新型链阳性菌素和通过突变合成制备链阳性菌素的方法

专利名称：新型链阳性菌素和通过突变合成制备链阳性菌素的方法
技术领域：
本发明主要涉及属于B组链阳性菌素的新型化合物和通过突变合成制备链阳性菌素的方法。本发明同样涉及在B组链阳性菌素前体的生物合成过程中使用的新型基因及其用途。
链阳性菌素是一组由两类化学性质不同的分子结合而成的同质抗生素；一方面是多不饱和性的大分子内酯(A组组分)，另一方面是缩酚酸肽(B组组分)。这一组中包括许多由于其来源不同而名称各异的已知抗菌素，其中有普那霉素、米卡霉素、维及霉素(cocito 1979，1983)。
组分A和B具有协同抗菌活性，这种协同活性为这两种组分分别被使用时的活性的100倍，与每一种组分的活性相反，协同活性具有杀菌剂功效。(cocito 1979)。更具体地，该活性能够有效地抵御格兰氏阳性细菌如葡萄球菌和链球菌(cocito 1979；Videan 1982)。组分A和B通过固定在核糖体的亚位50S上来抑制蛋白合成(Cocito 1979；Di Giambattistaet al.1989)。
尽管专利申请PCT/FR 93/0923提及的在先研究能够鉴别多种蛋白和结构相应的用于两类组分的生物合成过程的基因，但是迄今为止，对每种组分的生物合成的途径的认识仍然是不完整的。
B组的链阳性菌素的生物合成过程可以被划分为两部分1)下列大环化合物的前体或其类似物的生物合成过程3-羟基吡啶甲酸、L-2-氨基丁酸、4-二甲氨基-L-苯基丙氨酸、L-2-哌啶酸、L-苯基甘氨酸。
2)以上述前体、L-苏氨酸和脯氨酸或其类似物为原料伴随着可能存在的后续改进步骤如肽的N-甲基化、差向异构化、羟基化和氧化来制备大环化合物。
专利申请PCT/FR 93/0923具体地涉及在延伸过程中对将上述前体掺入链阳性菌素B的肽链起催化作用的酶及其结构基因。其结果证实了B类组分的非核糖体肽合成的特征。
更具体地，本发明涉及属于B组链阳性菌素的新型化合物，更确切地涉及下文用PI表示的普那霉素I(图1和2)族的或维及霉素S(图3)族的新型化合物。
普那霉素I(PI)的主要组成部分为占PI约94％的PIA(图1)，其余约6％为其结构如图2所示的缩酚酸肽(PIB-PII)的次要组成部分。PI主要是由其中一部分对于蛋白合成必不可少的氨基酸(脯氨酸和苏氨酸)和原始并且其本身被视为次生代谢物的其它氨基酸(L-2-氨基丁酸、4-二甲氨基-L-苯基丙氨酸(DMPAPA)、L-2-哌啶酸和L-苯基甘氨酸，用于PIA)以及芳族前体3-羟基吡啶甲酸的缩合反应形成。
至于维及霉素S的衍生物，它们来自与PI情况下相同的酸的缩合反应，不同的是DMPAPA被苯基丙氨酸替代(见图3)。
因此，通过生物合成制备这些不同化合物的过程需要通过生产性菌株预合成已鉴别的原始前体。
本发明确切地说涉及链阳性菌素的原始制备方法，其中利用突变微生物的菌株作为链阳性菌素的生产性菌株以改变B组链阳性菌素前体的生物合成法。按照该方法，所述的突变菌株通过不同于其生物合成法被改变的前体的原始前体被培养于在补体培养基中。出人意料地，制备得到有利于治疗的属于B组链阳性菌素的新型化合物。
更确切地，本发明涉及通式I所示的新型化合物 式中-R2和R4各自代表氢原子或甲基，-R3代表氢原子或羟基，-X代表CO、CHOH或CH2，-R1代表 -对于间位衍生物来说A、C、D和E代表氢原子B可以代表-卤原子，优选为氟原子-一烷基氨基或二烷基氨基，其中烷基优选为甲基或乙基，-一醚基，更具体地为基团OR，其中R优选自甲基、乙基、三氟甲基和烯丙基，-硫醚基，优选为其中烷基以甲基为佳的烷基硫，-C1-3烷基-三卤代甲基，优选三氟甲基，对于对位衍生物A，B，D和E代表氢原子C代表-卤原子-基团NR1R2，其中R1和R2分别代表选自下列种类的基团氢原子，C1-4直链或支链烷基，当R1与R2其中之一为甲基时，另一个则必须为乙基，其中环烷基含3-4个碳原子的烷基-环烷基甲基，
可被取代的C3-4环烷基，C1-4直链或支链烯基，当R1或R2其中之一为链烯基时，另一个不得为甲基或C3-6环烷基，-被取代或未被取代的N-吡咯烷基，-醚基，优选为OR，其中R优选自甲基、可被一个氯原子取代的乙基、三氟甲基和链烯基，-硫醚基，优选为烷基硫，其中烷基优选为C1-3烷基，-酰基或烷氧羰基，更具体地为其中R优选为C1-3烷基或C1-3烷氧基的COR，-直链或支链C1-6烷基，优选自甲基、异丙基和叔丁基，-烷硫基甲基，优选为其中R以C1-3烷基为佳的CH2SR，-芳基，以苯基为佳-三卤代甲基，以三氟甲基为佳，对于间位二取代衍生物A、D和E代表氢原子B可以代表-卤原子，优选为氟原子-一烷基氨基或二烷基氨基，其中烷基优选为甲基或乙基，-醚基，优选基团OR，其中R优选自甲基、乙基、三氟甲基，-硫醚基，优选为其中烷基以乙基为佳的烷基硫，-C1-3烷基C可以代表-卤原子，以氟原子为佳，-氨基、其中烷基优选为甲基的一烷基氨基或二烷基氨基，条件是B不得为溴原子或氯原子，或者被取代或未被取代的烯丙基，-醚基，优选为其中R优选自甲基、乙基和三氟甲基的OR，-硫醚基，优选为其中烷基以甲基为佳的烷硫基，-C1-6烷基，-三卤代甲基，以三氟甲基为佳对于邻-对位二取代衍生物
B、E和D代表氢原子，A和C为甲基。
作为优选化合物，更具体地可列举4ζ-甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，5γ-羟基-4ζ甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ζ-甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-甲氧羰基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-氯-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-溴-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-溴-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ζ-碘-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-碘-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ζ-三氟甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-三氟甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ζ-叔丁基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-异丙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-异丙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IE，4ε-甲胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ε-甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ε-甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ε-氟-4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-二乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-烯丙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-二烯丙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-烯丙基乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙基丙氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，
4ζ-乙基异丙氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙基甲基环丙氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-(1-吡咯烷基)-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-三氟甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-烯丙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-甲硫基甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-(2-氯乙氧基)-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙酰基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ε-二甲氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ε-甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ε-乙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
本发明还涉及尤其适用于制备化合物I的方法。
更确切地，本发明涉及制备链阳性菌素的方法，其特征在于利用具有至少一种能够影响B组链阳性菌素前体的生物合成法的遗传修饰的链阳性菌素的生产性微生物的菌株，所述突变菌株于完全和补体培养基中与至少一种其生物合成方式未被改变的原始前体一起培养，回收所述链阳性菌素。
用于本发明的菌株为链阳性菌素的生产性突变菌株。所述遗传修饰可以定位于所述前体的生物合成法中涉及的基因之上或编码区之外，例如处于负责基因表达和/或转录调节或转录后调节区中或含有所述基团的转录区。
按照本发明的特定方式，突变菌株在至少一个B组链阳性菌素前体的生物合成中涉及的基因上具有一个或多个遗传修饰。
这个或这些遗传修饰改变了所述基因的表达，也就是说，该基因，以及在必要时前体生物合成过程涉及的另一种基因部分地或完全无法对至少一种前体的生物合成过程涉及的天然酶进行编码。这种基因对天然蛋白质编码能力的丧失表现为由于结构或构象变化而产生失活蛋白质，或者无蛋白质产生，或者形成具有改变的酶活性的蛋白质或以逐渐减少的水平或按照所需的调节方式产生天然蛋白质。所有这些可能的表现形式通过改变甚至阻断至少一种B组链阳性菌素前体的合成得到表达。
本发明中易于突变的基因优选为下列前体的生物合成过程涉及的基因L-2-氨基丁酸、4-二甲氨基-L-苯基丙氨酸(DMPAPA)、L-2-哌啶酸，L-苯基甘氨酸和/或3-羟基吡啶甲酸(3-HPA)。
优选下述基因papA，_papM，papB(SEQ ID N°3)，papC(SEQ IDN°2)，hpaA(SEQ ID N°8)，snbF(SEQ ID N°6)和pipA(SEQ ID N°5)专利申请PCT/FR 93/0923已对基因papA和papM作过介绍。它们存在于粘粒piBV2之上。基因papA似乎对应于以分支酸为原料生物合成4-氨基-L-苯基丙氨酸的基因。随后基因papM的产物、一种N-甲基转移酶对4-氨基-L-苯基丙氨酸进行二甲基化处理以便得到4-二甲氨基-L-苯基丙氨酸DM PAPA，随后将其掺入普那霉素IA。这两种基团更具体地参与了前体即DMPAPA的合成过程。
本发明鉴别并且表述了其它基因papB，papC，pipA，subF和hpaA的特征。它们与基团subA、papA和papM一起集中于约10kb的染色体区(图7)。
经过证实的蛋白质PapB和Papc的序列同源性表明这些蛋白质与蛋白质PapA和PapM一起同样被用在前体DMPAPA的生物合成过程。两种相应的新基因papB和papC已通过借助专利申请PCT/FR 93/0923所述的粘粒pIBV2和通过缺失Hind III由pIBV2衍生的质粒pVRC 900进行亚克隆得到分离和鉴别。
将papC基因编码的蛋白与Genpro数据库中的蛋白序列比较，发现其与大肠杆菌的(Hudson和Davidson，1984)和草生欧文氏菌Erwiniaherbicola的(EMBL数据库，1991)双官能蛋白TyrA的预苯酸脱氢酶活性相关区的同源性为27％。TyrA的该区域在酪氨酸的生物合成中催化预苯酸芳构化为4-羟基苯基丙酮酸。一种从4-脱氧-4-氨基预苯酸到4-氨基苯基丙酮酸的相似芳香化很可能参与DMPAPA的合成。它将由蛋白PapC(SEQ ID No.2)催化。
至于蛋白PapB，它与大肠杆菌的双官能蛋白TyrA和PheA(Hudson和Davidson，1984)和草生欧文氏菌的蛋白TyrA的分支酸变位酶活性相关区具有24-30％的同源性。该区域在酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成中催化分支酸异构化成为预苯酸。蛋白PapB(SEQ ID No.3)很可能在DM PAPA的合成中参与从4-脱氧4-氨基分支酸到4-脱氧4-氨基预苯酸的相似异构化。
关于pipA、snbF和hpaA基因，已将它们定位在含于编码3-羟基吡啶甲酸AMP连接酶的snbA基因(在专利申请PCT/FR 93/0923中有述)和papA或snbR基因之间的区域中。如专利申请PCT/FR 93/0923中所述，通过用质粒pVRC 900和粘性质粒pIBV2进行的亚克隆对它们进行了精确定位。
将hpaA基因编码的蛋白与Genpro数据库中的蛋白序列比较，其与不同抗生素生物合成的中间体转氨作用中可能涉及的一组蛋白(Thorson等，1993)(DnrJ，Erycl，TyrlB，strS，PrgL)显示30-40％的同源性。前体3-HPA似以不同于环脱氨化(见实施例1-2和2-1)的途径从赖氨酸衍生而来，其合成很可能需要一步可由称为hapA基因(SEQ ID No.8)的产物催化的转氨作用。另外，在此基因中进行的突变结果表明在3-HPA前体的合成中无疑涉及该基因。
比较pipA基因编码的产物和Genpro数据库中的蛋白序列，发现其与根癌农杆菌A.tumefasciens的乌氨酸环脱氨酶有30％的同源性(Schindler等，1989)。该酶参与真蛸碱代谢的最后一步；将L-乌氨酸通过环脱氨作用转变为L-脯氨酸。作者们通过掺入标记赖氨酸已证明同样见于PIA中和维及尼霉素中的4-氧代-2-哌啶酸和3-羟基吡啶甲酸衍生自赖氨酸(Molinero等，1989；Reed等，1989)。通过类似于乌氨酸的环脱氨反应，从赖氨酸形成了2-哌啶酸。考虑到这种假说，将该产物称为PipA(SEQ ID No.5)。pipA基因中突变的结果(在下文实施例中给出)表明pipA基因只参与2-哌啶酸的合成。特别注意到该突变不影响3-羟基吡啶甲酸的生物合成，而3-羟基吡啶甲酸也衍生自赖氨酸且2-哌啶酸可作为其前体之一。
