专利名称：牛型结核菌素标准物质及其制备方法
技术领域：
本发明涉及牛型结核菌素标准物质及其制备方法，属于标准物质技术和兽用生物
制品技术领域。
背景技术：
牛结核病是由牛分枝杆菌引起的对动物和人的一种慢性细菌性疾病，该病呈世界性分布，也是我国牛的主要传染病，能够传播给人类，使人患结核病，对人类的健康威胁较大。由于我国对牛结核病阳性牛实行淘汰制度，牛结核诊断技术尤为重要，牛结核菌素诊断技术是世界动物卫生组织(OIE)推荐的唯一诊断方法。提纯牛型结核菌素产品的效价标定，是用豚鼠的皮肤变态反应方法，用标准品作为对照，通过皮肤反应面积的比对，用统计学方法确定牛结核菌素产品的国际单位(IU)含量。由世界动物卫生组织(OIE)指定的参考实验室提供国际标准品，也称之为基准标准品，各国实验室用国际标准品溯源制备各自国家的国家标准品，用于结核菌素产品的标定。然而，标准品的质量要求高，制备方法和检验或标定方法严格，有关制备程序和标定方法至今未见有关报道。
发明内容
本发明的目的是建立一种利用由我国分离的牛分支杆菌来制备牛型结核菌素标准物质的方法以制备出合格的牛型结核菌素标准物质。 本发明是通过一下技术路线来实现的，即是通过利用由我国分离的牛分支杆菌经
过培养、灭活、过滤、纯化及冻干工艺过程制备牛型结核菌素，并通过对其中的蛋白、核酸及
多糖含量的测定及结合豚鼠和牛的皮肤敏感试验测定而制备出牛型结核菌素标准物质。 本发明的详细描述 —、牛型结核菌素标准物质的制备 1.培养基 苏通合成培养基(农业部兽用生物制品规程委员会.中华人民共和国兽用生物制品规程，2000年版，化学工业出版社，2000)成分包括如下，天门冬素、柠檬酸、硫酸镁、磷酸氢二钾、柠檬酸铁铵、甘油等，每种成分均为分析纯。
2.菌种本发明所用的牛分枝杆菌C68001和C68002株由中国兽医药品监察所提供。
(1)菌种特性 1)菌种形态在光学显微镜下观察，菌体为细长、直或稍弯的杆菌，长约1. 5 4微米，宽0. 2 0. 6微米，革兰氏阳性，抗酸染色阳性。 2)培养特性在配氏(Petragnani)固体培养基培养20天以上，生长的单个菌落为淡黄色颗粒状，较为干燥。在苏通培养基中生长良好，培养20天培养基表层应出现较丰富的菌膜，液体应清亮，生长纯粹，培养时间视生长情况一般2 3个月。
3)毒力对家兔耳静脉注射活菌6 10mg，可致死家兔。
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(2)生产用种子制备 1) —级种子制备将冻干菌种开封后，接种小川培养基(见附录1)置37t:温室中培养约两周左右，发育生长呈黄色颗粒状菌落或菌苔，为一级种子。 2) 二级种子制备用铂金铲钩取一级种子菌苔或菌落，均匀涂布于数支小川培养基斜面上，置37t:温室中培养IO天左右，用铂金铲从小川培养基斜面上钩取菌苔，在苏通合成培养基(见附录2)试管内壁充分研细，然后倾斜试管，用培养基轻轻接触菌体，使其浮在培养基液面上，缓慢移至37t:温室中培养7 15日，则在培养基表面形成薄的菌膜。用铂金环挑出一块菌膜移植到苏通合成培养基瓶中，在37t:温室中培养7 15日，即可在培养瓶液体表面形成具有弹性的菌膜，再菌膜移植到苏通合成培养基瓶中，在37t:温室中培养7 15日，在球瓶液体表面上形成微有皱褶、弹性较强的菌膜，此菌膜即可作为大量生产的种子，经肉眼观察，液体必须清亮，菌膜纯粹、薄白、无杂菌污染作为二级种子。
3.牛型结核菌素的制备 (1)接种挑取菌膜徐徐放入瓶的液面上，持瓶者塞好瓶塞，轻轻放回原处。 接种完毕后，应对已接种的培养基瓶逐瓶进行检查，发现有种子下沉或散开者应
