；B 空载体pGR106接种7天后无任何症状；图3. PcCRNl基因辣椒叶片内瞬时表达结果灰度示意图；图中A =PcCRNl基因农杆菌转化子接种辣椒叶片7天后产生明显症状(灰度图中叶片中间发白部分)；B 空载体pGR106接种7天后无任何症状；
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图4. PcCRNl基因保守位点突变基因在烟草叶片内的瞬时表达结果灰度示意图；图中A =PcCRNl野生型基因；B =PcCRNl突变LQLFLTK位点基因；C =PcCRNl突变 WL位点基因；D =PVX空载体，均显示接种7天后症状，野生型基因比突变位点基因症状明显 (灰度图中叶片发白部分)；图5. PcCRNl基因稳定沉默RT-PCR检测电泳结果示意图；图中显示PcCRNl基因在沉默转化子中转录水平M =DNA标准分子量；WT 野生型辣椒疫霉菌株；CK 转标记质粒转化子；9 =PcCRNl基因沉默转化子PcCRNl-9 ；14 =PcCRNl基因沉默转化子PcCRNl-14 ；选择辣椒疫霉持家基因actinA为内参，actinA基因表达水平在所有参试菌株中一致；PcCRNl基因在野生型菌株和对照菌株中均呈现很高的表达量，而在沉默菌株中其表达量几乎检测不到；图6. PcCRNl基因稳定沉默荧光定量PCR检测结果示意图；WT 野生型辣椒疫霉菌株；CK 转标记质粒转化子；PcCRNl-9和PcCRNl_14 目的基因沉默转化子；PcCRNl基因在沉默菌株中表达量很低，表达量减少了 72%和77%，已成功沉默；图7. PcCRNl基因沉默转化子致病性测定结果灰度示意图；图中显示游动孢子接种法检测PcCRNl基因沉默转化子致病性结果A 野生型辣椒疫霉菌株游动孢子接种2天后症状；B 含标记质粒的辣椒疫霉转化子游动孢子接种 2天后症状；C 沉默转化子PcCRNl-9游动孢子接种辣椒叶片2天后症状；D 沉默转化子 PcCRNl-14游动孢子接种辣椒叶片2天后症状，E 双蒸水处理叶片，野生型和对照菌株处理辣椒叶片均能使叶片产生水浸状坏死病斑，而沉默菌株产生的症状减弱，说明PcCRNl基因沉默降低了辣椒疫霉对辣椒叶片的破坏作用，因此该基因属辣椒疫霉的一个重要致病基因。
具体实施例方式本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册 (New York :Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J 等(Blackwell 禾斗学出版社，1988)所述的操作技术规程，或按制造厂商的建议实验条件。实施例1 (基因分离及克隆)选取辣椒疫霉菌株CBS121657为参试材料，根据辣椒疫霉基因组中一个CRN基因 (命名=PcCRNl) (jgi/phycaf7/98651)序列设计特异引物 PcCRNl-F1 (其序列如 Seq ID No 5所示)和PcCRNl-R(其序列如Seq ID No :6所示)，利用PCR方法扩增筛选目的基因。1、辣椒疫霉总RNA提取(1)辣椒疫霉菌株CBS121657在液体燕麦培养基中于28°C培养3天后，取0. Ig菌丝经液氮研磨，移入Iml Trizol溶液室温静置5min ；(2)加入0. 2mL氯仿，充分混合混勻，4°C下12000rpm/min离心15min，吸取上清，
重复一至多次；(3)吸取上清，每Iml Trizol加入0. 25倍异丙醇和0. 25倍RNA沉淀剂，充分混勻，室温放置 10min，4°C下 12000rpm/min 离心 IOmin ；(4)收集RNA沉淀，用75%乙醇洗涤2次，重复离心；