最后，比较snbF基因的产物和Genpro数据库中的蛋白序列，注意到其与次级代谢物生物合成中涉及的多种细胞色素P450型羟化酶(Omer等，1990；Trower等，1992)具有30-40％的同源性。在普那霉素I的前体生物合成中可能要进行多种羟化作用，特别是在3-HPA(吡啶甲酸3-位的羟化)和4-氧代-2-哌啶酸(2-哌啶酸的4-位羟化)的生物合成中。相应的蛋白被称为SnbF(SEQ ID No.6)。
pipA基因中的突变对SnbF基因的表达有极化作用，该结果表明snbF基因参与B组链阳性菌素的2-哌啶酸残基的羟化。通过pipA基因的遗传修饰也改变了snbF基因的表达。
优选这种或这些遗传修饰使所述基因部分或完全不能编码天然蛋白。
作为遗传修饰，更具体应理解为在目标基因中的所有一个或多个碱基的抑制、取代、缺失或插入。例如可以借助于遗传基因技术或再将所述微生物用诱变剂处理来在体外(对分离的DNA)或就地获得这种修饰。作为诱变剂的实例可举出物理试剂如能量照射(X线，γ线，紫外线等)，或能够作用于DNA碱基不同官能团的化学试剂，例如烷基试剂〔甲磺酸乙酯[EMS]，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍，N-硝基喹啉-1-氧化物(NQO)〕，双烷基化试剂，嵌入剂等。缺失应理解为对目标基因的一部分或全部的所有抑制。这特别涉及所述蛋白编码区的一部分，和/或转录、翻译或再转录的启动区的全部或部分。
也可以通过例如按Rothstein〔酶学方法，101(1983)202〕最先描述的方法进行的基因断裂或最好通过双重同源重组来进行遗传修饰。此时，优选修饰编码序列的全部，以使需要时通过同源重组用非功能的或突变的序列代替野生的基因性序列。
根据本发明的另一替代方案，遗传修饰可以是将所述蛋白的编码基因置于调节启动子的控制之下。
本发明的突变微生物株可以从任何链阳性菌素产生菌(参见表V)开始获得。本发明的一种特别的实施方案中涉及衍生自始旋链霉菌更优选衍生自始旋链霉菌SP92的一株。
作为本发明范围内优选的突变株，更具体可举出菌株SP92∷pVRC 508，通过基因papA简单交叉交换而断裂在前体DMPAPA的生物合成中突变；或更优选菌株SP212，通过papA基因的双重同源重组断裂在前体DMPAPA的生物合成中突变。这些菌株不再产生PI，除非为它们补充前体DMPAPA。出人意外的是，当在生产过程中加入能够或必要时在代谢后能够被PI合成酶III(负责L-脯氨酸残基和DMPAPA掺入的SnbD蛋白)吸收而不同于DMPAPA的原始前体时，这两种菌株变得能够产生新的普那霉素I或维及霉素，或主要产生一种正常情况下的PI小成分，特别是PIB(图2)。
本发明范围内还制备了另两株突变菌株在pipA基因中同源重组断裂的SP92 pipA∷ΩamR株。SP92 pipA∷ΩamR株一方面，在标准发酵条件下不再产生PI，另一方面在L-2-哌啶酸存在下能够大量产生一种链阳性菌素B成分的原小成分，其中4-氧代-2-哌啶酸被L-2-哌啶酸所取代。始旋链霉菌SP92 hpaA∷ΩamR株在标准发酵条件下不再产生PI，但在原始前体的存在下能够产生B组的新链阳性菌素。
在本发明突变株的培养基中补充至少一种原始前体可能引导生物合成要么产生新链阳性菌素，要么产生其中的一种小成分，或者有利于形成其中的一种。
本发明范围内所使用的前体可以是氨基酸衍生物或类似物，更具体地为苯丙氨酸的衍生物或类似物，以及有机酸特别是α-酮酸的衍生物或类似物，更优选苯基丙酮酸的衍生物。
当然，原始前体应按本发明在生物合成水平提供对B组链阳性菌素的天然前体的改变甚至阻断，并导致链阳性菌素的合成。按本发明的一种特别方案，选择该原始前体以使其类似于改变了生物合成的前体。因而在DMPAPA的生物合成过程中阻断突变的特别情形下，原始前体优选为苯丙氨酸的衍生物。作为本发明适用的前体尤其可以列举苯基丙氨酸、4-二甲胺基苯基丙氨酸、4-甲氨基苯基丙氨酸、4-氨基苯基丙氨酸、4-二乙胺基苯基丙氨酸、4-乙氨基苯基丙氨酸、4-甲硫基苯基丙氨酸、4-甲基苯基丙氨酸、4-甲氧基苯基丙氨酸、4-三氟甲氧基苯基丙氨酸、4-甲氧基羰基苯基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、4-溴苯基丙氨酸、4-碘苯基丙氨酸、4-三氟甲基苯基丙氨酸、4-叔丁基苯基丙氨酸、4-异丙基苯基丙氨酸、3-甲胺基苯基丙氨酸、3-甲氧基苯基丙氨酸、3-甲硫基苯基丙氨酸、3-氟-4-甲基苯基丙氨酸、4-叔丁基苯基丙酮酸、4-甲胺基苯基丙酮酸、2-萘基苯基丙氨酸、4-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸、3-乙氧基苯基丙氨酸、2，4-二甲苯基丙氨酸、3，4-二甲苯基丙氨酸、3-甲苯基丙氨酸、4-苯基苯基丙氨酸、4-丁苯基丙氨酸、2-噻吩基-3-丙氨酸、3-三氟甲基苯基丙氨酸、3-羟基苯基丙氨酸、3-乙胺基苯基丙氨酸、4-烯丙基氨基苯基丙氨酸、4-二烯丙基氨基苯基丙氨酸、4-烯丙基乙胺基苯基丙氨酸、4-乙基丙基胺基苯基丙氨酸、4-乙基异丙基胺基苯基丙氨酸、4-乙基甲基环丙基胺基苯基丙氨酸、4-(1-吡咯烷基)苯基丙氨酸、4-O-烯丙基酪氨酸、4-O-乙基酪氨酸、4-乙硫基苯基丙氨基、4-乙硫基甲苯基丙氨酸、4-O-(2-氯乙基)酪氨酸、4-乙酰基苯基丙氨酸、4-乙苯基丙氨酸、3-二甲胺基苯基丙氨酸、3-乙氧基苯基丙氨酸、3-氟-4-甲苯基丙氨酸、4-氨基甲基苯基丙氨酸和L-2-哌啶酸。
在这些前体中下列种类是新型的、已经按照本发明制成并且其特征也已得到描述，它们特别适用于制备本发明的链阳性菌素4-三氟甲氧基苯基丙氨酸、3-甲胺基苯基丙氨酸、3-甲硫基苯基丙氨酸、3-氟-4-甲基苯基丙氨酸、4-甲胺基苯基丙酮酸、3-乙氧苯基丙氨酸、4-烯丙基胺基苯基丙氨酸、4-二烯丙基胺基苯基丙氨酸、4-烯丙基乙胺基苯基丙氨酸、4-乙基丙胺基苯基丙氨酸、4-乙基异丙胺基苯基丙氨酸、4-乙基甲基环丙基胺基苯基丙氨酸、4-(1-吡咯烷基)苯基丙氨酯、4-乙硫基甲苯基丙氨酸、4-O-(2-氯乙基)酪氨酸、3-二甲胺基苯基丙氨酸和3-乙氨基苯基丙氨酸。
本发明要求的方法似对制备B组新链阳性菌素或利于形成其中的某一些特别有利。因此对制备PIB特别有用。
本发明还涉及选自下组的核苷酸序列(a)基因papC(SEQ ID No.2)，papB(SEQ ID No.3)，pipA(SEQID No.5)，SnbF(SEQ ID No.6)和hpaA(SEQ ID No.8)的全部或部分，
(b)与(a)中全部或部分基因杂交的序列，和(c)由于遗传密码简并衍生自(a)和(b)的序列的序列。
在(b)的杂交序列特别情形下，它们优选编码参与链阳性菌素生物合成的多肽。
更优选，本发明涉及基因papC(SEQ ID No.2)，papB(SEQ IDNo.3)，pipA(SEQ ID No.5)，snbF(SEQ ID No.6)和hapA(SEQ ID No.8)所代表的核苷酸序列。
本发明的另一目的是包含一种基因papC(SEQ ID No.2)，papB(SEQ ID NO.3)，pipA(SEQ ID No.5)，snbF(SEQ ID No.6)和hpaA(SEQID no.8)的所有重组DNA。
当然，以上定义的核苷酸序列可以构成可自主复制或整合的表达质粒或自杀载体的一部分。本发明还涉及这些载体以及本发明的一种序列或相应的一种载体的所有应用，特别用于制备有用的代谢产物。而且还涉及所要求的序列之一表达产生的所有多肽。
本发明还涉及所有在基因papC(SEQ ID No.2)，papB(SEQ IDNo.3)，pipA(SEQ ID No.5)，snbF(SEQ ID No.6)和hapA(SEQ ID No.8)之一中具有至少一种遗传修饰的始旋链霉菌突变株，更优选SP 92 pipA∷ΩamR、SP92 hpaA∷ΩamR菌株，以及通过双重同源重组papA基因断裂而遗传修饰的所有始旋链霉菌菌株，如SP212。
A组链阳性菌素的一种成分和本发明的一种通式I化合物结合，构成了对治疗方案特别有意义的组合物。它们特别用于治疗由革兰氏阳性细菌(葡萄球菌属、链球菌属、肺炎球菌属、肠球菌属的)和革兰氏阴性细菌(嗜血杆菌属、淋球菌属、脑膜炎双球菌属的)引起的感染。本发明的化合物还与普那霉素IIB在小鼠体内对金黄色葡萄球菌IP8203具有协同抗菌作用，剂量大致在30mg/kg-100mg/kg之间，口服给药，它们的结合比例PI/PII为30/70左右。
本发明涉及所有含有与一种A组链阳性菌素结合或不结合的至少一种通式I化合物的药物组合物。
下列实施例用于说明目的而不限制本发明。


图1普那霉素IA的结构。
图2普那霉素I小成分的结构。
图3链阳性菌素成分B结构的另一些实例图42.9kb的PstI-XhoI区的描绘。
图54.5kb的XhoI-PstI区的描绘。
图61.6kb的HindIII-Bg1II区的描绘。
图7约10kb的Bg1II-XhoI区的描绘。
图8质粒pVRC415的描绘。
图9质粒pVRC420的描绘。
图10质粒pVRC411的描绘。
图11质粒pVRC421的描绘。
图12质粒pVRC414的描绘。
图13SP212的构建策略。
实施例1参与普那霉素I和其前体生物合成的基因的测序和鉴定PapA酶编码基因上游和下游基因的测序鉴定如专利PCT/FR93/0923所述，对位于SnbA酶编码基因下游一种基因的测序鉴定也描述在专利PCT/IR 93/0923中。
本实施例描述如何从粘性质粒pIBV2开始，该粘粒在专利PCT/FR93/0923中有述，含有参与普那霉素I前体4-二甲氨基-L-苯丙氨酸(DMPAPA)合成的酶PapA和PapM的结构基因，和负责活化普那霉素I芳香前体3-羟基吡啶酸(3HPA)的SnbA酶的结构基因，已证明可能通过围绕这些基因进行测序并研究相应的突变来鉴定参与前体DMPAPA生物合成或普那霉素I其他前体生物合成的其他基因。
为此目的，用粘性质粒pIBV2和质粒pVRC 900进行了亚克隆，质粒pVRC 900通过一种Hind III缺失从pIBV 2衍生而来，也在专利PCT/FR 93/0923中有述。
本实施例描述如何获得位于始旋链霉菌的papA和snbA基因下游和上游的片段的核苷酸序列。
在载体M13 mp 18/19(Hessing等，1981)中克隆目标DNA片段的技术是在大肠杆菌中克隆的常规技术，并描述在Maniatis等(1989)中。
1.1papA基因下游区的测序和分析为对含于papA和papM基因之间的该区域进行测序，已利用质粒pVRC 900将1.5kb的PstI-PstI片段、0.7kb的PstI-XhoI片段和0.7kb的XhoI-XhoI片段亚克隆到载体M13 mp18和M13 mp19中。克隆位点已通过用PCT/FR 93/0923中描述的质粒pVRC 900和pVRC 409在双链DNA上进行的测序被标定。如下进行克隆。约2μg质粒pVRC 900在供货商推荐的条件下用限制酶PstI和/或XhoI(New England Bioabs)切割。这样获得的限制性片段在0.8％琼脂糖凝胶上分离并分出目标片段1.5kb的Pst-PstI、0.7kb的PstI-XhoI和0.7kb的XhoI-XhoI，再用Geneclean(Bio 101，La Jolla，Californie)纯化。每次克隆中，在maniatis等1989描述的条件下将约10ng用PstI和/或XhoI切割的M13 mp19和/或M13mp18与100ng待克隆片段连接。按Maniatis等(1989)描述的技术转化TG1菌株(K12，Δ(Lac-pro)supE thi hsdΔSF tra D36 proA+B+lacIq Lac ZΔM15；Gibson，1984)并挑选出在LB+X-gal+IPTG介质中溶解的噬菌体，分离带有理想片段的噬菌体。通过链终止反应法对这些不同插入物进行了测序，其中利用通用引物或待测序插入物20个核苷酸序列的互补合成寡核苷酸作为引物。利用双脱氧核苷酸荧光法(PRISM，即时反应染料脱氧终止循环测序试剂盒-应用生物系统)进行这些反应，并用373A型应用生物系统DNA测序仪进行分析。这些不同插入片段之间的交叉覆盖使得确定了存在于papA和papM基因之间的全部核苷酸序列(SEQ ID No.1)。
利用该核苷酸序列可能确定开放读码框架并进而鉴定始旋链霉菌中参与PI或其前体生物合成的基因，以及由这些基因编码的多肽。
我们研究了含papA和papM基因间核苷酸序列的2.9kb PstI-XhoI片段中开放读码框架的存在，其中利用了链霉菌DNA具有高G、C碱基百分比和组成编码性框架的密码子的选用很偏的事实(Bibb等，1984)。用Staden和McLachlan(1982)的方法可根据已测序的链霉菌基因的密码子选用计算出编码性框架的机率，所述已知基因的密码子选用收集在含19673密码子的来自BISANCE信息服务器(Dessen等，1990)的资料库中。
这种方法使得在2.9kb PstI-XhoI片段中鉴定了4个开放读码框架，它们很可能如下表(表I)中所示。根据距PstI位点的位置，将它们命名为1-4框架。指出了每个框架的碱基长度和在片段中的位置(PstI位点位于1位)；还指出了开放读码框架2和3的编码多肽的氨基酸长度。1、3和4框架由同一条链编码，而框架2由互补链编码(图4)。框架1和4分别相当于PapA蛋白的C-末端和PapM蛋白(已在PCT/FR93/0923中鉴定并描绘)的N-末端。
表1

将第2框架(表I)的产物与Genpro数据库中的蛋白序列比较，发现其与大肠杆菌的(Hudson和Davidson，1984)和草生欧文氏菌的(EMBL数据库，1991)双官能蛋白TyrA的预苯酸脱氢酶活性相关区的同源性为27％。TyrA的该区域在酪氨酸的生物合成中催化预苯酸芳构化为4-羟基苯基丙酮酸。一种从4-脱氧4-氨基预苯酸到4-氨基苯基丙酮酸的相似芳香化很可能参与DMPAPA的合成。该反应将由称为蛋白PapC(SEQ ID No.2)第2框架产物催化。
比较框架3的产物(表I)和Genpro数据库中的蛋白序列，发现其与大肠杆菌双官能蛋白TyrA和PheA(Hudson和Davidson，1984)和草生欧文氏菌的TyrA蛋白的分支酸变位酶相关区具有24-30％的同源性。该区域在酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成中催化分支酸异构化成为预苯酸。从4-脱氧4-氨基分支酸到4-脱氧4-氨基预苯酸的类似异构化作用很可能参与DMPAPA的合成。该反应将由框架3的产物催化，称为PapB(SEQ ID No.3)。
对于TyrA和PheA，分支酸变位酶和预苯酸脱水酶或预苯酸脱氢酶的活性由同一蛋白催化。在始旋链霉菌中，分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶的酶活性由两种不同的蛋白催化，分别为PapB和PapC。
蛋白PapB和蛋白PapC所显示的序列同源性表明这两种蛋白与蛋白PapA和PapM一起参与芳香衍生物DMPAPA的生物合成。与PapA的情况相同，papB和papC基因的断裂应导致形成不能产生PI但在原始前体存在下能够产生在DMPAPA残基上修饰的新PI的始旋链霉菌株。