进行再接种。接种结束后，小心移入温室中，轻放于培养架上。 (2)培养于室温下培养2 3个月菌膜应生长较厚，应停止培养。 (3)灭活培养结束，培养物经121°C 30min灭活处理。 (4)混合粗滤首先各取两个菌株对应批号、相同瓶数的培养物混合后用双层纱布加一层铜纱滤过除去菌膜。 (5)细滤在蔡氏滤器(型号2000ml生产厂商北京中北国泰生物技术有限公司)中加入8块滤板(型号甲III，生产商大连源顺过滤器材有限公司)，打开空气压縮机电源使纯化水完全通过滤器后将混合菌液吸入储料罐，再使之完全通过滤器，即为牛型结核菌素滤液。 (6)提纯将1倍体积的40%三氯醋酸溶液(见附录)徐徐加入到9倍体积的结核菌素滤液中，边加边搅拌，混匀后，在2 『C静置14 24h，使蛋白沉淀。然后小心将上清吸出，收集沉淀。用1%三氯醋酸溶液(见附录)将沉淀物重新悬浮混匀，再离心沉淀(4000r/min，2 8°C，30min)去上清，如此重复3次。最后一次离心结束后，弃上清称取湿蛋白净重。 (7)重溶过滤将沉淀物先加少量lmol/L氢氧化钠溶液(见附录)，使之溶解。根据湿蛋白净重和适当的稀释倍数计算出稀释后菌素总体积和需要pH 7.4磷酸盐缓冲液(见附录)的体积。稀释后，调PH到7.4，用灭菌赛氏滤器过滤即为牛型结核菌素标准物质的候选物。4.附录培养基及试剂的配制(1)小川培养基1)成分见表1表l小川培养基的成分新鲜鸡蛋4个2%孔雀石绿水溶液6ml盐溶液100ml
注盐溶液配方、制法 味精(含麸氨酸钠80%) lg 磷酸二氢钾(酸性) lg 甘油 6ml 预冷注射用水 94ml 将以上组分水浴加温溶解后过滤分装，12rC灭菌30分钟，备用。
2)制法 将鲜鸡蛋用肥皂洗刷，用自来水冲洗干净，将洗净鸡蛋浸入75 %酒精中数分钟。用无菌纱布将鸡蛋表面酒精擦干。用无菌镊子除去鸡蛋一端外壳，将此端朝下，并在上端打一小孔，使蛋液流入带有玻璃珠的大口瓶中，摇晃使蛋清蛋黄混合均匀。将盐溶液及2%孔雀石绿6ml倾入蛋液中摇匀，通过两层纱布灭菌漏斗过滤分装试管。将试管在血清凝固器中摆成斜面，85-9(TC灭菌1小时，第二天可重复一次，取出经无检合格即放2-8t:冰箱保存备用。 (2)苏通合成培养基 1)成分见表2 表2苏通合成培养基的成分 天门冬素 4g 柠檬酸 2g 含水硫酸镁 0. 5g 磷酸氢二钾 0. 5g 拧檬酸铁铵 0. 05g 甘油 60ml 预冷注射用水 940ml 2)制法 将配方中的固体成分加入少量预冷注射用水中。徐徐加热，使全部材料溶解。入余水和甘油。用氢氧化钠溶液调整pH至7.0。加热煮沸，滤过后分装。以116t:灭菌40分钟或12rC灭菌30分钟。
(3)三氯醋酸溶液(40%和1% ) 40%三氯醋酸溶液将400g三氯醋酸溶于1000ml预冷注射用水中即可； 1 %三氯醋酸溶液将1份40%三氯醋酸溶液和9份预冷注射用水混合均匀即可。 (4) lmol/L氢氧化钠溶液 将40g氢氧化钠(分析纯)加预冷注射用水至1000ml即可。
(5) lmol/L盐酸溶液将83. 3ml浓盐酸(质量百分浓度36-38%;摩尔浓度约12mol/L)和917. 7ml预
冷注射用水混合均匀即可。 (6) pH7. 4磷酸盐缓冲液 甲液l/30mol/L十二水磷酸氢二钠，取11. 9g十二水磷酸氢二钠溶于1000ml预冷注射用水中即可； 乙液l/30mol/L磷酸二氢钾，取4. 5g磷酸二氢钾溶于1000ml预冷注射用水中即
5可。 将81份甲液和19份乙液混合均匀，调pH至7. 4， 12rC灭菌30分钟。 二、牛型结核菌素(候选物)的鉴定 1.无菌检验 按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)规定方法进行。 2.蛋白含量测定 取少量无菌检验合格的提纯牛型结核菌素半成品，采用凯氏定氮法，具体操作步 骤参见附《牛型提纯结核菌素国家标准品蛋白质含量测定标准操作方法》根据蛋白含量测