(5)吸尽残存乙醇，或使残余乙醇充分挥发；(6)力卩50-100 μ 1 DEPC处理水，将RNA溶液贮存于_70°C保存备用。2、反转录合成cDNA第一链(1)取 1-2 μ g 总 RNA,加入 ddH20 至 9. 5 μ L，75°C变性 5min，冰浴 5min，稍微离心；(2)力口 IOX扩增缓冲液2 μ L ；(3)力口 IOmmol/L dNTP 混合液 2 μ L ；(4)力口 25mmol/LMgCl2 4 μ L ；(5)加引物 Oligo-dT luL；(6)力口 RNA 酶抑制剂 0. 5 μ L ；(7)加反转录酶 M-MLV lyL；(8)反应液混勻后，置室温lOmin，42°C温浴60min，85°C水浴放置IOmin ；(9)加入180 μ L ddH20混勻，稍微离心，_20°C下保存，阴性对照3个分别是①加入第一链cDNA反应所需的所有试剂，不加模板RNA ；②加除反转录酶外的所有试剂；③加除引物外的所有试剂。3、PCR扩增获得PcCRNl基因全长利用全长扩增引物PcCRNl-F1 (其序列如Seq ID No 5所示)和PcCRNl-R(其序列如Seq ID No 6所示)从cDNA中扩增PcCRNl基因反应体系为ddH20(32. 5 μ L)，10 Xbuffer (5 μ L)，MgCL2 (4 μ L)，dNTP (4 μ L)，上下游引物各 1 μ L, DNA (2 μ L)，TaqE (0. 5 μ L)。PCR 反应程序为95°C 4min ；94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，共 35 个循环；最后 72°C延伸 IOmin0取10 μ L反应产物电泳检测并回收。将回收产物连接PEASYTtm-T3载体，连接体系为回收产物(4 μ DpEASYtm-T3 VectOr(0.4l·! 1)，25°C静置15min，放冰上终止反应。转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，转化步骤为(1)取大肠杆菌感受态细胞DH5 α于冰上放置融化，融化后吸取50 μ 1感受态缓缓地加入到连接产物中，冰上放置30min ；(2)将混合物小心地放入42°C水浴锅中热激90s，快速冰上放置2min ；(3)加入400 μ 1不含抗性的LB培养基，200rpm, 37°C震荡培养Ih以上；(4)涂到含有Amp和IPTG的LB平板上，37°C倒置，过夜培养，筛选阳性克隆，送样测序，获得PcCRm基因全长。实施列2 (辣椒疫霉菌皱缩坏死蛋白基因PcCRNl在辣椒、烟草叶片瞬时表达)1、PVX表达载体构建(1)设计引物结合表达载体pGR106和PcCRNl基因酶切位点设计引物(其序列如Seq ID No 11-14所示)，构建PVX表达载体。保证目的基因片断以一个方向插入质粒中，在PcCRNl的 5’和3’端分别设计酶切位点。(2)构建PVX表达载体用带酶切位点的引物扩增基因，采用高保真酶进行扩增，PCR反应体系为质粒 (2 μ 1) ,5 XPrime STAR Buffer (含 MgCl2) (10 μ 1) ,dNTP mixture (2. 5mM) (4 μ 1)、上游引物(Ιμ )、下游引物(1 μ 1) > Prime STAR DNA Polymerse (0· 5 μ 1)、ddH20 (31. 5 μ 1) ；PCR 反应程序为95°C预变性5min，然后94°C变性lmin，72°C 30s反应30个循环，最后72°C完全延IOmin ；PCR扩增产物，用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，收集正确的条带，进行胶纯化回收后待用。(3)双酶切、连接、转化将胶回收产物和空载体质粒用相同的酶进行双酶切，双酶切体系为质粒/回收产物(20μ 1)、酶 Ι(2μ 1)、酶 ΙΙ(2μ l)U0XBuffer(4y 1), ddH20(12y 1),体系混勻后37°C反应3-5h后进行纯化回收。