1-2.papA基因上游区的测序和分析该区域含于编码3-羟基吡啶甲酸-AMP连接酶的SnbA基因(在PCT/FR 93/00923中有述)和papA基因之间。
如实施例1-1中所述用P CT/FR 93/00923中描述的质粒pVRC900和粘性质粒pIBV2进行克隆。将1.3kb的XhoI-XhoI片段，0.2kb的XhoI-XhoI片段、3.3kb的XhoI-XhoI片段、1.1kb的HindIII-PstI片段和2.2kb的PstI-PstI片段亚克隆到载体M13 mp18和M13 mp19中。这些不同的克隆使得可以穿过所有克隆位点，如1-1中所述对这些不同插入片段进行测序，其中用通用引物或待测序插入片段的20个核苷酸序列的互补合成核苷酸作为合成引物。
这些不同插入片段间的交叉覆盖使得可以确定存在于snbA和papA基因之间的全部核苷酸序列(SEQ ID No.4)。
利用该核苷酸序列可能确定开放读码框架，鉴定始旋链霉菌中参与PI前体的生物合成的基因，以及这些基因编码的多肽。
如实施例1.1中所述，我们研究了含snbA和papA基因间核苷酸序列的4.5kb XhoI-PstI片段中开放读码框架的存在。这种方法使得在4.5kbXhoI-PstI片段中鉴定了4个开放读码框架，它们很可能如下表(表II)所示。根据距XhoI位点的位置，将它们命名为1-4框架。指出了每个框架的碱基长度和在片段中的位置(XhoI位点位于1位)；还指出了开放读码框架2和3的编码多肽的氨基酸长度。2、3和4框架由同一条链编码，而框架1由互补链编码(图5)。框架1和4分别相当于SnbA和PapA蛋白(已在PCT/FR 93/0923中鉴定并描绘)的N-末端。
表II

比较框架2的产物(表II)和Genpro数据库中的蛋白序列，发现其与根癌农杆菌的乌氨酸环脱氨酶有30％的同源性(Schindler等，1989)。该酶参与真蛸碱代谢的最后一步将L-乌氨酸通过环脱氨作用转变为L-脯氨酸。作者们通过掺入标记赖氨酸已证明同样见于PIA中和维及尼霉素中的4-氧代-2-哌啶酸和3-羟基吡啶甲酸衍生自赖氨酸(Molinero等，1989；Reed等，1989)。通过类似于乌氨酸的环脱氨反应，从赖氨酸形成了2-哌啶酸。考虑到这种假说，将该产物称为PipA(SEQ ID No.5)。pipA基因中突变的结果(实施例2-1中)表明pipA基因只参与2-哌啶酸的合成。因为该突变不影响3-羟基吡啶甲酸的生物合成，而3-羟基吡啶甲酸也衍生自赖氨酸且2-哌啶酸可作为其前体之一。
比较框架3的产物(表II)和Genpro数据库中的蛋白序列，注意到其与次级代谢物生物合成中涉及的多种细胞色素P450型羟化酶(Omer等，1990；Trower等，1992)具有30-40％的同源性。在普那霉素I的前体生物合成中可能要进行多种羟化作用，特别是在3-HPA(吡啶甲酸3-位的羟化)和4-氧代-2-哌啶酸(2-哌啶酸的4-位羟化)的生物合成中。pipA基因中的突变结果(2-1-3中)说明框架3的产物参与PIE2-哌啶酸残基的羟化。因而相应的基因称为snbF，相应的蛋白称为snbF(SEQ ID No.6)。
1-3.snbA基因下游区的测序该区域含于编码3-羟基吡啶甲酸-腺苷酸连接酶的snbA基因和编码可能负责输送和对PI抗性的膜蛋白的snbR基因之间，这两种基因都在PCT/FR 93/00923中有述。如实施例1-1中所述用从粘性质粒pIBV 2分离的片段进行了这些测序。
利用粘性质粒pIBV2将1.6kb的Hind III-Bg1 II片段亚克隆到载体M13 mp18和M13 mp19中。如1-1中所述对插入片段测序，其中利用通用引物或待测序插入片段的20个核苷酸序列的互补合成寡核苷酸作为合成引物。利用这样获得的核苷酸序列(SEQ ID No.7)可能确定开放读码框架，鉴定始旋链霉菌的参与PI前体生物合成的基因，以及这些基因编码的多肽。如实施例1-1中所述，我们研究了1.6kb HindIII-Bg1II片段中开放读码框架的存在，该片段相当于snbA基因的末端到其下游区。已证明了一个由snbA基因的同一链编码的完整开放框架(图6)。与相当于HindIII位点的1位相关，该框架起始于249核苷酸(snbA基因末端后30个核苷酸)，终止于1481核苷酸。其长度为1233核苷酸，相应于411个氨基酸的蛋白。
将该开放读码框架的产物与Genpro数据库中的蛋白序列比较，其与不同抗生素生物合成的中间体转氨作用中可能涉及的一组蛋白(Thorson等，1993)(DnrJ，Erycl，TyrlB，strS，PrgL)显示30-40％的同源性。前体3-HPA似以不同于环脱氨化(见实施例1-2和2-1)的途径从赖氨酸衍生而来，其合成很可能需要一步可由称为hapA的该框架3产物(SEQ ID No.8)催化的转氨作用。另外，在此基因中进行的突变结果(2-2有述)表明在3-HPA前体的合成中无疑涉及该基因。这证实了我们的假设。
本发明中描述的基因papB、papC、pipA、SnbF和hpaA与基因snbA、papA和papM集中在约10kb的染色体区中(图7)。这证实存在一簇参与PI和其前体生物合成的基因。对该簇上游和下游区的研究应能够鉴别出PI前体生物合成的其他基因，特别是L-苯基甘氨酸和L-2-氨基丁酸的生物合成基因。
实施例2通过已鉴定基因的断裂构建重组菌株本实施例说明如何证明在普那霉素前体的生物合成中涉及实施例1中所述基因，以及如何构建能够产生新普那霉素的始旋链霉菌菌株。通过断裂欲取代残基生物合成中相关的基因来获得这些菌株，并通过向这些突变体补充原始前体产生这些新普那霉素。
PCT/FR 93/0923中描述了本发明中所用菌株SP92∷pVRC508，通过用其他分子代替前体DMPAPA而产生了PI的新衍生物。papA基因简单交叉交换产生的断裂造成了该菌株，papA基因参与DMPAPA前体的生物合成并假定在一个涉及分支酸转氨作用的早期步骤中起作用。这种断裂具有极性，因为位于papA基因下游1.5kb的papM基因(PCT/FR 93/0923)的表达被大大减低了，而papM基因参与4-氨基-L-苯丙氨酸被二甲基化成为DMPAPA的过程。实际上，从4-氨基-L-苯丙氨酸(PAPA)到DMPAPA的SAM依赖性甲基化酶活性的测定，表明SP92∷pVRC 508的活性小于野生株活性的5％。
如将要在实施例3中给出的那样，本发明中菌株SP92∷pVRC 508在发酵和有足够的互补作用条件下能产生新的DMPAPA残基修饰的普那霉素。具有相同表型的突变株可如本发明中所述通过papB或papC基因的断裂来获得。
按相似方式，通过papA基因的双交叉断裂获得了另一型始旋链霉菌菌株，其papA基因断裂并与SP92∷pVRC 508具有相同的表型。这是从4.6kb的SphI-HindIII片段构建得来的，该片段分离自粘性质粒pIBV2并含有pipA基因的3’区、snbF和papA基因的全部以及papC基因的3’部分。该片段已被克隆在自杀载体pDH5中，该载体只能在大肠杆菌中复制，但带有在链霉菌中表达的抗性标记(硫链丝菌肽或nohiheptide抗性基因，tsr)。pDH5载体是由Wholebben等研制的(1991，核酸研究，19，727-731)。然后在panA基因中缺失1.1kb的BclI-BclI片段，填平粘性末端后引入带有amR基因(抗遗传霉素和阿泊拉霉素)的2.2kb HindIII-HindIII片段。该重组载体称为pVRC414并示于图12中。用质粒pVRC 414转化普那霉素产生菌后，分离并分析耐遗传霉素但对硫链丝菌肽敏感的转化子。这些克隆来自质粒pVRC 414的始旋链霉菌DNA区和如图13所示的相应始旋链霉菌染色体区之间的双重同源重组。这些克隆之一称为SP212。在不产PI和在原始前体存在下产生新抗生素的能力方面，其表型与SP92∷pVRC508株相同。有利之处是这种通过双交叉获得的菌株与简单交叉获得的菌株相比具有更高的稳定性。
2-1.构建pipA基因中断裂的始旋链霉菌SP92突变株本实施例说明如何通过pipA基因断裂构建菌株始旋链霉菌SP92，该菌株在标准发酵条件下不再产PI，在发酵过程中加入原始前体时能够产生在PIA4-氧代哌啶酸残基上修饰的新普那霉素。
借助于只在大肠杆菌中复制的自杀载体pUC1318进行其构建。该载体不带在链霉菌中表达的抗性标记。其在链霉菌基因组中的存在只能通过菌落杂交来检测。
2-1-1.质粒pVRC 420的构建本实施例说明如何构建不在始旋链霉菌SP92中复制并可用于经双重同源重组断裂pipA基因的质粒。
构建了质粒pVRC420以便从专利PCT/FR 93/0923中描述的粘性质粒pIBV2实现在基因pipA中断裂的SP92染色体突变。粘性质粒pIBV2用限制酶PstI切割，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离所形成的片段后，用Geneclean(Biolol，La Jolla，Californie)分离并纯化2.8kb的PstI-PstI片段，其中含有snbA和snbF基因的开端和整个pipA基因。50ng经PstI消化线性化的载体pUC1318如实施例1中所述与200ng2.8kb片段连接。转化TG1菌株并在LB+氨苄青霉素150μg/ml+X-gal+IPTG中选择后分离出带有所希望片段的克隆。该重组质粒称为pVRC415(图8)。然后将含有编码阿泊拉霉素抗性或遗传霉素抗性的amR-基因(Kuhstoss等，1991)的盒子引入质粒pVRC 415的单一HindIII位点，该位点位于pipA基因起点下游的第530bp处。按如下步骤进行这种构建衍生自质粒pIJ 4026(带有PermE启动子控制下的ermE基因质粒载体)和pHP45ΩamR-的质粒经双消化SalI-BglII分离到ermE，一种2.5kb含有amR基因、PermE启动子(Bibb等，1985)以及红霉素抗性基因头158个氨基酸部分的DNA片段。用Klenow酶按Maniatis等1989描述的方法填平5’粘性末端SalI和BglII后，将含有amR基因的片段克隆在其粘性5’未端也已按前述用Klenow酶填平的质粒pVRC415的HindIII位点上。这样获得的重组质粒称为pVRC 420。其限制性图谱示于图9中。
2-1-2.通过同源重组在pipA基因中断裂的突变株SP92 pipA∷ΩamR的分离本实施例说明如何构建在pipA基因中断裂的突变株始旋链霉菌SP92。
通过用自杀质粒pVRC 420转化菌株SP92来分离该突变株。
如Hopwood等(1985)所述进行原生质体制备、其转化以及重组菌株总DNA的提取。
菌株SP92在YEME培养基(Hopwood等，1985)，34％蔗糖、5mM MgCl2、0.25％甘氨酸中30℃培养40小时。菌丝体在溶菌酶存在下原生质体化，5×1μg的pVRC 420用于转化这些原生质体(利用PEG的方法)。原生质体在R2YE培养基(D.Hopwood等，1985)中再生一夜后，通过涂3ml含1500μg/ml遗传霉素的SNA培养基(D.Hopwood等，1985)挑选重组子。
从进行的5次转化中分离了100个遗传霉素抗性克隆。这些重组子产自简单或双重同源重组靠造成的整合，所述重组发生在SP92株染色体携带的pipA基因和含于自杀质粒pVRC 420所带5.3kb片段中的几个pipA基因部分之间。为了筛选双重交叉交换获得的重组子(即在其基因组中不含有质粒pVRC 420的pUC 1318部分)，如Maniatis等(1989)所述用[α-32p]dCTP标记的pUC19作为探针在90个克隆的菌落上进行杂交。选择了10个耐遗传霉素但不与载体pUC19杂交的克隆。通过铺在HT7+10μg/ml遗传霉素培养基上并在其上生长分离重组子的孢子，重铺在相同培养基上以获得单一的菌落。在核实质粒pVRC 420的整合位置后，对如Hopwood等1985所述纯化的多个重组克隆的总DNA进行了不同的Southern印迹，并用[α-32p]dCTP标记后的2.8kb PstI-PstI片段作为探针进行杂交。结果证实这些重组子是通过载体pVRC 420和SP92菌株染色体之间的双重交叉交换获得的，导致含pipA基因的2.8kbPstI-PstI片段被其中pipA基因被amR基因中断的5.3kb PstI-PstI片段所取代。这些突变株之一命名为SP92 pipA∷ΩamR。
2-1-3.由SP92 pipA∷ΩamR生产普那霉素本实施例说明如何确定由质粒pVRC420整合断裂pipA基因的始旋链霉菌SP92突变株，一方面在标准发酵条件下不再产生PI，另一方面可以大量产生链阳性菌素B成分的一种小成分，其中4-氧代-2-哌啶酸被2-哌啶酸所取代。
将突变株SP92 pipA∷ΩamR以及作为对照的菌株SP92在液体生产培养基中培养。如下进行发酵上述菌株的孢子悬浮液0.5ml无菌条件下加到300ml锥形瓶(erlen chicane)中的40ml接种培养基中。接种培养基的组成为10g/l玉米浸液、15g/l蔗糖、10g/l(NH4)2SO4、1g/lK2HPO4、3g/lNaCl、0.2g/lMgSO4·7H2O和1.25g/lCaCO3。在加入碳酸钙前用氢氧化钠调pH至6.9。在一325rpm转速的摇床上于27℃振动这些锥形瓶44小时。将上述44小时培养物2.5ml无菌条件下加入到300ml锥形瓶中30ml生产培养基中。生产培养基的组成为25g/l黄豆粉、7.5g/l淀粉、22.5g/l葡萄糖、3.5g/l饲料酵母、0.5g/l硫酸锌和6g/l碳酸钙。在加入碳酸钙之前用氢氯酸调pH至6.0。这些锥形瓶在27℃振动24、28和32小时。在每一时间点从平滑锥形瓶称取10g发酵液，向其中加入20ml由34％乙腈和66％0.1M KH2PO4溶液组成的流动相(用浓H3PO4调pH至2.9)以提取普那霉素。搅拌后进行离心，含于上清液中的普那霉素用HPLC定量测定，向4.6×150mm的Nucleosil5-C8柱中注射150μl离心上清液，用40％乙腈和60％0.1M磷酸盐缓冲液(pH2.9)的混合物洗脱。利用206nm处的UV吸光度检测普那霉素I。
结果显示突变株SP92pipA∷ΩamR在所用发酵条件下在发酵24，28和32小时后不产生PI，而对照SP92在三个测试时间下产生了标准量的PI。这两个菌株产生的PII的量保持相同。突变株SP92pipA∷ΩamR在PI生物合成的一个步骤中被完全阻断。在16小时后向生产培养基中分别或同时加入不同的PI前体来进行补充发酵试验。这些补充的结果显示出当在发酵过程中同时加入100mg/l 2-哌啶酸和100mg/l DMPAPA时，突变株产生正常情形下作为PI小成分的衍生物PIE(在SP92中其产率小于5％)，其量相当于对照株的PIA产量。如果分别加入2-哌啶酸和DMPAPA则不发生这种情况。PIE与PIA(PI的主要成分)的不同之处是在2-哌啶酸的4-位没有酮官能团。只有同时加入2-哌啶酸和DMPAPA才能补充突变株SP92pipA∷ΩamR这一事实，说明papA基因及可能的papB和papM基因通过该构建物的极化作用而被中断。实际上，所有这些基因都位于pipA的下游，可能与pipA同转录。pipA的断裂从而引起pap基因的断裂，结果不能合成DMPAPA。从2-哌啶酸补充突变株SP92 pipA∷ΩamR引起PIE的产生而不产生PIA这一事关得出两个结论第一，PI环的建立是通过加入2-哌啶酸而非4-氧代-2-哌啶酸进行的，因而产生4-位酮的羟化是此后发生的；第二，该羟化很可能通过snbF酶进行，该酶的结构基因位于pipA基因的紧下游。事实上，pipA基因断裂对pap基因的明显极化可能涉及对位于pipA和pap基因之间的snbF基因的极化作用，其表现为抑制从PIE的2-哌啶酸残基羟化为见于PIF和PIG(图2)中的4-羟基-2-哌啶酸，然后氧化为PIA中的4-氧代-2-哌啶酸的功能。