定结果， 用pH 7. 4磷酸盐缓冲液(苯酚含量为0. 5% (W/V))将提纯牛型结核菌素半成品 稀释成每lml含1.8mg蛋白质。 3. 纯 度 测 定 (Physicochemical and Biological Studies on Various Preparations ofTuberculin Purified Protein Derivative APPLIED MICROBIOLOGY, March,1965， Copyright 1965 American Society for Microbiology, Vol. 13， No. 2 ;中 华人民共和国药典2005年三部《卡介苗纯蛋白衍生物》)。 [OO72] (1)核酸含量测定 取本品2 3ml，采用紫外-可见分光光度法，于波长260nm处测定吸光度，按 Elcm1%= 200计算核酸含量。 [OO 4] (2)多糖含量测定 以生理盐水溶液稀释无水葡萄糖标准品，制备0 100 g/ml，葡萄糖标准溶液， 将硫酸225ml加入到75ml生理氯化钠溶液中，另称取蒽酮0. 6g，加入到10ml乙醇中，将上 述溶液混合，配置成蒽酮混合液。分别精确量取1. 0ml，不同浓度标准葡萄糖溶液，以及本 品，加入4. 0ml蒽酮混合液，混均，置沸水浴20min后与波长620nm处测定吸光度，计算多糖 (3)判定标准 每lmg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0. lmg。 (4)候选物选择选择蛋白质含量适宜，核酸和多糖总量末超出标准的候选物(每 lmg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于O. lmg)用于定量分装、冷冻真空干燥，用误差《1% 的分装仪器定量分装，按适宜冻干曲线冷冻干燥。
三、牛型结核菌素标准物质的检验 1.均匀性试验取样品15支，用凯氏定氮法测定每支安瓿的结核菌素蛋白质含量， 平均值、标准差、变异系数，标准差和变异系数应《5%。 2.稳定性试验用热加速稳定性试验测定，检查在高温条件下，样品放置的时间。并 以此数据作为依据，为下一批稳定性试验作基础。 [OO82] 3.效价测定(初次) [OO83] (1)预备试验 1)豚鼠致敏选体重400g左右的白色豚鼠10 12只，分别在大腿内侧深部肌肉 注射牛型结核杆菌致敏原(先将牛型结核杆菌培养物刮下、称重、磨碎，加适量生理盐水稀 释，12rC灭活30分钟，再用弗氏不完全佐剂制成油乳剂，使每lml含牛型结核杆菌8 10mg，分装后8(TC水浴灭菌2小时。无菌检验合格后置2 8t:备用)0. 5ml。 2)豚鼠测敏致敏5周后，将每只致敏豚鼠臀部拔去一小块被毛(约3cm2，避开注
射致敏原一侧)，第2日将牛型提纯结核菌素国际标准品或国家标准品稀释成每lml含结核
菌素32. 5IU，于拔毛处皮内注射0. lml，注射后48小时观察，注射部位皮肤红肿面积达lcm2
以上者，方可用于效价测定。 (2)正式测定 将待测样品稀释成每lml含结核菌素蛋白(按lmg相当于32， 500IU计算)25、50、100和200IU的4种不同浓度；将国际标准品(英国国家生物标准检定所，下同)也作同样稀释。挑选8只致敏合格豚鼠，于注射的前一日将胸腹部二侧被毛拔去(约3X9cm2)，采用轮回换点方式在每只豚鼠拔毛处依次注射此8种菌素稀释液，每点皮内注射0. lml，注射后24小时用游标卡尺测量每个注射点皮肤红肿面积，计算待测样品各梯度和国际标准品各稀释度在8只豚鼠身上引起皮肤红肿面积(以24小时判定为主，如有必要42小时可作第二次判定)。(世界动物卫生组织著，农业部兽医局/中国世界动物卫生与流行病学中心译.陆生动物诊断试验和疫苗手册[S]. 2007 :399-410.)