将目的基因回收产物和载体回收产物经T4连接酶于16°C下连接，连接体系为目的基因双酶切产物(3 μ 1)、载体双酶切产物(1μ 1)、 T4Buffer (2 μ 1)、T4DNA ligase (1 μ 1)、ddH20 (2 μ 1)，体系混勻后 16°C过夜反应。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，步骤同前。阳性克隆筛选验证后，送测序公司测序。2、农杆菌转化2. 1重组质粒的提取(1)将含有质粒的大肠杆菌接种于含有适量抗生素的LB培养基中，37 °C， 220-250rpm震荡培养至对数生长期；(2)取ImL菌液至1. 5mL的离心管中，8000rpm,离心Imin ；(3)去上清，收集菌体；(4)加入200 μ L预冷的溶液I，震荡悬浮菌体；(5)加入400 μ L新鲜配制的溶液II，颠倒混勻，12000rpm离心5min ；(6)加入300 μ L预冷的溶液III，颠倒混勻，置冰上5min，12000rpm,离心5min，上清转入另一只离心管中；(7)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，震荡混勻，12000rpm离心5min ；(8)上层水相转入另一只离心管中，加入等体积的异丙醇，混勻后室温放置 IOmin, 12000rpm 离心 IOmin,去上清；(9)沉淀用70 %乙醇洗2次，倒置干燥；(10)用30 μ L TE (含20 μ g的RNA酶)溶解沉淀，取5 μ L电泳检测，其余_20°C保存。2. 2冻融法转化农杆菌(1)倒含抗生素(rif)的平板，挑取少量农杆菌GV3101划线，28°C培养48h ；(2)挑取农杆菌单菌落接种于5ml LB液体培养基(含rif)中，28°C、200rpm/mim 培养过夜；(3)取2ml培养物于IOOml的LB液体培养基(含rif)中继续培养，直至OD6tltl为 0. 5左右；(4)将培养物冰浴 3Omin, 4°C、5000r/min、离心 5min，弃上清；(5)用 20ml 冷的 0. 2M CaCl2 轻轻悬浮菌液，冰上放置 20min，4°C、5000r/min，离心5min，弃去上清液；(6)用2ml预冷的0. 2M CaCl2悬浮，备用；(7)取重组质粒在冰上融化，在10 μ 1质粒中加入100 μ 1农杆菌感受态，冰上放置 30min ；
(8)液氮冻融 lmin，37°C水浴 5min ；(9)加入500μ1不加抗生素的LB液体培养基，28°C，150-160r/min，震荡培养 3-5h ；(10)将摇好的菌液涂在含有抗生素(rif，KaNa)的平板上，吹干后于28°C培养；(11)当平板上长出有点黄白色的菌落时，挑单克隆于5ml含抗生素(rif，KaNa)的 LB培养基中培养；(12)菌液有点黄白色时收集起来提质粒，PCR和酶切验证，验证后备用。3、农杆菌接种(1)接种前3d，用含抗生素(rif，KaNa)的LB培养基诱导带有重组质粒的农杆菌，28°C培养48h，再用诱导培养基(90mM磷酸缓冲液PH = 7.0，90mM硫酸铵，1.5mM柠檬酸钾，ImM硫酸镁，0. 2%葡萄糖，0. 5%甘油)诱导之前需要加0. IM氯化钙，IOmM MES, 200 μ M AS，25ppm KaNa, 12. 5ppm rif，将菌液稀释 50 倍，然后 28°C诱导 24h，8000rpm/min，4°C离心 15min。再用 MMA(10mM MES PH = 5. 6，IOmM MgCl2, 200 μ M AS)培养至 OD600 = 0. 5-0. 6。(2)挑选生长24d左右的健康辣椒叶片和健康烟草叶片进行接种。用Iml的注射器(去除针头)，从叶片背面将菌液渗透。每天进行症状观察，其结果如图2和图3所示。实施列3 (PcCRNl基因保守位点突变后在本氏烟内瞬时表达)1、保守位点的突变根据文献中报道的CRN基因保守序列LQLFLTK和WL，利用引物(其序列如Seq ID No :7_8所示)突变LQLFLTK，利用引物(其序列如Seq ID No :9_10所示)突变WL序列，分别将保守位点突变。