进行这种突变使得构建了除非在PI前体DMPAPA和2-哌啶酸存在下不能产生PI的始旋链霉菌菌株，它从这些前体能够以相当于出发菌株的量产生普那霉素混合物中正常条件下为小成分的PI衍生物。同样在原始前体或原始前体和PI中正常存在的前体的混合物存在下，该菌株将能产生新的普那霉素，其中已在DMPAPA和4-氧代-2-哌啶酸残基之一或两者上进行了修饰。
2-2.一种hpaA基因断裂的始旋链霉菌SP92突变株的构建本实施例说明如何通过hpaA基因断裂来构建一种始旋链霉菌SP92菌株，其在正常发酵条件下不再产生PI，而当发酵过程中加入原始前体时则能够产生在3-HPA前体上修饰了的新普那霉素。
它是借助于在始旋链霉菌SP92中不能复制的质粒构建的，该质粒可用于通过双重同源重组来断裂hpaA基因。
2-2-1.自杀质粒pVRC 421的构建质粒pVRC 421是借助于一种自杀载体构建而成的，该载体只能够在大肠杆菌中复制，但带有在链霉菌中表达的抗性标记；对硫链丝菌肽或对nosiheptide的抗性基因tsr。该载体pDH5是由Hillemann等(1991)研制的。
构建了质粒pVRC421以从专利PCT/FR 93/0923中描述的粘性质粒pIBV2实现在基因hpaA中断裂的SP92染色体突变。粘性质粒pIBV2用限制酶SphI消化，在0.6％琼脂糖凝胶上电泳分离所形成的片段后，如前文所述用Geneclean分离并纯化4.8kb的SphI-SphI片段，其含有hpaA基因的全部和几乎整个snbA基因。50ng经SphI消化线性化的载体pDH5如下文所述与200ng 4.8kb片段连接。转化TG1菌株并在LB+氨苄青霉素150μg/ml+X-gal+IPTG介质中选择后分离出带有所希望片段的克隆。该重组质粒称为pVRC411(图10)。然后将含有编码阿泊拉霉素抗性或遗传霉素抗性的amR-基因的盒子引入质粒pVRC 411的单一Pf1mI位点，该位点位于hpaA基因起点下游的第610bp处。按如下步骤进行这种构建含有amR基因的质粒pHP45ΩamR用HindIII消化后分离到含有amR基因的2.2kbDNA片段。用Klenow酶按Maniatis等1989描述的方法填平5’粘性末端HindIII后，将含有amR基因的片段克隆在其粘性3’未端也已按Maniatis等1989所述用T4聚合酶填平的质粒pVRC411的Pf1mI位点上。这样获得的重组质粒称为pVRC 421。其限制性图谱示于图11中。
2-2-2.通过同源重组在hpaA基因中断裂的突变株SP92 hpaA∷ΩamR的分离本实施例说明如何构建在hpaA基因中断裂的突变株始旋链霉菌SP92。
通过用自杀质粒pVRC 421转化菌株SP92来分离该突变株。
如前所述进行原生质体制备和其转化。
菌株SP92在YEME培养基，34％蔗糖、5mM MgCl2、0.25％甘氨酸中30℃培养40小时。菌丝体在溶菌酶存在下原生质体化，5×1μg的pVRC 420用于转化这些原生质体(利用PEG的方法)。原生质体在R2YE培养基中再生一夜后，通过涂以含1500μg/ml遗传霉素的SNA培养基3ml挑选重组子。
从进行的5次转化中分离了600个遗传霉素抗性克隆。这些重组子产自简单或双重同源重组造成的整合，所述重组发生在SP92株染色体携带的hpaA基因和含于自杀质粒pVRC 421所带6kb片段之间。为了筛选双重交叉交换获得的重组子(即在其基因组中不含有质粒pVRC 421的pDH5部分)，将这些克隆转种在含400μg/ml硫链丝菌肽的HT7培养基上。选择了6个耐遗传霉素但对硫链丝菌肽敏感的克隆。通过铺在HT7+10μg/ml遗传霉素培养基上并在其上生长来分离重组子的孢子，重铺在相同培养基上以获得单一的菌落。在核实质粒pVRC 421的整合位置后，对如Hopwood等1985所述纯化的6个重组克隆的总DNA进行了不同的Southern印迹，并用[α-32p]dCTP标记后的4.8kbSphI-SphI片段作为探针进行杂交。结果证实这些重组子是通过载体pVRC 421和SP92菌株染色体之间的双重交叉交换获得的，导致含hpaA基因的4.8kb SphI-SphI片段被其中hpaA基因被amR基因中断的6kbSphI-ShpI片段所取代。这些突变株之一命名为SP92 hpaA∷ΩamR。
2-2-3.用突变株SP92hpaA∷ΩamR生产普那霉素本实施例说明如何确定由质粒pVR421整合断裂hpaA基因的突变株始旋链霉菌SP92在标准发酵条件下不再产生PI。
突变株SP92 hpaA∷ΩamR以及作为对照株的SP92在液体生产培养基中培养。如实施例2-1-3中所述进行发酵，然后如前所述提取并定量测定普那霉素。结果表明在所用发酵条件下突变株SP92 hpaA∷ΩamR在发酵24、28和32小时没有产生PI，而对照菌株在三个测试时间下产生了标准的PI。这两个菌株产生的PII量保持相同。突变株SP92hpaA∷ΩamR的PI生物合成步骤之一被完全阻断。在16小时后向生产培养基中分别或同时加入不同的PI前体进行补充发酵试验。当向发酵培养基中加入100mg/l 3-羟基-吡啶甲酸时，突变株产生与对照株PI产量相当的PIA。只有加入3-羟基吡啶甲酸才能补充突变株SP92hpaA∷ΩamR这一事实说明hpaA基因参与该前体的合成。
该突变株的构建使得产生了一种这样的始旋链霉菌菌株，其PI生产能力被突变，但在前体3-HPA存在下能够产生与出发菌株产量相当的PI。与前述实施例相同，可望用这样的突变株在原始前体存在下产生在3-羟基吡啶甲酸残基上修饰的新普那霉素。
实施例3通过突变体SP92∷pVPC 508制备化合物I该实施例描述在基因papA中由于整合了质粒pVRC 508而被断裂的始旋链霉菌SP92的突变体在被加入生产培养基中的前体存在下合成新型链阳性菌素的方法。这些前体可以衍生自氨基酸，更具体地衍生自苯基丙氨酸，以及α-酮基羧酸，更具体地衍生自苯基丙酮酸。
突变体SP92∷pVRC 508被培养于液体生产培养基中，按照下述方式进行发酵将上述菌株的孢子悬浮液0.5ml在无菌条件下加入40ml处于300ml带挡板的锥形瓶中的种子培养基中。种子培养基中含有10g/l玉米浆、15g/l蔗糖、10g/l(NH4)2SO4、1g/lK2HPO4、3g/lNaCl、0.2g/lMgSO4·7H2O和1.25g/lCaCO3。在导入CaCO3之前通过加苏打将pH调至6.9。于27℃用旋转搅拌器以325转/分的速度将锥形瓶搅拌44小时。将上述老化44小时的培养物2.5ml于无菌条件下加入处于300ml锥形瓶中的30ml生产培养基中，该生产培养基含25g/l大豆粉、7.5g/l淀粉、22.5g/l葡萄糖，3.5g/l饲料酵母、0.5g/l硫酸锌和6g/lCaCO3。于导入CaCO3之前通过加入盐酸将pH调至6.0。于27℃用旋转搅拌器以325转/分的速度搅拌锥形瓶。16小时后，将1ml表3列举的前体之一的溶液(通常为5或10g/l)加入培养物中。8或24小时后终止该过程。计量发酵液体积，向其中加入2体积由34％乙腈和66％0.1M KH2PO4(通过加入浓H3PO4将pH值调至2.9)组成的流动相，以便提取普那霉素。搅拌后，进行离心分离并且按照实施例4所述内容提取和提纯上清液中所含的普那霉素。借助CLHP通过将150μl离心上清液注入Nucleosil 5-C8(4.6×150mm)柱中，用由40％乙腈和60％0.1M pH＝2.9磷酸缓冲液组成的混合物洗提来测定普那霉素剂量。借助206mm处的紫外吸收与可能有的荧光放射(过滤370nm，于306nm处激活)检测新普那霉素。
表III



下表参照PIA说明新型PI产物的相对保留时间。于25℃在上述CLHP体系中确定绝对保留时间；该时间随着一部分被注入另一部分以及依据另一部分的温度而略有变化。
表IV


对于4-异丙基苯基丙氨酸来说，tR＝4.35的新型PI对应于实施例14中所述的新PIE。
对于4-甲硫基苯基丙氨酸来说，tR＝1.63的新型PI对应于实施例5所述的5γ-羟基新PIH。
另外，突变体SP92∷pVRC 508在4-二甲基胺基苯基丙氨酸存在下被发酵。在此互补作用条件下，突变体SP92∷pVRC 508产生的普那霉素IA的数量等于由菌株SP92产生的数量。
实施例4制备普那霉素IB〔4ζ-甲胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA〕和4ζ-氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA4.1制备普那霉素IB〔4ζ-甲胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA〕如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例34-1合成的4-甲胺基苯基丙氨酸(R，S)的10g/l水溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IB的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于6ml由65％水与35％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC810×250mm(Macherey Nagel)，用由65％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和35％乙腈形成的混合物洗提。合并含普那霉素IB的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到52mg普那霉素IB。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.71(dd，J＝16和6Hz，1H，5β2)，0.92(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.10～1.40(mt，2H3β2和3γ2)，1.34(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.50～1.85(mt，3H3γ1和CH22β)，2.03(mt，1H，3β1)，2.22(mt，1H，5δ2)，2.33(d宽，J＝16Hz，1H5δ1)，2.40(d，J＝16Hz，1H5β1)，2.82(mt，1H5ε2)，2.81(s，3H4NCH3处于苯基对位)，2.90(dd，J＝12和4Hz，1H4β2)，3.29(s，3H4NCH3)，de3.20～3.45和3.60(2mts，1HCH23δ)，3.40(t，J＝12Hz，1H4β1)，4.57(dd，J＝7和8Hz，1H，3α)，4.75(dd宽，J＝13和7Hz，1H5ε1)，4.83(mt，1H2α)，4.89(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.24(dd，J＝12和4Hz，1H4α)，5.32(d宽，J＝6Hz，1H5α)，5.89(d，J＝9Hz，1H6α)，5.90(q宽，J＝7.5Hz，1H1β)，6.53(d，J＝9Hz，1HNH2)，6.53(d，J＝8Hz，2H4ε)，7.03(d，J＝8Hz，2H4δ)，de7.10～7.35(mt，5HH芳族6)，7.46(mt，2H1′H5和1′H4)，7.85(dd，J＝5.5和2Hz，1H1′H6)，8.44(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.76(d，J＝9Hz，1HNH6)，11.63(s，1HOH).
4.2制备4ζ-氨基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IA
如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml 4-甲胺基苯基丙氨酸(S)的5g/l水溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于6ml由65％水与35％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由65％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和35％乙腈形成的混合物洗提。合并含新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到50mg 4ζ-氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.72(dd，J＝16和5.5Hz，1H，5β2)，0.90(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.10～1.40(mt，2H3β2和3γ2)，1.33(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.50～1.85(mt，3H3γ1和CH22β)，2.02(mt，1H，3β1)，2.19(mt，1H，5δ2)，2.33(d宽，J＝16Hz，1H5δ1)，2.42(d，J＝16Hz，1H5β1)，2.81(dt，J＝13和4Hz，1H5ε2)，2.90(dd，J＝12和4Hz，1H4β2)，3.24(s，3HNCH34)，3.20～3.40和3.54(2mts，1HCH23δ)，3.30(t，J＝12Hz，1H4β1)，3.72(mf，2HArNH2)，4.54(dd，J＝7.5和7Hz，1H，3α)，4.73(dd宽，J＝13和8Hz，1H5ε1)，4.82(mt，1H2α)，4.89(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.22(dd，J＝12和4Hz，1H4α)，5.32(d宽，J＝5.5Hz，1H5α)，5.89(mt，2H6α和1β)，6.51(d，J＝9.5Hz，1HNH2)，6.61(d，J＝8Hz，2H4ε)，6.98(d，J＝8Hz，2H4δ)，7.15～7.35(mt，5HH芳族6)，7.45(dd，J＝8.5和1.5Hz，1H1′H4)，7.48(dd，J＝8.5和4Hz，1H1′H5)，7.82(dd，J＝4和1.5Hz，1H1′H6)，8.43(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.76(d，J＝9.5Hz，1HNH6)，11.63(s，1HOH).