4.安全检验 用生理盐水将提纯牛型结核菌素稀释成每lml 32500IU。用体重350 450g的豚鼠2只，每只腹腔注射结核菌素lml，观察10日。
5.特异性检验
(1)用牛检验 用健康易感牛20头，分为两组，每组10头。 第一组颈左侧皮内注射被检结核菌素，右侧注射国际标准品。 第二组颈左侧皮内注射国际标准品，右侧注射被检结核菌素。 各皮内注射每lml含32500IU的菌素0. lml，注射后72小时判定，个别牛反应不一
致时，可在不同部位即刻作第二次注射。观察被检结核菌素与国际标准品对牛有无非特异
性炎性反应。 (2)用豚鼠检验 用体重350 450g的豚鼠进行特异性检验，其方法与"效价测定(第一次)"基本相同，但菌素不作稀释，每lml含32500IU，皮内注射0. lml。注射后48小时判定，观察有无任何炎性反应。 6.定值(协作标定)国家标准品效价单位的确定一般用各协作单位结果的统计值表示，一般需经几个有经验的实验室协作进行。参加单位应采用统一的设计方案、统一的方法和统一的记录格式，标定结果须经统计学处理(标定结果至少需取得5次独立的有效结果)。 (1)数据统计通过协作标定所测定的数据，采用中华人民共和国兽药典一部(2005年版)，生物检定统计法中的量反应平行线测定法。(中华人民共和国国家计量技术规范JJG1006-94《一级标准物质》国家技术监督局；中华人民共和国兽药典二OO五年版一部) (2)国际单位确定通过协作标定结果数据统计后计算出lmg结核菌素的国际单位含量，以此作为国家标准品的确定值。
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本发明的积极意义 本发明涉及一种牛型结核菌素标准物质及其制备方法。本发明所涉及的牛型结核菌素标准物质是通过利用由我国分离的牛分支杆菌经过培养、灭活、过滤、纯化等工艺过程制备牛型结核菌素，并通过对其中的蛋白、核酸及多糖含量的测定及结合生物学试验测定而制备出牛型结核菌素标准物质。本发明的方法使标准品制备更加科学、严谨、完善，按照标准品制备程序使每一个步骤科学严谨，经过协作标定，数据统计，保证效价定值准确。
实施例1牛型提纯结核菌素国家标准物质的制备
1.培养基 苏通合成培养基(农业部兽用生物制品规程委员会.中华人民共和国兽用生物制品规程，2000年版，化学工业出版社，2000)成分包括如下，天门冬素4g、柠檬酸2g、硫酸镁0. 5g、磷酸氢二钾0. 5g、柠檬酸铁铵0. 05g、甘油60ml，每种成分均为分析纯。加蒸馏水940ml，共制备50000ml。
2.菌种 牛分枝杆菌C68001和C68002株(中国兽医药品监察所提供)。
(1)生产用种子制备[O109] 1) —级种子制备 接种将冻干菌种开封后，接种小川培养基置37t:温室中培养约两周左右，发育生
长呈黄色颗粒状菌落或菌苔，为一级种子。
2) 二级种子制备 用铂金铲钩取一级种子菌苔或菌落，均匀涂布于数支小川培养基斜面上，置37t:温室中培养10天左右，即可发育良好。此培养物用作液体驯化。 为使生长在固体培养基上的结核菌种能在液体培养基中生长繁殖，以适应结核菌素生产的需要，应于生长前期将菌种接种于液体培养基上，进行种子驯化工作。用铂金铲从小川培养基斜面上钩取菌苔，在苏通合成培养基试管内壁充分研细，然后倾斜试管，用培养基轻轻接触菌体，使其浮在培养基液面上，缓慢移至37t:温室中培养7 15日，则在培养基表面形成薄的菌膜。用铂金环挑出一块菌膜移植到苏通合成培养基瓶中，在37t:温室中培养7 15日，即可在培养瓶液体表面形成具有弹性的菌膜，再菌膜移植到苏通合成培养基瓶中，在37t:温室中培养7 15日，在球瓶液体表面上形成微有皱褶、弹性较强的菌膜，此菌膜即可作为大量生产的种子，为二级种子。