2、PVX表达载体的构建(1)设计引物并构建表达载体设计带酶切位点的引物并扩增基因，采用高保真酶进行扩增，PCR反应体系为质粒(2 μ 1) ,5 XPrime STAR Buffer (含 MgCl2) (10 μ 1)、dNTP mixture (2. 5mM) (4μ 1)、上游引物(1 μ 1)、下游引物(1 μ 1) ,Prime STAR DNA Polymerse (0. 5 μ 1) ^ddH2O (31. 5 μ 1)； PCR反应程序为95°C预变性5min，然后94°C变性lmin，72°C 30s反应30个循环，最后72°C 完全延IOmin ；PCR扩增产物，用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，收集正确的条带，进行胶纯化回收后待用。(3)双酶切、连接、转化将胶回收后的产物和空载体质粒用相同的酶同时进行双酶切，双酶切体系为质粒 / 回收产物(20μ 1)、酶 Ι(2μ 1)、酶 II (2 μ 1)、10 X Buffer (4 μ 1)、ddH20 (12 μ 1)，体系混勻后37。C反应3-5h后进行纯化回收。将目的基因回收的产物和载体回收的产物经T4 连接酶16°C连接，连接体系为目的基因双酶切产物(3 μ 1)、载体双酶切产物(1μ 1)、T4 Buffer (2 μ 1)、T4 DNA ligase (1 μ 1)、ddH20 (2 μ 1)，体系混勻后 16°C过夜反应。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，步骤同前。阳性克隆筛选验证后，送测序公司测序。3、农杆菌转化3.1重组质粒的提取(1)将含有质粒的大肠杆菌接种于含有适量抗生素的LB培养基中，37 °C， 220-250rpm震荡培养至对数生长期；
(2)取ImL菌液至1. 5mL的离心管中，8000rpm，离心Imin ；(3)去上清，收集菌体；(4)加入200 μ L预冷的溶液I，震荡悬浮菌体；(5)加入400 μ L新鲜配制的溶液II，颠倒混勻，12000rpm离心5min ；(6)加入300 μ L预冷的溶液III，颠倒混勻，置冰上5min，12000rpm,离心5min，上
清转入另一只离心管中；(7)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，震荡混勻，12000rpm离心5min ；(8)上层水相转入另一只离心管中，加入等体积的异丙醇，混勻后室温放置 IOmin, 12000rpm 离心 IOmin,去上清；(9)沉淀用70 %乙醇洗2次，倒置干燥；(10)用30 μ L TE (含20 μ g的RNA酶)溶解沉淀，取5 μ L电泳检测，其余_20°C保存。3. 2冻融法转化农杆菌(1)倒含抗生素(rif)的平板，挑取少量农杆菌GV3101划线，28°C培养48h ；(2)挑取农杆菌单菌落接种于5ml LB液体培养基(含rif)中，28°C、200rpm/mim 培养过夜；(3)取2ml培养物于IOOml的LB液体培养基(含rif)中继续培养，直至OD6tltl为 0. 5左右；(4)将培养物冰浴 30min，4°C、5000r/min、离心 5min，弃上清；(5)用 20ml 冷的 0. 2M CaCl2 轻轻悬浮菌液，冰上放置 20min，4°C、5000r/min，离心5min，弃去上清液；(6)用2ml预冷的0. 