实施例5制备4ζ-甲硫基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IA、4ζ-甲硫基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IH和5γ-羟基-4ζ-甲硫基-脱(4-二甲氨基)普那霉素IH如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例34-3合成的4-甲硫基苯基丙氨酸(R，S)的10g/l0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。65mg干燥残余物被溶于6ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其分2次注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由55％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和45％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到45mg 4ζ-甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.68(dd，J＝16和5.5Hz，1H，5β2)，0.93(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.13(mt，1H3β2)，1.25～1.40(mt，1H3γ2)，1.33(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.55～1.85(mt，3H3γ1和CH22β)，2.02(mt，1H，3β1)，2.18(mt，1H，5δ2)，2.38(d宽，J＝16.5Hz，1H5δ1)，2.46(s，3HSCH3)，2.48(d，J＝16Hz，1H，5β1)，2.85(dt，J＝13.5和4Hz，1H5ε2)，3.00(dd，J＝12和5Hz，1H4β2)，3.23(s，3HNCH34)，3.37(t，J＝12Hz，1H4β1)，3.37和3.58(2mts，1HCH23δ)，4.55(t，J＝7.5Hz，1H，3α)，4.77(dd宽，J＝13.5和8Hz，1H5ε1)，4.86(mt，1H2α)，4.89(dd，J＝10和1.5Hz，1H1α)，5.30(d宽，J＝5.5Hz，1H5α)，5.32(dd，J＝12和5Hz，1H4α)，5.90(d，J＝9.5Hz，1H6α)，5.92(dq，J＝7.5和1.5Hz，1H1β)，6.55(d，J＝9.5Hz，1HNH2)，7.13(d，J＝8Hz，2H4δ)，7.15～7.35(mt，5HH芳族6)，7.19(d，J＝8Hz，2H4ε)，7.45(mt，2H1′H4和1′H5)，7.76(t，J＝5Hz，1H1′H6)，8.42(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.76(d，J＝9.5Hz，1HNH6)，11.65(s，1HOH).
以来自上述二氧化硅柱的含有普那霉素IH的新型衍生物的馏分为原料，采用洗提液相中乙腈比例为50％的上述半制备柱色谱分离10mg 4ζ-甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.32(mt，1H，5β2)，0.93(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.20～1.35(mt，2H3β2et 3γ2)，1.30(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.35～2.05(mt，9H3γ1-3β1-CH22β-CH25δ-CH2
5γ和5β1)，2.44(dt，J＝13.5和1.5Hz，1H5ε2)，2.49(s，3HSCH3)，2.99(dd，J＝12和5Hz，1H4β2)，3.09(dd，J＝12.5和12Hz，1H4β1)，3.54和3.64(2mts，1HCH23δ)，4.17(dd，J＝7和6Hz，1H3α)，4.49(d宽，J＝13.5Hz1H5ε1)，4.70～4.80(mt，3H2α-5α和4α)，4.84(dd，J＝10和1.5Hz，1H1α)，5.51(d，J＝7Hz，1H6α)，5.73(mt，1H1β)，6.65(d，J＝9.5Hz，1HNH2)，7.10(d，J＝8Hz，2H4δ)，7.22(d，J＝8Hz，2H4ε)，7.20～7.40(mt，7HH芳族ques 6-1′H4和1′H5)，7.87(d，J＝4Hz，1H1′H6)，8.55(mf，1HNH6)，8.55(d，J＝10Hz，1HNH1)，11.70(s，1HOH).
以来自上述二氧化硅柱的含有普那霉素的新型衍生物的馏分为原料，采用洗提液相中乙腈比例为45％的上述半制备柱色谱分离3mg 5γ-羟基-4ζ-甲硫基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IH。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)观察到明显占优势的异构体-OH 5γ轴的位置0.37(dmt，J＝16Hz，1H，5β2)，0.93(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.20～1.45(mt，2H3β2和3γ2)，1.31(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.40～1.85(mt，5H3γ1-CH22β和CH25δ)，1.98(mt，1H，3β1)，2.17(d，J＝16Hz，1H5β1)，7.50(s，3HSCH3)，2.77(dt，J＝13.5和2Hz，1H5ε2)，2.99(dd，J＝12和4Hz，1H4β2)，3.11(t，J＝12Hz，1H4β1)，3.45～3.70(mt，2HCH23δ)，3.73(mt，1H5γ处于平伏位置)，4.13(t，J＝7Hz，1H，3α)，4.37(d宽，J＝13.5Hz，1H5ε1)，4.75～4.95(mt，3H2α-4α和5α)，4.89(dd，J＝10和1Hz，1H1α)，5.70(d，J＝8Hz，1H6α)，5.80(dq，J＝7.5和1Hz，1H1β)，6.37(d，J＝5Hz，1HNH4)，6.71(d，J＝10Hz，1HNH2)，7.10(d，J＝8Hz，2H4δ)，7.22(d，J＝8Hz，2H4ε)，7.20～7.40(mt，5HH芳族6)，7.43(dd，J＝8.5和1.5Hz，1H1′H4)，7.47(dd，J＝8.5和4Hz，1H1′H5)，7.89(dd，J＝4和1.5Hz，1H1′H6)，8.55(d，J＝10Hz，1HNH1)，9.15(d，J＝8Hz，1HNH6)，11.70(s，1HOH).
实施例6制备4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA和4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IH如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml 4-甲苯基丙氨酸(R，S)的5g/l0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。49mg干燥残余物被溶于6ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其分2次注入半制备柱Nucleosil 7μ C8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由55％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和45％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到44mg 4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱.1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.52(dd，J＝16和6Hz，1H，5β2)，0.93(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.15(mt，1H3β2)，1.20～1.40(mt，1H3γ2)，1.35(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.50～1.85(mt，3H3γ1和CH22β)，2.04(mt，1H，3β1)，2.18(mt，1H，5δ2)，2.25～2.45(mt，2H5δ1和5β1)，2.36(s，3HArCH3)，2.83(dt，J＝13和4Hz，1H5ε2)，2.99(dd，J＝13和4Hz，1H4β2)，3.28(s，3HNCH34)，3.31和3.59(2mts，1HCH23δ)，3.40(t，J＝13Hz，1H4β1)，4.59(t，J＝7.5Hz，1H，3α)，4.74(dd宽，J＝13和7Hz，1H5ε1)，4.85(mt，1H2α)，4.89(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.25～5.35(mt，2H5α和4α)，5.85～5.95(mt，2H6α和1β)，6.52(d，J＝9.5Hz，1HNH2)，7.14(ABlimite，J＝9Hz，4H4δ和4ε)，7.15～7.35(mt，5HH芳族6)，7.50(mt，2H1′H4和1′H5)，7.81(dd，J＝4和2Hz，1H1′H6)，8.41(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.74(d，J＝9Hz，1HNH6)，11.63(s，1HOH).
以来自上述二氧化硅柱的含有普那霉素IH的新型衍生物的馏分为原料，借助上述半制备柱色谱分离21mg 4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IH(质谱M＋H+＝810)。
实施例7制备4ζ-甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用12个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml 4-甲氧苯基丙氨酸(R，S)的5g/l0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自12个锥形瓶的0.35升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。14mg干燥残余物被溶于3ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μ C8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由60％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和40％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到12mg 4ζ-甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，d ppm，ref.TMS)0.63(dd，J＝16和5.5Hz，1H，5β2)，0.96(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.17(mt，1H3β2)，1.30～1.45(mt，1H3γ2)，1.38(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.55～1.85(mt，3H3γ1和CH22β)，2.05(mt，1H，3β1)，2.20(mt，1H，5δ2)，2.40(d宽，J＝16Hz，1H5δ1)，2.47(d，J＝16Hz，1H5β1)，2.88(dt，J＝13和4Hz，1H5ε2)，2.99(dd，J＝12.5和5Hz，1H4β2)，3.30(s，3HNCH34)，3.32和3.60(2mts，1HCH23δ)，3.40(t，J＝12.5Hz，1H4β1)，3.80(s，3HOCH3)，4.60(t，J＝7.5Hz，1H，3α)，4.80(dd宽，J＝13和8.5Hz，1H5ε1)，4.88(mt，1H2α)，4.92(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.31(dd，J＝12.5和5Hz，1H4α)，5.34(d宽，J＝5.5Hz，1R5α)，5.90(d，J＝9Hz，1H46α)，5.93(q宽，J＝7.5Hz，1H1β)，6.54(d，J＝9Hz，1HNH2)，6.87(d，J＝8Hz，2H4ε)，7.16(d，J＝8Hz，2H4δ)，7.15～7.40(mt，5HH芳族6)，7.50(mt，2H1′H5和1′H4)，7.80(dd，J＝4和2.5Hz，1H1′H6)，8.43(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.78(d，J＝9Hz，1HNH6)，11.65(s，1HOH).
实施例8制备4ζ-甲氧羰基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IA如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例33合成的4-甲氧苯基丙氨酸(R，S)的10g/l溶液。培养24小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。14mg干燥残余物被溶于3ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由55％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和45％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到9mg 4ζ-甲氧羰基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.70(dd，J＝16和6Hz，1H，5β2)，0.93(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.08(mt，1H3β2)，1.30～1.40(mt，1H3γ2)，1.33(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.55～1.85(mt，3H3γ1和CH22β)，2.02(mt，1H，3β1)，2.13(mt，1H，5δ2)，2.40(d宽，J＝16.5Hz，1H5δ1)，2.48(d，J＝16Hz，1H，5β1)，2.89(dt，J＝14.5和4.5Hz，1H5ε2)，3.10(dd，J＝13.5和6Hz，1H4β2)，3.24(s，3HNCH34)，3.38和3.61(2mts，1HCH23δ)，3.47(t，J＝13.5Hz，1H4β1)，3.96(s，3HCOOCH3)，4.55(t，J＝75Hz，1H，3α)，4.78(dd宽，J＝14.5和8Hz，1H5ε1)，4.86(mt，1H2α)，4.89(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.33(d宽，J＝6Hz，1H5α)，5.42(dd，J＝13.5和6Hz，1H4α)，5.92(d(J＝9.5Hz)和mt，1H 6α和1β)，6.52(d，J＝10Hz，1HNH2)，7.15～7.35(mt，5HH芳族6)，7.28(d，J＝8Hz，2H4δ)，7.43(dd，J＝9和1.5Hz，1H1′H4)，7.47(dd，J＝9和5Hz，1H1′H5)，7.66(d，J＝5和1.5Hz，1H1′H6)，7.98(d，J＝8Hz，2H4ε)，8.38(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.76(d，J＝9.5Hz，1HNH6)，11.70(s，1HOH).
实施例94ζ-氯-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml 4-氯苯基丙氨酸(R，S)的10g/l0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于3ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由60％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和40％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到1mg 4ζ-氯-脱(4ζ-二甲基胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.93(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，0.95(dd，J＝16和5Hz，1H，5β2)，1.09(mt，1H3β2)，1.20～1.40(mt，1H3γ2)，1.35(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.50～1.85(mt，3H3γ1和CH22β)，2.02(mt，1H，3β1)，2.17(mt，1H，5δ2)，2.43(d宽，J＝16Hz，1H5δ1)，2.59(d，J＝16Hz，1H，5β1)，2.90(dt，J＝13.5和4Hz，1H5ε2)，3.04(dd，J＝13和6Hz，1H4β2)，3.21(s，3H4NCH3)，3.36(t，J＝13Hz，1H4β1)，3.39和3.59(2mts，1HCH23δ)，4.53(t，J＝7.5Hz，1H，3α)，4.76(dd宽ge，J＝13.5和8Hz，1H5ε1)，4.86(mt，1H2α)，4.87(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.38(mt，2H5α和4α)，5.93(mt，2H6α和1β)，6.52(d，J＝10Hz，1HNH2)，7.12(d，J＝8Hz，2H4δ)，7.15～7.35(mt，7HH芳族6和4ε，7.38(dd，J＝9和4.5Hz，1H1′H5)，7.43(d宽，J＝9Hz，1H1′H4)，7.68(dd，J＝4.5和1Hz，1H1′H6)，8.36(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.75(d，J＝9Hz，1HNH6)，11.65(s，1HOH).
实施例10制备4ζ-溴-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA和4ζ-溴-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml 4-氯苯基丙氨酸(R，S)的10g/l0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于6ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其分2次注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由60％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和40％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到6mg 4ζ-溴-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.93(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，0.95(dd，J＝16和5Hz，1H，5β2)，1.10(mt，1H3β2)，1.35(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.36(mt，1H3γ2)，1.50～1.85(mt，3H3γ1和CH22β)，2.02(mt，1H，3β1)，2.18(mt，1H，5δ2)，2.43(d宽，J＝16Hz，1H5δ1)，2.59(d，
J＝16Hz，1H，5β1)，2.90(dt，J＝13和4Hz，1H5ε2)，3.02(dd，J＝13和5.5Hz，1H4β2)，3.21(s，3H4NCH3)，3.33(dd，J＝13-11Hz，1H4β1)，3.39和3.59(2mts，1HCH23δ)，4.53(t，J＝7.5Hz，1H，3α)，4.76(dd宽，J＝13和7Hz，1H5ε1)，4.86(mt，1H2α)，4.89(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.37(d宽，J＝5Hz，1H5α)，5.39(dd，J＝11和5.5Hz，1H4α)，5.92(mt，2H6α和，1β)，6.56(d，J＝9.5Hz，1HNH2)，7.08(d，J＝8Hz，2H4δ)，de7.15～7.35(mt，5HH芳族6)，7.40(mt，4H1′H4-1′H5和4ε)，7.70(d宽，J＝5Hz，1H1′H6)，8.40(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.77(d，J＝9Hz，1HNH6)，11.68(s，1HOH).