3) 二级种子鉴定 肉眼观察，液体必须清亮，菌膜纯粹、薄白、无杂菌污染。对于液体不清亮的培养物弃去。 3.菌素制造 1)接种挑取菌膜徐徐放入瓶的液面上，持瓶者塞好瓶塞，轻轻放回原处。 接种完毕后，应对已接种的培养基瓶逐瓶进行检查，发现有种子下沉或散开者进
行再接种。接种结束后，小心移入温室中，轻放于培养架上。 2)培养培养期间须定期检查温度、湿度和有无杂菌生长。污染者及时高压灭菌弃去。 3)灭活培养2 3个月，菌膜生长较厚，停止培养，培养物置12rC灭活30min。
4)混合粗滤首先用双层纱布加一层铜纱将两个菌株同一批号相同瓶数的培养瓶培养物混合滤过除去菌膜。 5)细滤在滤器中加入8块甲3滤板，打开空气压縮机电源使纯化水完全通过滤器。将混合菌液吸入储料罐，再使之完全通过滤器，即为结核菌素滤液。大约40000ml。
6)提纯将1倍体积的40%三氯醋酸溶液(见附录)徐徐加入到9倍体积的结核菌素滤液中，边加边搅拌，混匀后，在2 『C静置14-24小时，使蛋白沉淀。然后小心将上清吸出，收集沉淀。用1%三氯醋酸溶液(见附录)将沉淀物重新悬浮混匀，再离心沉淀(4000r/min，2 8°C，30min)去上清，如此3次。最后一次离心结束后，弃上清称重，并减去离心管重量得到湿蛋白净重，大约70g左右。 重溶过滤。将沉淀物先加少量(约7ml) lmol/L氢氧化钠溶液(见附录)，使之溶解。根据湿蛋白净重和适当的稀释倍数计算出稀释后菌素总体积和需要PH7.4磷酸盐缓冲液(见附录)的体积。先量取少量pH7.4磷酸盐缓冲液将离心管内菌素浓縮液进行稀释，并用量筒转移至3000ml瓶，再用剩余体积的pH 7. 4磷酸盐缓冲液对离心管和量筒进行2次洗涤并先后转移至3000ml瓶，此即为单批的提纯牛型结核菌素原液。将提纯牛型结核菌素原液进行适当稀释，调pH到7.4，用灭菌赛氏滤器过滤即为候选物。
4候选物检定
(1)无菌检验 按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)附录448页进行。
(2)蛋白含量测定 取少量无菌检验合格的提纯牛型结核菌素半成品，采用凯氏定氮法(《中华人民共和国兽药典》2000年版一部附录44页)测定每lml总氮量，计算蛋白含量。具体操作步骤参见，附《牛型提纯结核菌素国家标准品蛋白质含量测定标准操作方法》根据蛋白含量测定结果，用pH7. 4磷酸盐缓冲液(苯酚含量为0. 5% (W/V))将提纯牛型结核菌素半成品稀释成每lml含58，500IU/1. 8mg。 (3)纯度测定每lmg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0. lmg。
1)核酸含量测定 取本品2 3ml，采用紫外-可见分光光度法，于波长260!1111处测定吸光度，按Elcm1%= 200计算核酸含量，测定结果为0. 002mg/mg蛋白质。