2M CaCl2悬浮，备用；(7)取重组质粒在冰上融化，在10 μ 1质粒中加入100 μ 1农杆菌感受态，冰上放置 30min ；(8)液氮冻融 lmin，37°C水浴 5min ；(9)加入500μ1不加抗生素的LB液体培养基，28°C，150-160r/min，震荡培养 3-5h ；(10)将摇好的菌液涂在含有抗生素(rif，KaNa)的平板上，吹干后于28°C培养；(11)当平板上长出有点黄白色的菌落时，挑单克隆于5ml含抗生素(rif，KaNa)的 LB培养基中培养；(12)菌液有点黄白色时收集起来提质粒，PCR和酶切验证，验证后备用。4、农杆菌接种(1)接种前3d，用含抗生素(rif，KaNa)的LB培养基诱导带有重组质粒的农杆菌，28°C培养48h，再用诱导培养基(90mM磷酸缓冲液PH = 7.0，90mM硫酸铵，1.5mM柠檬酸钾，ImM硫酸镁，0. 2%葡萄糖，0. 5%甘油)诱导之前需要加0. IM氯化钙，IOmM MES, 200 μ M AS，25ppm KaNa, 12. 5ppm rif，将菌液稀释 50 倍，然后 28°C诱导 24h，8000rpm/min，4°C离心 15min。再用 MMA(10mM MES PH = 5. 6，IOmM MgCl2, 200uM AS)培养至 0D6。。= 0. 5-0. 6。(2)挑选生长24d左右的烟草植株进行接种。用Iml的注射器(去除针头)，从叶片背面将菌液渗透。每天进行症状观察，其结果如图4所示。
实施列4(辣椒疫霉皱缩坏死蛋白基因PcCRNl沉默突变体获得及致病性鉴定)1、PcCRNl基因沉默表达载体的构建(1)设计引物结合表达载体PHAM34和PcCRm基因的酶切位点设计引物(其序列如kq ID No 15-16所示)，构建表达载体。(2)构建表达载体用带酶切位点引物扩增基因，采用高保真酶进行扩增，PCR反应体系为质粒 (2 μ 1) ,5 XPrime STAR Buffer (含 MgCl2) (10 μ l)、dNTP mixture (2. 5mM) (4 μ 1)、上游引物(Ιμ )、下游引物(1 μ 1) > Prime STAR DNA Polymerse (0· 5 μ 1)、ddH20 (31. 5 μ 1) ；PCR 反应程序为95°C预变性5min，然后94°C变性lmin，72°C 30s反应30个循环，最后72°C完全延IOmin ；PCR扩增产物，用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，收集正确的条带，进行胶纯化回收后待用。(3)双酶切、连接、转化将胶回收产物和空载体质粒用相同的酶同时双酶切，双酶切体系为质粒/回收产物(20μ 1)、酶 Κ2μ 1)、酶 Κ2μ l)、10XBuffeH4y l)、ddH20(12y 1，体系混勻后 37 °C 反应3- 后进行纯化回收。将目的基因回收的产物和载体回收的产物经T4连接酶16°C连接，连接体系为目的基因双酶切产物(3 μ 1)、载体双酶切产物(1 μ 1)、T4 Buffer (2 μ 1), T4 DNA ligase (1 μ 1)、(！dH2(K2 μ 1)，体系混勻后，16°C过夜反应。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5ci，步骤同前。阳性克隆筛选验证后，送测序公司测序。2、质粒提取分别提取重组质粒PHAMM/PcCRNl及沉默标记质粒PHSPNpt，步骤如下(1)将含有质粒的大肠杆菌接种于含有适量抗生素的LB培养基中，37 °C， 220-250rpm震荡培养至对数生长期；(2)取ImL菌液至1. 5mL的离心管中，8000rpm，离心Imin ；(3)去上清，收集菌体；(4)加入200 μ L预冷的溶液I，震荡悬浮菌体；(5)加入400 μ L新鲜配制的溶液II，颠倒混勻，12000rpm离心5min ；(6)加入300 μ L预冷的溶液III，颠倒混勻，置冰上5min，12000rpm,离心5min，上清转入另一只离心管中；(7)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，震荡混勻，12000rpm离心5min ；(8)上层水相转入另一只离心管中，加入等体积的异丙醇，混勻后室温放置 IOmin, 12000rpm 离心 IOmin,去上清；(9)沉淀用70 %乙醇洗2次，倒置干燥；(10)用30 μ L TE (含20 μ g的RNA酶)溶解沉淀，取5 μ L电泳检测，其余_20°C保存。