以来自上述二氧化硅柱的含有普那霉素IH的新型衍生物的馏分为原料，借助上述半制备柱色谱分离3mg 4ζ-溴-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IH(质谱M＋H+＝874)。
实施例11制备4ζ-碘-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA和4ζ-碘-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml 4-碘苯基丙氨酸(R，S)的10g/l0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于6ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其分2次注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由60％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和40％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到12mg 4ζ-碘-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.93(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，0.95(dd，J＝16和5.5Hz，1H，5β2)，1.10(mt，1H3β2)，1.35(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.38(mt，1H3γ2)，1.55～1.85(mt，3H3γ1和CH22β)，2.02(mt，1H，3β1)，2.17(mt，1H，5δ2)，2.43(d宽，J＝16.5Hz，1H5δ1)，2.60(d，J＝16Hz，1H，5β1)，2.89(dt，J＝14和4.5Hz，1H5ε2)，3.02(dd，J＝13和5.5Hz，
1H4β2)，3.21(s，3HNCH34)，3.31(dd，J＝13和11Hz，1H4β1)，3.39和3.59(2mts，1HCH23δ)，4.53(t，J＝7.5Hz，1H，3α)，4.75(dd宽，J＝14和8Hz，1H5ε1)，4.83(mt，1H2α)，4.88(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.37(d宽，J＝5.5Hz，1H5α)，5.39(dd，J＝11和5.5Hz，1H4α)，5.92(mt，2H6α和1β)，6.54(d，J＝9.5Hz，1HNH2)，6.94(d，J＝7.5Hz，2H4δ)，7.15～7.50(mt，5HH芳族6)，7.36(dd，J＝9和4Hz，1H1′H5)，7.43(d宽，J＝9Hz，1H1′H4)，7.62(d，J＝7.5Hz，2H4ε)，7.68(d，J＝4Hz，1H1′H6)，8.38(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.76(d，J＝9Hz，1HNH6)，11.60(s，1HOH).
以来自上述二氧化硅柱的含有普那霉素IH的新型衍生物的馏分为原料，借助上述半制备柱色谱分离6mg 4ζ-碘-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IH(质谱M＋H+＝922)。
实施例12制备4ζ-三氟甲基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IA和4ζ-三氟甲基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IH。
如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml 4-三氟甲基苯基丙氨酸(S)的5g/l0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于3ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由55％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和45％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到5mg 4ζ-三氟甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.86(dd，J＝16和5.5Hz，1H，5β2)，0.91(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.13(mt，1H3β2)，1.31(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.42(mt，1H3γ2)，1.55～1.80(mt，3H3γ1和CH22β)，2.02(mt，1H，3β1)，2.15(mt，1H，5δ2)，2.40(d宽，J＝16.5Hz，1H5δ1)，2.55(d，J＝16Hz，1H，5β1)，2.88(dt，J＝14和4Hz，1H5ε2)，3.18(s，3HNCH34)，3.20
和3.31(2dd，J＝13和6Hz和J＝13和10Hz，，1H4β2和4β1)，3.42 et 3.60(2mts，1HCH23δ)，4.50(t，J＝7.5Hz，1H，3α)，4.73(dd宽，J＝14和7.5Hz，1H5ε1)，4.83(mt，1H2α)，4.91(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.40(d宽，J＝5.5Hz，1H5α)，5.55(dd，J＝10和6Hz，1H4α)，5.87(d，J＝9.5Hz，1H6α)，5.90(q宽，J＝7.5Hz，1H1β)，6.68(d，J＝9.5Hz，1HNH2)，7.15～7.40(mt，9H4δ-H芳族6-1′H5和1′H4)，7.52(d，J＝8Hz，2H4ε)，7.68(d，J＝4和1.5Hz，1H1′H6)，8.43(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.76(d，J＝9.5Hz，1HNH6)，11.70(s，1HOH).
以来自上述二氧化硅柱的含有普那霉素IH的新型衍生物的馏分为原料，借助上述半制备柱色谱分离4mg 4ζ-三氟甲基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IH(质谱M＋H+＝864)。
实施例13制备4ζ-叔丁基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例35-1合成的4-叔丁基苯基丙氨酸(R，S)的5g/l0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由55％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和45％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到30mg 4ζ-叔丁基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS，ref.TMS)0.21(dd，J＝16和5.5Hz，1H，5β2)，0.91(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.17(mt，1H3β2)，1.20～1.40(mt，1H3γ2)，1.33(s，9H叔丁基的CH3)，1.35(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.50～1.85(mt，3H3γ1和CH22β)，2.04(mt，1H，3β1)，2.13(mt，1H，5δ2)，2.30(mt，2H5δ1和5β1)，2.80(dt，J＝13和4Hz，1H5ε2)，3.00(dd，J＝
12和4Hz，1H4β2)，3.29(s，3HNCH34)，3.31和3.59(2mts，1HCH23δ)，3.40(t，J＝12Hz，1H4β1)，4.57(t，J＝7.5Hz，1H，3α)，4.74(dd宽，J＝13和7Hz，1H5ε1)，4.85(mt，1H2α)，4.90(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.21(d宽，J＝5.5Hz，1H5α)，5.25(dd，J＝12和4Hz，1H4α)，5.87(d，J＝9Hz，1H6α)，5.92(q宽，J＝7.5Hz，1H11H1′H6)，8.45(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.74(d，J＝9Hz，1HNH6)，11.65(s，1HOH).
实施例14制备4ζ-异丙基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IA和4ζ-异丙基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IE如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例36-1合成的4-异丙基苯基丙氨酸(R，S)的10g/l0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。61mg干燥残余物被溶于9ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其分三次注入半制备柱Nucleosil 7μ C8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由55％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和45％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到51mg 4ζ-异丙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(250MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS，ref.TMS)0.31(dd，J＝16和5.5Hz，1H，5β2)，0.91(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.00～1.45(mt，2H3β2和3γ2)，1.25(d，J＝7.5Hz，6H异丙基的CH3)，1.35(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.50～1.85(mt，3H3γ1和CH22γ)，1.95～2.20(mt，2H，3β1和5δ2)，2.30(mt，2H5δ1和5β1)，2.80(dt，J＝13和4Hz，1H5ε2)，2.88(mt，1HC异丙基的CH)，2.98(dd，J＝12和4Hz，1H4β2)，3.30(s，3HNCH34)，3.32和3.55(2mts，1HCH23δ)，3.38(t，J＝12Hz，1H4β1)，4.55(t，J＝7.5Hz，1H，3α)，4.72(dd宽，J＝13和7Hz，1H5ε1)，4.85(mt，1H2α)，4.88(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.21(d宽，J＝5.5Hz，1H5α)，5.25(dd，J＝12和4Hz，1H4α)，
5.87(d，J＝9Hz，1H6α)，5.90(q宽，J＝7.5Hz，1H1β)，6.50(d，J＝9.5Hz，1HNH2)，7.05～7.35(mt，9HH芳族6-4ε和4δ)，7.50(mt，2H1′H5和1′H4)，7.86(dd，J＝4和1.5Hz，1H1′H6)，8.40(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.72(d，J＝9Hz，1HNH6)，11.60(s，1HOH).
以来自上述硅胶柱的同样含有普那霉素IE的新型衍生物的同种馏分为原料，借助上述半制备柱进行色谱提纯，分离得到5mgζ-异丙基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IE。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.20(mt，1H，5β2)，0.92(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.15～1.40(mt，2H3β2和3γ2)，1.24(d，J＝7.5Hz，6HCH3于异丙基上)，1.34(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.35～2.05(mt，9H3γ1-3β1-CH22β-CH25δ-CH25γ和5β1)，2.45(dt，J＝13和1.5Hz，1H5ε2)，2.89(mt，1HArCH)，3.09(dd，J＝14和7Hz，1H4β2)，3.17(s，3HNCH34)，3.25(dd，J＝14和9Hz，1H4β1)，3.32和3.52(2mts，1HCH23δ)，4.55(mt，2H3α和5ε1)，4.80(mt，1H2α)，4.89(dd，J＝10和1.5Hz，1H1α)，4.90(mt，1H5α)，5.35(dd，J＝9和7Hz，1H4α)，5.60(d，J＝8Hz，1H6α)，5.89(dq，J＝7.5和1.5Hz，1H1β)，6.65(d，J＝9.5Hz，1HNH2)，7.08(d，J＝8Hz，2H4δ)，7.14(d，J＝8Hz，2H4ε)，7.20～7.40(mt，7HH芳族6-1′H4和1′H5)，7.77(d宽，J＝4Hz，1H1′H6)，8.46(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.48(d，J＝8Hz，1HNH6)，11.70(s，1HOH).
实施例15制备4ε-甲胺基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IA如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例35-3合成的3-甲胺基苯基丙氨酸(R，S)的10g/l水溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。19mg干燥残余物被溶于3ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由55％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和45％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到8mg 4ε-甲胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.93(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.00(dd，J＝16和6Hz，1H，5β2)，1.17(mt，1H3β2)，1.25～1.40(mt，2H3γ2)，1.35(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.55～1.80(mt，3H3γ1和CH22β)，2.03(mt，1H，3β1)，2.23(mt，1H，5δ2)，2.39(d宽J＝16Hz，1H5δ1)，2.52(d，J＝16Hz，1H5β1)，2.78(s，3HArNCH34)，2.85(dt，J＝13和4Hz，1H5ε2)，2.99(dd，J＝13和4.5Hz，1H4β2)，3.23(s，3HNCH34)，3.25(t，J＝13Hz，1H4β1)，3.38和3.58(2mts，1HCH23δ)，4.05(mf，1HArNH)，4.58(dd，J＝6.5和7.5Hz，1H，3α)，4.76(dd宽，J＝13和8Hz，1H5ε1)，4.85(mt，1H2α)，4.87(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.35(dd，J＝13和4.5Hz，1H4α)，5.38(d宽，J＝6Hz，1H5α)，5.90(d，J＝9.5Hz，1H6α)，5.91(mt，1H1β)，6.36(s宽，1HH2芳族4)，6.45 ～6.55(mt，2HH4和H6芳族4)，6.53(d，J＝10Hz，1HNH2)，7.12(t，J＝8Hz，1HH5芳族4)，7.15～7.45(mt，5HH芳族6)，7.35(mt，2H1′H4和1′H5)，7.75(t，J＝3Hz，1H1′H6)，8.40(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.78(d，J＝9.5Hz，1HNH6)，11.60(s，1HOH).
实施例16制备4ε-甲氧基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IA和4ε-甲氧基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IH如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml 3-甲氧基苯基丙氨酸(S)的5g/l 0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2C12提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。41mg干燥残余物被溶于6ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其分二次注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由55％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和45％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到28mg 4ε-甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱.1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.52(dd，J＝16和5.5Hz，1H，5β2)，0.90(t，J＝7.5Hz，3HCH32γ)，1.10～1.34(mt，2H3β2和3γ2)，1.34(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.50～1.80(mt，3H3γ1和CH22β)，2.04(mt，1H，3β1)，2.20(mt，1H，5δ2)，2.35(d宽，J＝16Hz，1H5δ1)，2.38(d，J＝16Hz，1H5β1)，2.83(dt，J＝13和4Hz，1H5ε2)，2.97(dd，J＝12和4Hz，1H4β2)，3.28(s，3HNCH34)，3.28和3.56(2mts，1HCH23δ)，3.40(t，J＝12Hz，1H4β1)，3.80(s，3HOCH3)，4.58(t，J＝7.5Hz，1H，3α)，4.76(dd宽，J＝13和8Hz，1H5ε1)，4.85(mt，1H2α)，4.90(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.27(dd，J＝12和4Hz，1H4α)，5.30(d宽，J＝5.5Hz，1H5α)，5.89(d，J＝9.5Hz，1H6α)，5.91(q宽，J＝7.5Hz，1H1β)，6.51(d，J＝10Hz，1HNH2)，6.80～6.90(mt，3HH2-H4和H6芳族4)，7.15～7.40(mt，6HH5芳族4和H芳族6)，7.45(d宽，J＝9Hz，1H1′H4)，7.50(dd，J＝9和4Hz，1H1′H5)，7.80(d宽，J＝4Hz，1H1′H6)，8.40(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.73(d，J＝9.5Hz，1HNH6)，11.62(s，1HOH).
以来自上述二氧化硅柱的含有普那霉素IH的新型衍生物的馏分为原料，借助上述半制备柱色谱分离7mg 4ε-甲氧基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IH(质谱M＋H+＝826)。
实施例17制备4ε-氟-4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IA如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例34-5合成的3-氟-4-甲苯基丙氨酸(R，S)的10g/l 0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。15mg干燥残余物被溶于3ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由55％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和45％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到9mg 4ε-氟-4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0.60(dd，J＝16和5.5Hz，1H，5β2)，0.91(t，J＝7.5Hz，3HCH22γ)，1.12(mt，1H3β2)，1.25 1.35(mt，1H3γ2)，1.33(d，J＝7.5Hz，3HCH31γ)，1.50～1.85(mt，3H3γ1和CH22β)，2.02(mt，1H，3β1)，2.13(mt，1H，5δ2)，2.27(s，3HArCH3)，2.36(d宽，J＝16Hz，1H5δ1)，2.45(d，J＝16Hz，1H5β1)，2.85(dt，J＝13和4.5Hz，1H5ε2)，2.97(dd，J＝12.5和4.5Hz，1H4β2)，3.23(s，3HNCH34)，3.30和3.56(2mts，1HCH23δ)，3.37(t，J＝12.5Hz，1H4β1)，4.55(t，J＝7.5Hz，1H，3α)，4.75(dd宽，J＝13和8Hz，1H5ε1)，4.83(mt，1H2α)，4.89(d宽，J＝10Hz，1H1α)，5.29(dd，T＝12.5和4.5Hz，1H4α)，5.32(d宽，J＝5.5Hz，1H5α)，5.89(d，J＝9.5Hz，1H6α)，5.92(mt，1H1β)，6.49(d，J＝10Hz，1HNH2)，6.90(mt，2HH2和H6芳族4)，7.11(t，J＝8Hz，1HH5芳族4)，7.10～7.30(mt，5HH芳族6)，7.43(dd，J＝8.5和1Hz，1H1′H4)，7.49(dd，J＝8.5和4.5Hz，1H1′H5)，7.75(dd，J＝4.5和1Hz，1H1′H6)，8.48(d，J＝10Hz，1HNH1)，8.70(d，J＝9.5Hz，1HNH6)，11.60(s，1HOH).