2)多糖含量测定 以生理氯化钠稀释无水葡萄糖标准品，制备0 100ug/ml，葡萄糖标准溶液，将硫酸225ml加入到75ml生理氯化钠溶液中，另称取蒽酮0. 6g，加入到10ml乙醇中，将上述溶液混合，配置成蒽酮混合液。分别精确量取1. Oml，不同浓度标准葡萄糖溶液，以及本品，加入4. Oml蒽酮混合液，混均，置沸水浴20分钟后与波长620nm处测定吸光度，计算多糖含量为O. 072mg/lmg/mg蛋白质。 5.候选物选择选择蛋白质含量适宜，核酸和多糖总量未超出标准的候选物冻干(每lmg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0. lmg)。核酸和多糖含量共计0. 072mg/lmg蛋白质。 6.定量分装、冷冻真空干燥，用误差《1%的分装仪器定量分装，按适宜冻干曲线冷冻干燥。1200ml结核菌素分装1163支安瓿，每支分装量lml，剩余30ml左右。
实施例2牛型提纯结核菌素国家标准物质的成品检验 1.均匀性试验取样品15支，用凯氏定氮法测定每支安瓿结核菌素蛋白质含量结果见表3。 表3牛型提纯结核菌素冻干后均匀性测定结果
样品号氮含量实际蛋白质含量理论蛋白质含量实际蛋白质含量与
ng/ml_ )(mg/mL)ng/mL)理论蛋白质含量的比率
10.15340. 95880-9000106- 527 0%
20.13860. 86630.900096.250 0%
30. 13600. 85000.900096.444 4%
40.14390. 89940.900099.930 6%
50.13930, 87060.900096— 736 1%
6015150. 94690.9000105. 208 3%
0.14130. 88310.900098. 125 0%
80.14450. 90310.9000跳347 2%
90.14980. 93630.9000104. 027 8%
100.13830. 86440.900096.047 1%
110.13530. 84560.900093. 958 3%
120.14820. 926309000102 916 7%
13013700. 85630.■095. 138 9%
140.15410. 96310.■0107.013 9%
150.15340. 95880■0106. 537 8%
0.14430. 90190.9000100. 213 0%
标准乾s000690. 043104, 785 5%
变异系数cv4. 8%4. 8%04. 8% 15支安瓿平均值X为100. 2130%，标准差S为4. 7855%，变异系数CV为4. 8%。
2.稳定性试验国际标准品规定保存期为8年，我们用热加速耐老化试验检查结核菌素蛋白5(TC条件下保存效果，将样品放置5(TC 7U4、21、和28天通过效力测定保存至21天能够达到合格判定标准，第28天比值为0. 1109，判定不合格(合格判定标准为0. 9-1. 1)，见表4。
类别
对照组
5crc存放时间
天
14且——217. 50—0. 71
21天
28天
217. 750. 695
208. 251. 109
效价初步效
反应面积(mm2)平均值7 234.38 215.50效价下降程度平均值7 0 0.8 3.沩
(1)豚k^ 选体重400g左右的白色豚鼠10-12只，分别在大腿内侧深部肌肉注射牛型结核杆
菌致敏原(先将牛型结核杆菌培养物刮下、称重、磨碎，加适量生理盐水稀释，i2rc灭活30
分钟，再用弗氏不完全佐剂制成油乳剂，使每lml含牛型结核杆菌8 10mg，分装后8(TC水
10浴灭菌2小时。无菌检验合格后置2 8t:备用)0. 5ml。