3、PEG介导的原生质体转化3.1辣椒疫霉活化培养(1)在NPB培养基上活化辣椒疫霉菌株CBS121657，在25°C下黑暗培养；(2)培养3-4天后，将其切成Icm2的菌丝块向每个装有50mL NPB培养基的250ml锥形瓶中放入6-10块，在25°C下黑暗培养2天。3. 2辣椒疫霉原生质体转化步骤(1)实验前配制40%聚乙二醇-4000溶液，完全溶解后，用细菌过滤器除菌后置冰上；(2)用灭菌的200ml烧杯(带纱布)收集菌丝，并用镊子将菌丝放入含有0. 8M Mannitol的培养皿中漂洗一次，然后将漂洗过后的菌丝移入盛有0. 8M Mannitol的离心管中室温下摇洗IOmin ；(3)配制20ml酶解液，在灭菌烧杯中溶解后备用；(4)通常在酶解50min时，最好不要超过60min，用事先包扎好两层mira-cloth的 50ml烧杯来过滤菌丝收集原生质体，然后将收集好的原生质体倒入50mli^lcOn离心管中， 40C 1500rpm 离心 3min ；(5)弃上清，先加IOml左右的W5 solution轻轻重悬原生质体，再加W5 solution 至 35ml,40C 1500rpm 离心 4min ；(6)弃去上清液，先加5ml左右的W5 solution轻轻重悬原生质体，将原生质体的浓度调至2 X 106/ml，然后在冰上放置30min，在4°C 1500rpm离心^iin ；(7)弃上清，加入与第七步W5 solution相同体积的MMg solution重悬原生质体， 室温放置IOmin ；(8)取若干支新的50ml Falcon离心管置于冰上，在管壁上作好记录，然后向管底部加入1体积(约5 μ 1)的pHSPN质粒+3体积(10-25 μ 1)的转化质粒，(9)向每个加好质粒的50ml Falcon离心管中加入Iml原生质体，冰置5_10min ；(10)向每个离心管加三次580 μ 1的PEG溶液，共1. 74mlPEG，在加的过程中轻轻转动离心管，使得PEG能顺着管壁流进质粒与原生质体的混合液中，加完三次后轻轻地击管使混勻，在冰上放置20min ；(11)灭菌培养皿中加入10ml Pea/0. 5M Mannitol培养液，再加20 μ 1的Amp C
液，并在培养皿上作好记录；(12)向每个离心管中加2ml Pea/0. 5M Mannitol培养液，并且缓慢颠倒一次，冰上放置2min ；(13)再向每个离心管中加8ml Pea/0. 5M Mannitol培养液，并且缓慢颠倒一次，冰上放置2min ；(14)将离心管中液体倒入事先加好10ml Pea/0. 5M Mannitol培养液的培养皿中， 在25°C下静置培养，过夜再生，并将离心管保存好明日再用；(15)从过夜生长的培养皿中取5μ1在显微镜下镜检再生的情况，将培养皿中所有的液体吸到前日对应的离心管中，2000rpm离心5min ；(16)弃去上清使管内液体剩5ml左右，将其悬浮，然后加15ml含有30yg/ml G418 的PM培养基，混勻后倒入培养皿中，吹干水汽，在25°C培养；(17)两天后，通常在培养基表面上可以看到有菌丝长出，待大部分新生菌丝长出后，用含30μ g/ml G418的PM培养基覆盖，25°C下继续培养；(18)约过两三天后可以看到有菌丝从覆盖过PM培养基上再次长出，便直接用含 50 μ g/ml G418的PM培养基再次覆盖，在25°C下继续培养；