实施例18制备4ζ-乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用50个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例33合成的4-乙胺基苯基丙氨酸(R，S)的二盐酸化物的20g/l 0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自50个锥形瓶的1.5升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由65％水与35％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(MachereyNagel)，用由60％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和40％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到10mg 4ζ-乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz CDCl3，δppm，ref.TMS)0，72(dd，J＝
16和6Hz，1H1H CH25β)；0，90(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，15(mt，1H1H CH23β)；1，20～1，40(mt，1H1H CH23γ)；1，27(t，J＝7，5Hz，3HCH3在乙基上)；1，33(d，J＝7Hz，3HCH31γ)；1，50～1，65(mt，1H另一个H CH2en 3γ)；1，60 et 1，74(2mts，1HCH22β)；2，02(mt，1H另一个H CH23β)；2，21和2，33(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，40(d，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，82(dt，J＝13和4，5Hz，1H1H CH25ε)；2，89(dd，J＝12和4Hz，1H1H CH24β)；3，10(mt，2HNCH2在乙基上)；3，20～3，35(mt，1H1H CH23δ)；3，26(s，3HNCH3)；3，31(t，J＝12Hz，1H另一个H CH24β)；3，54(mt，1H另一个H CH23δ)；3，67(mf，1HNH)；4，56(dd，J＝6，5和7Hz，1H3α)；4，75(dd宽，J＝13和8Hz，1H另一个H(CH25ε)；4，84(mt，1H2α)；4，90(d宽，J＝10Hz，1H1α)；5，24(dd，J＝12和4Hz，1H4α)；5，32(d宽，J＝6Hz，1H5α)；5，88(d，J＝9，5Hz，1H6α)；5，90(mt，1H1β)；6，52(d，J＝8Hz，3HNH 2和H芳族4ε)；7，00(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)；7，10～7，35(mt，5HH芳族6)；7，46(AB明显，2H1′H4和1′H5)；7，84(dd，J＝4和1Hz，1H1′H6)；8，45(d，J＝10Hz，1HNH1)；8，77(d，J＝9，5Hz，1HNH6)；11，65(s，1HOH).
实施例19制备4ζ-二乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用50个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例33合成的4-二乙胺基苯基丙氨酸(R，S)的二盐酸化物的20g/l 0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自50个锥形瓶的1.5升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-二乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由68％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和32％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-二乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到50mg 4ζ-二乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，65(dd，J＝16和6Hz，1H1H CH25β)；0，90(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，14(t，J＝7Hz，6HCH3在乙基上)；1，15(mt，1H1H CH23β)；1，26(mt，1H1HCH23γ)；1，32(d，J＝6，5Hz，3HCH31γ)；1，55(mt，1H另一个HCH23γ)；1，63和1，75(2mts，1HCH22β)；2，02(mt，1H另一个HCH23β)；2，22和2，31(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，37(d，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，80(dt，J＝13和4，5Hz，1H1H CH25ε)；2，89(dd，J＝12，5和4Hz，1H1H CH24β)；3，20～3，40(mt，6HNCH2在乙基上-1H CH23δ和另一个H CH24β)；3，27(s，3HNCH3)；3，55(mt，1H另一个H CH23δ)；4，58(dd，J＝8和6Hz，1H3α)；4，76(dd宽，J＝13和7，5Hz，1H另一个H CH25ε)；4，84(mt，1H2α)；4，89(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，21(dd，J＝12，5和4Hz，1H4α)；5，28(d宽，J＝6Hz，1H5α)；5，87(d，J＝9，5Hz，1H6α)；5，90(mt，1H1β)；6，52(d，J＝9，5Hz，1HNH2)；6，60(d，J＝8Hz，2HH芳族4ε)；7，02(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)；7，10～7，35(mt，5HH芳族6)；7，46(AB明显的2H1′H4和1′H5)；7，88(dd，J＝4，5和2，5Hz，1H1′H6)；8，43(d，J＝10Hz，1HNH1)；8，76(d，J＝9，5Hz，1HNH en 6)；11，62(s，1HOH).
实施例20制备4ζ-二烯丙基胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用94个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例38-1合成的4-二烯丙基胺基苯基丙氨酸(R，S)的二盐酸化物的20g/l水溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自94个锥形瓶的2.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-二烯丙基胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IB的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由52％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和48％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-二烯丙基胺基-脱(4ζ-三甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到15mg 4ζ-二烯丙基胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，55(dd，J＝16和6Hz，1H1H du CH25β)；0，93(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，18(mt，1H1H CH23β)；1，25(mt，1H1H CH23γ)；1，34(dJ＝6，5Hz，3HCH31γ)；1，59(mt，1H另一个H CH23γ)；1，68和1，78(2mts，1HCH22β)；2，04(mt，1H另一个H du CH23β)；2，25和2，34(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，40(d，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，83(dt，J＝13和4，5Hz，1H1H CH25ε)；2，92(dd，J＝12和4Hz，1H1H CH24β)；3，20～3，30(mt，1H1HCH23δ)；3，29(s，3HNCH3)；3，33(t，J＝12Hz，1H另一个H CH24β)；3，57(mt，1H另一个H CH23δ)；3，93(AB明显，4HNCH2烯丙基上)；4，60(dd，J＝8和6，5Hz，1H3α)；4，78(dd宽，J＝13和7，5Hz，1H另一个H-CH2-5ε)；4，87(mt，1H2α)；4，92(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，10～5，25(mt，5H4α＝CH2烯丙基上)；5，28(d宽，J＝6Hz，1H5α)；5，85(mt，2HCH＝烯丙基上)；5，92(d，J＝9，5Hz，1H6α)；5，94(mt，1H1β)；6，54(d，J＝10Hz，1HNH en 2)；6，65(d，J＝8Hz，2HH芳族4ε)；7，05(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)；7，10～7，35(mt，5HH芳族6)；7，51(AB明显2H1′H4和1′H5)；7，88(dd，J＝4和2Hz，1H1′H6)；8，43(d，J＝10Hz，1HNH 1)；8，77(d，J＝9，5Hz，1HNH 6)；11，65(s，1HOH).
实施例21制备4ζ-烯丙基乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用26个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例39-4合成的4-烯丙基乙胺基苯基丙氨酸(R，S)的二盐酸化物的20g/l 0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自26个锥形瓶的0.78升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-烯丙基乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC810×250mm(Macherey Nagel)，用由52％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和48％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-烯丙基乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到20mg普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，58(dd，J＝16和6Hz，1H1H CH25β)；0，91(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，16(t，J＝7Hz，3HCH3在乙基上)；1，16(mt，1H1H CH23β)；1，25(mt，1H1HCH23γ)；1，32(d，J＝6，5Hz，3HCH31γ)；1，54(mt，1H另一个HCH23γ)；1，63和1，75(2mts，1HCH2en 2β)；2，02(mt，1H另一个HCH23β)；2，23和2，31(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，37(d，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，80(dt，J＝13和4，5Hz，1H1H CH25ε)；2，87(dd，J＝12和4Hz，1H1H CH24β)；3，15～3，30(mt，1H1H CH23δ)；3，26(s，3HNCH3)；3，30(t，J＝12Hz，1H另一个H CH24β)；3，36(mt，2HNCH2在乙基上)；3，54(mt，1H另一个HCH23δ)；3，90(AB明显2HNCH2烯丙基上)；4，57(dd，J＝8和6Hz，1H3α)；4，76(dd宽，J＝13和7，5Hz，1H另一个H CH25ε)；4，84(mt，1H2α)；4，89(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，05～5，20(mt，3H4α和＝CH2烯丙基上)；5，27(d宽，J＝6Hz，1H5α)；5，83(mt，1HCH＝烯丙基上)；5，88(d，J＝9，5Hz，1H6α)；5，91(mt，1H1β)；6，50(d，J＝10Hz，1HNH 2)；6，60(d，J＝8Hz，2HH芳族4ε)；7，02(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)；7，10～7，35(mt，5HH芳族6)；7，47(AB明显，2H1′H4和1′H5)；7，88(dd，J＝4和2Hz，1H1′H6)；8，41(d，J＝10Hz，1HNH 1)；8，75(d，J＝9，5Hz，1HNH 6)；11，62(s，1HOH).
实施例22制备4ζ-乙基丙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例39-6合成的4-乙基丙胺基苯基丙氨酸(R，S)的二盐酸化物的20g/l 0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-乙基丙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由63％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和37％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-乙基丙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到16mg 4ζ-乙基丙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核碰共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，67(dd，J＝16和6Hz，1H1H du CH25β)；0，91(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；0，95(t，J＝7，5Hz，3HCH3丙基)；1，14(t，J＝7Hz，3HCH3在乙基上)；1，15(mt，1H1H CH23β)；1，25(mt，1H1H CH23γ)；1，33(d，J＝7Hz，3HCH31γ)；1，45～1，65(mt，3H另一个H CH23γ和CH2丙基)；1，63和1，75(2mts，1HCH22β)；2，02(mt，1H另一个H CH23β)；2，23和2，33(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，37(d，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，80(dt，J＝13和5Hz，1H1HCH25ε)；2，89(dd，J＝12和4Hz，1H1H CH24β)；3，10～3，25(mt，3H1H CH23δ和NCH2丙基)；3，26(s，3HNCH3)；3，25～3，40(mt，2HNCH2乙基)；3，34(t，J＝12Hz，1H另一个H CH24β)；3，54(mt，1H另一个H CH23δ)；4，57(dd，J＝7，5和6Hz，1H3α)；4，76(dd宽，J＝13和7，5Hz，1H另一个H CH25ε)；4，84(mt，1H2α)；4，89(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，21(dd，J＝12和4Hz，1H4α)；5，28(d宽，J＝6Hz，1H5α)；5，88(d，J＝9，5Hz，1H6α)；5，91(mt，1H1β)；6，48(d，J＝10Hz，1HNH2)；6，60(d，J＝8Hz，2HH芳族4ε)；7，03(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)；7，10 7，35(mt，5HH芳族6)；7，47(AB明显2H1′H4和1′H5)；7，89(mt，1H1′H6)；8，42(d，J＝10Hz，1HNH1)；8，76(d，J＝9，5Hz，1HNH en 6)；11，62(s，1HOH).
实施例23制备4ζ-三氟甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例34-8合成的4-0-三氟甲基酪氨酸(R，S)的盐酸化物的20g/l水溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-三氟甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其分二次注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由60％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和40％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-三氟甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到46.5mg 4ζ-三氟甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，77(dd，J＝16和5，5Hz，1H1H CH25β)；0，92(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，08(mt，1H1H CH23β)；1，30～1，40(mt，1H1H CH23γ)；1，33(d，J＝7Hz，3HCH31γ)；1，55～1，70(mt，1H；另一个H CH23γ)；1，65和1，76(2mts，1HCH22β)；2，02(mt，1H另一个H CH23β)；2，11和2，40(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，54(d，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，88(dt，J＝13和4Hz，1H1H CH25ε)；3，08(dd，J＝12和5Hz，1H1H CH24β)；3，22(s，3HNCH3)；3，30～3，45(mt，1H1H CH23δ)；3，39(t，J＝12Hz，1H另一个H CH24β；3，59(mt，1H另一个H CH23δ)；4，53(t，J＝7，5Hz，1H3α)；4，75(dd宽，J＝13和8Hz，1H另一个H CH25ε)；4，85(mt，1H2α)；4，89(dd，J＝10和1，5Hz，1H1α)；5，35(d宽，J＝5，5Hz，1H5α)；5，41(dd，J＝12和5Hz，1H4α)；5，92(d，J＝10Hz，1H6α)；5，93(mt，1H1β)；6，53(d，J＝9，5Hz，1HNH 2)；7，15～7，35(mt，5HH芳族6)；7，16(d，J＝8Hz，2HH芳族4ε)；7，26(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)；7，37(dd，J＝8，5和4Hz，1H1′H5)；7，42(dd，J＝8，5和1，5Hz，1H1′H4)；7，70(dd，J＝4和1，5Hz，1H1′H6)；8，37(d，J＝10Hz，1HNH 1)；8，75(d，J＝10Hz，1HNH 6)；11，66(s，1HOH).
实施例24制备4ζ-烯丙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用90个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例33合成的4-0-烯丙基酪氨酸(S)的盐酸化物的20g/l 0.1N盐酸溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自90个锥形瓶的2.7升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-烯丙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(MachereyNagel)，用由52％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和48％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-烯丙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到29mg 4ζ-烯丙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，63(dd，J＝16和6Hz，1H1H CH25β)；0，91(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，13(mt，1H1H CH23β)；1，29(mt，1H1H CH23γ)；1，33(d，J＝6，5Hz，3HCH31γ)；1，57(mt，1H另一个H CH23γ)；1，65和1，74(2mts，1HCH22β)；2，02(mt，1H另一个H CH23β)；2，14和2，34(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，43(d，J＝16Hz，1H另一个HCH25β)；2，85(dt，J＝13和4Hz，1H1H CH25ε)；2，95(dd，J＝12和4Hz，1H1H CH24β)；3，25(s，3HNCH3)；3，33(mt，1H1H CH23δ)；3，36(t，J＝12Hz，1H另一个H CH24β)；3，56(mt，1H另一个H CH23δ)；4，51(AB明显 2HOCH2烯丙基上)；4，56(t，J＝7，5Hz，1H3α)；4，75(dd宽，J＝13和8Hz，1H另一个H CH25ε)；4，84(mt，1H2α)；4，88(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，27(dd，J＝12和4Hz，1H4α)；5，32(d宽，J＝6Hz，1H5α)；5，30和5，40(mt和dd，J＝17和1，5Hz，1H＝CH2烯丙基上)；5，89(d，J＝9，5Hz，1H6α)；5，91(mt，1H1β)；6，02(mt，1HCH＝烯丙基上)；6，50(d，J＝10Hz，1HNH 2)；6，85(d，J＝8Hz，2HH芳族4ε)；7，12(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)；7，10～7，35(mt，5HH芳族6)；7，45(dd，J＝8，5和1，5Hz，1H1′H4)；7，57(dd，J＝8，5和4Hz，1H1′H5)；7，77(dd，J＝4和1，5Hz，1H1′H6)；8，41(d，J＝10Hz，1HNH 1)；8，74(d，J＝9，5Hz，1HNH 6)；11，63(s，1HOH).