(2)豚鼠测敏 致敏5周后，将每只致敏豚鼠臀部拔去一小块被毛(约3cm2，避开注射致敏原一侧)，第2日将牛型提纯结核菌素国际标准品或国家标准品稀释成每lml含结核菌素32. 5IU，于拔毛处皮内注射0. lml，注射后48小时观察，注射部位皮肤红肿面积达lcm2以上者，方可用于效价测定，每只豚鼠均达到lcm2以上。 将待测样品稀释成每lml含结核菌素蛋白(按lmg相当于32，500IU计算)25、50、100和200IU的4种不同浓度；将国际标准品也作同样稀释。挑选8只致敏合格豚鼠，于注射的前一日将胸腹部二侧被毛拔去(约3X9cm2)，采用轮回换点方式在每只豚鼠拔毛处依次注射此8种菌素稀释液，每点皮内注射0. lml，注射后24小时用游标卡尺测量每个注射点皮肤红肿面积，计算待测样品各梯度和国际标准品各稀释度在8只豚鼠身上引起皮肤红肿面积。通过计算待测各样品的稀释度平均反应面积和国际标准品平均反应面积比值为25IU比值0. 07 50IU比值0. 068 100IU比值0. 064和200IU比值0. 0114。
4.安全检验用生理盐水将提纯牛型结核菌素稀释成每lml 32500IU。用体重350-450g的豚鼠2只，每只腹腔注射结核菌素lml，观察10日。结果均健活。
5.特异性检验
(1)用牛检验 用健康易感牛20头，分为两组，每组10头。 第一组颈左侧皮内注射被检结核菌素，右侧注射国际标准品。 第二组颈左侧皮内注射国际标准品，右侧注射被检结核菌素。各皮内注射每lml含32500IU的菌素0. lml，注射后72小时判定。测定结果均无
过敏反应。 (2)用豚鼠检验 用体重350-450g的豚鼠进行特异性检验，每lml含32500IU菌素，皮内注射0. lml。注射后48小时判定，结果均无任何炎性反应。 6、定值(协作标定)用效价测定方法，国家标准品效价单位的确定一般用各协作单位结果的统计值表示，一般需经几个有经验的实验室协作进行。参加单位应采用统一的设计方案、统一的方法和统一的记录格式，标定结果须经统计学处理(标定结果至少需取得5次独立的有效结果)。我们首先制定方案，由黑龙江生物药厂、吉林生物药厂、成都生物药厂、中监所等单位进行标定，每单位进行2次独立试验。 (1)数据统计通过协作标定所测定的数据，采用生物检定统计法中的量反应平行线测定法(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典一部2005年版.中国农业出版社，2006) (2)国际单位确定数据统计后计算出lmg结核菌素的国际单位含量为32322IU，以此作为国家标准品的确定值。
权利要求
一种牛型结核菌素标准物质，其特征在于本发明所涉及的牛型结核菌素标准物质为每1mg蛋白质中含多糖与核酸总量应不高于0.1mg的牛分枝杆菌C68001和C68002株的牛型结核菌素。
2. —种牛型结核菌素标准物质的制备方法，其特征在于是通过利用由我国分离的牛分 支杆菌经过培养、灭活、过滤、纯化及冻干工艺过程制备牛型结核菌素，并通过对其中的蛋 白、核酸及多糖含量的测定及结合豚鼠和牛的皮肤敏感试验测定而制备出牛型结核菌素标 准物质。
全文摘要
本发明涉及一种牛型结核菌素标准物质及其制备方法。本发明所涉及的牛型结核菌素标准物质是通过利用由我国分离的牛分支杆菌经过培养、灭活、过滤、纯化等工艺过程制备牛型结核菌素，并通过对其中的蛋白、核酸及多糖含量的测定及结合生物学试验测定而制备出牛型结核菌素标准物质。
文档编号A61K49/00GK101732732SQ200910259889
公开日2010年6月16日 申请日期2009年12月17日 优先权日2009年12月17日
发明者关孚时, 张秀英, 戴志红, 李翠, 林朝洪, 王在时, 申咏红, 肖朝云, 蒋卉, 陆连寿 申请人:中国兽医药品监察所