(19)将重新从覆盖的培养基里面长出小菌落挑到含50 μ g/ml G418的V8培养基上继续培养并且筛选；(20)将最终确定为转化子菌株用于后面实验。3. 3RT-PCR 检测液体培养转化子的菌丝，提取菌丝RNA并反转录，通过普通PCR检测，以actinA基因作为内参基因(其序列如^^ ID No :17-18所示)，以野生型菌株及转化标记质粒菌株为对照。PCR 反应采用体系 % :ddH20 (32. 5 μ L), 10 X buffer (5 μ L), MgCL2 (4 μ L), dNTPGyL)，上下游引物各IyL, DNA(2 μ L), TaqE (0. 5 μ L) 0反应条件为94°C预变性 5min,然后进行以下循环；94°C变性lmin，55°C退火30s，72°C延伸30s，共进行30个循环， 最后72°C总延伸lOmin. PCR产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳分析。3. 4荧光定量PCR检测普通PCR检测后，挑选带比较弱或无带的转化子进行荧光定量PCR检测；以辣椒疫霉actinA基因为内参(序列如kq ID No :21和kq ID No :22)，以野生型菌株及转化标记质粒菌株为对照，反应体系为2. 5XrealMasterMix及20XSTOR solution混合物 11. 25 μ L,上下游引物各 1 μ L, cDNA 模板 2 μ L, ddH20 11. 75 μ L。利用Bio-Radi Cycler进行反应，反应条件95°C预变性2min，然后进行以下循环；94°C变性15s，55°C退火15s，68°C延伸30s，共进行45个循环，最后65-95°C制备溶解曲线。选择actinA为内参基因，每个样品做三个重复，用2_ΔΔ"法对样本基因进行表达差异相对定量分析。计算方法为Δ ACt = (Ct
target
~CT actinA)待测样本— (Ct
target
~CT actinA)校准样本，
果如图6所示。3. 5致病性检测制备PcCRNl沉默转化子游动孢子悬浮液(1)将沉默转化子菌株转移至10% V8培养基培养4d，从菌落边缘挑取菌丝块移至新鲜10% V8培养基继续培养4d备用。(2)切取菌落边缘菌丝块2块，放于新鲜的10%的V8固体平板上，25°C黑暗培养 3-4d ；(3)在菌落边缘切取2X2mm的菌丝块，取10-20块放于灭菌的培养皿中，加入 10%的V8液体培养基，25°C黑暗放置2-3d，可见丝发状菌丝丛；(4)加灭菌水(以浸没菌丝为宜)，每隔1 换水至游动孢子产生，并调节游动孢子浓度至1 X IO5个/ml，利用游动孢子悬浮液进行致病性分析。然后按照如下步骤接种辣椒叶片进行致病性测定辣椒选用自交系品种(5-6叶期)叶片，游动孢子浓度调至IX IO5个/ml。将选取叶片消毒70%乙醇处理30s，0. 升汞处理7min，于灭菌水中冲洗3次，晾干备用，晾干后将叶片平铺于预准备水琼脂平板，每个平板放置3片，每个叶片接种2 μ 1游动孢子悬浮液， 每个样品接10个叶片，野生型辣椒疫霉菌、标记质粒的转化子游动孢子悬浮液及无菌水作对照，每个实验重复3次，每天观察记载症状变化，拍照记录，其结果如图7所示。
1权利要求
1.辣椒疫霉菌皱缩坏死蛋白基因PcCRNl，其特征在于其基因序列如SeqID No:l所示；其氨基酸序列为SEQ ID NO :2所示，该基因编码的农杆菌瞬时表达蛋白仅导致寄主叶片产生褪绿症状。
2.一种辣椒疫霉菌皱缩坏死蛋白基因PcCRNl基因分离克隆及其在辣椒烟草内瞬时表达的方法，其特征在于其步骤如下DPcCRNI基因克隆具体步骤采用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA，通过对已报道的其它卵菌中同类基因序列比对，界定该类基因的保守基序LQLFLAK和WL，从辣椒疫霉基因组数据库中筛选PcCRN基因，并BLAST比对分析，设计特异引物PcCRNl-Fl，其序列如Seq ID No 5所示和PcCRNl-R，其序列如Seq ID No :6所示，分离目的基因PcCRNl，阳性克隆测序获得基因全长序列；2)Pcnppl基因在辣椒烟草内瞬时表达的具体步骤A 根据PcCRNl基因和表达载体pGR106酶切位点，设计引物，其序列如Seq ID No: 11-12所示，构建PcCRNl基因PVX表达载体，将目的基因克隆至表达载体PVX-pGR106中； B 提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，利福平及卡那霉素筛选农杆菌抗性转化子；C 阳性农杆菌转化子利用LB液体培养基，其中含卡那霉素和利福平各50mg/ml，震荡培养，收集菌体后，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入辣椒、烟草叶片中，进行瞬时表达。
3.如权利要求1所述的PcCRm基因，其保守位点突变后在辣椒本氏烟叶内的瞬时表达的方法，其特征在于具体步骤如下A 根据PcCRNl基因的保守位点设计引物，其序列如Seq ID No :7_10所示，分别突变 PcCRNl基因的保守位点LQLFLTK和WL ；B 突变序列经测序验证后，利用引物其基因序列如Seq ID No 13-14构建PVX_pGR106 表达载体，提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，利福平及卡那霉素筛选农杆菌抗性转化子；C 筛选的农杆菌转化子用LB液体培养基其中含卡那霉素和利福平各50mg/ml，震荡培养，收集菌体后，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入辣椒本氏烟叶片，进行瞬时表达，检测保守位点突变效果。
4.如权利要求1所述的PcCRNl基因，其基因稳定沉默表达载体构建及其沉默菌株制备的方法，其特征在于具体步骤如下A 根据PcCRNl基因和PHAM34酶切位点，设计特异引物pHCRNl_F，其序列如SeqID No 15所示和pHCRNl-R，其序列如SeqID No 16所示，构建PcCRNl基因沉默表达载体，将目的基因克隆至沉默表达载体PHAM34中；B 制备辣椒疫霉菌原生质体，并提取重组表达质粒及标记质粒PHSPNpt，按比例混合后转化辣椒疫霉原生质体，同时以野生型辣椒疫霉菌株及仅转化标记质粒PHSPNpt菌株为对照，筛选抗G418的转化子；C 转化子再培养，诱导产生游动孢子后接种辣椒叶片进行致病性测定； D 分别提取转化子菌株及对照菌株RNA，设计PcCRNl基因特异引物RT-CRN1-F，其序列如Seq ID No :3所示和RT-CRN1-R，其序列如Seq ID No :4所示，并设计辣椒疫霉内参基因 actinA特异引物RT_Actin_F，其序列如Seq ID No 17所示和RT_Actin_R，其序列如SeqID No 18所示，然后分别借助反转录PCR及荧光定量PCR检测PcCRNl基因的沉默效率；E 制备沉默转化子游动孢子悬浮液，接种辣椒叶片，与对照组，包括野生型辣椒疫霉菌株及转化标记质粒PHSPN菌株相比较，检测致病性变化。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，特别提供了克隆自辣椒疫霉菌的1个皱缩坏死蛋白基因PcCRN1与致病相关的研究技术，该基因表现出功能特异性，仅引起寄主叶片产生退绿症状。依据农杆菌瞬时表达及沉默技术，证明了该基因通过引起寄主叶片产生退绿症状而对寄主产生致病或破坏作用，并利用体外突变技术证明了该基因编码的1个保守基序与其功能特性有关。因此，该技术发明提供了辣椒疫霉一个对寄主有破坏作用的新基因及其研究技术，该技术发明为研制卵菌病害快速诊断与预警技术提供技术储备。
文档编号C12N1/15GK102286493SQ201110162600
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者张修国 申请人:山东农业大学