实施例25制备4ζ-乙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用90个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例33合成的4-O-乙基酪氨酸(S)的盐酸化物的20g/l 0.1N盐酸溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自90个锥形瓶的2.7升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-乙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由52％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和48％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-乙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到29mg4ζ-乙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，64(dd，J＝16和5，5Hz，1H1H CH25β)；0，90(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，12(mt，1H1H CH23β)；1，25(mt，1H1H CH23γ)；1，33(d，J＝7Hz，3HCH31γ)；1，42(t，J＝7Hz，3HCH3在乙基上)；1，57(mt，1H另一个HCH23γ)；1，63和1，74(2mts，1HCH22β)；2，02(mt，1H另一个HCH23β)；2，16和2，35(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，43(d，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，83(dt，J＝13和4Hz，1H1H CH25ε)；2，93(dd，J＝12和4Hz，1H1H CH24β)；3，15～3，30(mt，1H1H CH23δ)；3，24(s，3HNCH3)；3，35(t，J＝12Hz，1H另一个H CH24β)；3，55(mt，1H另一个H CH23δ)；3，95(AB明显2HOCH2在乙基上)；4，56(dd，J＝7，5和6Hz，1H3α)；4，75(dd宽，J＝13和8Hz，1H另一个H CH25ε)；4，84(mt，1H2α)；4，87(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，26(dd，J＝12和4Hz，1H4α)；5，32(d宽，J＝5，5Hz，1H5α)；5，88(d，J＝10Hz，1H6α)；5，92(mt，1H1β)；6，48(d，J＝10Hz，1HNH 2)；6，83(d，J＝8Hz，2HH芳族4ε)；7，10(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)；7，10～7，35(mt，5HH芳族6)；7，44(dd，J＝8，5和1，5Hz，1H1′H4)；7，57(dd，J＝8，5和4，5Hz，1H1′H5)；7，77(dd，J＝4，5和1，5Hz，1H1′H6)；8，38(d，J＝10Hz，1HNH 1)；8，75(d，J＝10Hz，1HNH6)；11，60(s，1HOH).
实施例26制备4ζ-(2-氯乙氧基)-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例42-1合成的4-0-(2-氯乙基)酪氨酸(S)的盐酸化物的20g/l水溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-(2-氯乙氧基)-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由60％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和40％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-(2-氯乙氧基)-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到3.2mg 4ζ-(2-氯乙氧基)-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，66(dd，J＝16和5，5Hz，1H1H CH25β)；0，91(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，13(mt，1H1H CH23β)；1，28(mt，1H1H CH23γ)；1，33(d，J＝7Hz，3HCH31γ)；1，57(mt，1H另一个H CH23γ)；1，66和1，76(2mts，1HCH22β)；2，02(mt，1H另一个H CH23β)；2，16和2，37(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，47(d，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，86(dt，J＝13和4Hz，1H1H CH25ε)；2，95(dd，J＝12和4Hz，1H1H CH24β)；3，23(s，3HNCH3)；3，32(mt，1H1H CH23δ)；3，37(t，J＝12Hz，1H另一个H CH24β)；3，57(mt，1H另一个H CH23δ)；3，82(t，J＝6Hz，2HCH2Cl)；4，19(AB明显，2HOCH2在乙基上)；4，55(dd，J＝7，5和7Hz，1H3α)；4，75(dd宽，J＝13和8Hz，1H另一个H CH25ε)；4，84(mt，1H2α)；4，87(d宽，J＝10Hz，1H1α)；5，28(dd，J＝12和4Hz，1H4α)；5，32(d宽，J＝5，5Hz，1H5α)；5，88(d，J＝10Hz，1H6α)；5，90(mt，1H1β)；6，50(d，J＝10Hz，1HNH 2)；6，86(d，J＝8Hz，2HH芳族4ε)；7，13(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)；7，10～7，35(mt，5HH芳族6)；7，45(AB明显，2H1′H4和1′H5)；7，75(dd，J＝4和2Hz，1H1′H6)；8，38(d，J＝10Hz，1HNH 1)；8，74(d，J＝10Hz，1HNH6)；11，62(s，1HOH).
实施例27制备4ζ-乙酰基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例33合成的4-乙酰苯基丙氨酸(S)的20g/l 0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由6％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-乙酰基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由60％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和40％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-乙酰基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到4.2mg 4ζ-乙酰基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，73(dd，J＝16和6Hz，1H1H CH25β)；0，93(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，12(mt，1H1H CH23β)；1，25～1，45(mt，1H1H CH23γ)；1，33(d，J＝7Hz，3HCH31γ)；1，62(mt，1H另一个H CH23γ)；1，60 1，85(mt，2HCH22β)；2，02(mt，1H另一个H CH23β)；2，20和2，42(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，52(d，J＝16Hz，1H另一个HCH25β)；2，60(s，3HArCOCH3)；2，88(dt，J＝13和4，5Hz，1H1H CH25ε)；3，13(dd，J＝13，5和5，5Hz，1H1H CH24β)；3，21(s，3HNCH3)；3，30～3，50(mt，1H另一个H CH24 β)；3，30～3，50和3，63(2mts，1HCH23δ)；4，53(t，J＝7，5Hz，1H3α)；4，75(dd宽，J＝13和8Hz，1H另一个H CH25ε)；4，84(mt，1H2α)；4，88(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，35(d宽，J＝6Hz，1H5α)；5，43(dd，J＝10，5和4Hz，1H4α)；5，90(d，J＝9，5Hz，1H6α)；5，92(mt，1H1β)；6，56(d，J＝9，5Hz，1HNH 2)；7，10～7，35(mt，5HH芳族6)；7，28(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)；7，38(dd，J＝8，5和2Hz，1H1′H4)；7，42(dd，J＝8，5和4，5Hz，1H1′H5)；7，66(dd，J＝4，5和2Hz，1H1′H6)；7，88(d，J＝8Hz，2HH芳族4ε)；8，38(d，J＝10Hz，1HNH 1)；8，74(d，J＝9，5Hz，1HNH 6)；11，65(s，1HOH).
实施例28制备4ε-二甲胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例35-10合成的3-二甲胺基苯基丙氨酸(R，S)的二盐酸化物的20g/l 0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ε-二甲胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于3ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由57％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和43％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ε-二甲胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到1.1mg 4ε-二甲胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，63(dd，J＝16和5Hz，1H1H CH25β)；0，91(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，13(mt，1H1H CH23β)；1，20～1，35(mt，1H1H CH23γ)；1，32(d，J＝6，5Hz，3HCH31γ)；1，57(mt，1H另一个H CH23γ)；1，63和1，76(2mts，1HCH22β)；2，02(mt，1H另一个H CH23β)；2，08和2，31(mt和d宽J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，35(d，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，81(dt，J＝13和4Hz，1H1H CH25ε)；2，90(s，6HN(CH3)2)；2，97(dd，J＝12和4Hz，1H1H CH24β)；3，20～3，30(mt，1H1H CH23δ)；3，28(s，3HNCH3)；3，37(t，J＝12Hz，1H另一个H CH24β)；3，57(mt，1H另一个H CH23δ)；4，58(t，J＝7，5Hz，1H3α)；4，74(dd宽，J＝13和8Hz，1H另一个H CH25ε)；4，86(mt，1H2α)；4，89(d宽，J＝10Hz，1H1α)；5，27(dd，J＝12和4Hz，1H4α)；5，29(d宽，J＝5Hz，1H5α)；5，89(d，J＝9，5Hz，1H6α)；5，90(mt，1H1β)；6，50(d，J＝10Hz，1HNH 2)；6，50～6，70(mt，3HH芳族位于二甲胺基邻位和对位；7，15～7，35(mt，5HH芳族6)；7，20(t，J＝8Hz，1H芳族H位于二甲胺基间位)，7，43(AB明显2H1′H4et
1′H5)；7，82(mt，1H1′H6)，8，38(d，J＝10Hz，1HNH en 1)，8.73(d，J＝9，5Hz，1H NH en 6)，11.61(s，1HOH)实施例29制备4ε-甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用56个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例34-11合成的3-甲硫基苯基丙氨酸(R，S)的盐酸化物的20g/l 0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自56个锥形瓶的1.68升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由54％水与46％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由55％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和45％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到20mg 4ε-甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，56(dd，J＝16和5，5Hz，1H1H CH25β)；0，90(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，13(mt，1H1H CH23β)；1，28(mt，1H1H CH23γ)；1，32(d，J＝6，5Hz，3HCH31γ)；1，58(mt，1H另一个H CH23γ)；1，62和1，74(2mts，1HCH22β)；2，02(mt，1H另一个H CH23β)；2，25和2，35(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，39(d，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，43(s，3HSCH3)；2，82(dt，J＝13和4Hz，1H1H CH25ε)；2，98(dd，J＝12和4，5Hz，1H1H CH24β)；3，26(s，3HNCH3)；3，30(t，J＝12Hz 1H1H CH23δ)；3，38(mt，1H另一个H CH24β)；3，57(mt，1H另一个H CH23δ)；4，56(t，J＝7，5Hz，1H3α)；4，74(dd宽，J＝13和8Hz，1H另一个H CH25ε)；4，84(mt，1H2α)；4，89(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，29(dd，J＝12和4，5Hz，1H4α)；5，32(d宽，J＝5，5Hz，1H5α)；5，88(d，J＝9，5Hz，1H6α)；5，90(mt，1H1β)；6，51(d，J＝10Hz，1HNH 2)；6，99(d宽，J＝8Hz，1H处于甲硫基对位的芳族H)；7，10和7，15(s宽和d宽，J＝8Hz，1H处于甲硫基邻位的芳族H；7，15～7，35(mt，6HH芳族6
和处于甲硫基间位的芳族H)；7，43(d宽，J＝8Hz，1H1′H4)；7，52(dd，J＝8和4Hz，1H1′H5)；7，79(d宽，J＝4Hz，1H1′H6)；8，38(d，J＝10Hz，1HNH 1)；8，73(d，J＝9，5Hz，1HNH 6)；11，62(s，1HOH).
实施例30制备4ε-乙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用60个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例37-1合成的3-O-乙基酪氨酸(S)的盐酸化物的20g/l 0.2N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自60个锥形瓶的1.8升培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含普那霉素IA的新型衍生物的馏分并且将其蒸发。19mg干燥残余物被溶于3ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由60％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和40％乙腈形成的混合物洗提。合并含该新型普那霉素的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到15.8mg 4ε-O-乙氧基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，55(dd，J＝16和5，5Hz，1H1H CH25β)；0，90(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，12(mt，1H1H CH23β)；1，20(mt，1H1H CH23γ)；1，31(d，J＝6，5Hz，3HCH31γ)；1，49(t，J＝7Hz，3HCH3在乙基上)；1，54(mt，1H另一个HCH23γ)；1，63和1，73(2mts，1HCH22β)；2，02(mt，1H另一个HCH23β)；2，22和2，33(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，46(d，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，83(dt，J＝13和4Hz，1H1H CH25ε)；2，95(dd，J＝12和4Hz，1H1H CH24β)；3，22(mt，1H1H CH23δ)；3，27(s，3HNCH3)；3，39(t，J＝12Hz，1H另一个HCH24β)；3，53(mt，1H另一个H CH23δ)；3，93和4，03(2mts，1HOCH2在乙基上)；4，56(dd，J＝7和5，5Hz，1H3α)；4，75(dd宽J＝13和8Hz，1H另一个H CH25ε)；4，82(mt，1H2α)；4，88(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，23(dd，J＝12和4Hz，1H4α)；5，23(d宽，J＝5，5Hz，1H5α)；5，87(d，J＝9，5Hz，1H6α)；5，92(mt，1H1β)；6，47(d，J＝10Hz，1HNH2)；6，80(mt，3H)；7，10～7，35
(mt，6H芳族H6和乙氧基间位上的芳族H)；7，43(dd，J＝8和1Hz，1H1′H4)；7，50(dd，J＝8和4Hz，1H1′H5)；7，77(dd，J＝4和1Hz，1H1′H6)；8，38(d，J＝10Hz，1HNH 1)；8，70(d，J＝9，5Hz，1HNH 6)；11，60(s，1HOH).
实施例31制备4ζ-乙硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA如实施例3所述用2个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例33合成的4-乙硫基苯基丙氨酸(S)的盐酸化物的20g/l 0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自2个锥形瓶的60ml培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20ml CH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-乙硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由60％水与40％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由52％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和48％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-乙硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到52mg4ζ-乙硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm)0，68(dd，J＝16和6Hz，1H1H CH25β)；0，92(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，10～1，40(mt，5H1H CH23β和1H CH23γ和CH3在乙基上)；1，32(d，J＝7Hz，3HCH31γ)；1，45～1，85(mt，3H另一个H CH23γ和CH22β)；2，02(mt，1H另一个H CH23β)；2，18和2，37(mt和d宽，J＝16，5Hz，1HCH25δ)；2，45(d宽，J＝16Hz，1H另一个H CH25β)；2，85(dt，J＝13和4Hz，1H1H CH25ε)；2，90(mt，2HArSCH2乙基)；2，98(dd，J＝12和4Hz，1H1H CH24β)；3，25(s，3HNCH3)；3，35(mt，1H1H CH23δ)；3，39(t，J＝12Hz，1H另一个H duCH24β)；3，57(mt，1H另一个H CH23δ)；4，55(t，J＝7，5Hz，1H3α)；4，75(dd宽，J＝13和7，5Hz，1H另一个H CH25ε)；4，85(mt，1H2α)；4，89(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，25～5，40(mt，2H5α和4α)；5，88(d，J＝9，5Hz，1H6α)；5，91(mt，1H1β)；6，55(d，J＝9，5Hz，1HNH2)；7，10(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)7.10～7，35(mt，7HH
芳族6和4ε)；7，44(AB明显，2H1′H4和1′H5)；7，74(mt，1H1′H6)；8，38(d，J＝10Hz，1HNH 1)；8，75(d，J＝9，5Hz，1HNH 6)；11，62(s，1HOH).
实施例32制备4ζ-乙基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IA如实施例3所述用2个锥形瓶在生产培养基中培养菌株SP92∷pVRC508，于16小时后加入1ml如实施例33合成的4-乙苯基丙氨酸(R，S)的20g/l 0.1N苏打溶液。培养40小时后，用2体积由66％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和34％乙腈组成的混合物提取来自2个锥形瓶的60ml培养物，随后进行离心分离。用0.5体积CH2Cl2提取上清液2次。水洗CH2Cl2相，随后合并，用Na2SO4干燥并且蒸发。用20mlCH2Cl2溶解干燥提取物并且将其注入处在CH2Cl2中的二氧化硅(30g)柱中，经过用梯度为0-10％的处于CH2Cl2中的MeOH依次洗提。汇集含4ζ-乙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且将其蒸发。干燥残余物被溶于7ml由52％水与48％乙腈组成的混合物并且将其注入半制备柱Nucleosil 7μC8 10×250mm(Macherey Nagel)，用由52％磷酸缓冲液(100mM，pH＝2.9)和48％乙腈形成的混合物洗提。合并含4ζ-乙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA的馏分并且用一体积CH2Cl2提取。水洗有机相，用Na2SO4干燥，随后蒸发。得到0.50mg 4ζ-乙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
核磁共振谱1H(400MHz，CDCl3，δppm，ref.TMS)0，42(dd，J＝16和5，5Hz，1H1H CH25β)；0，92(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，10～1，40(mt，2H1H CH23β和1H CH23γ)；1，23(t，J＝7，5Hz，3HCH3在乙基上)；1，35(d，J＝7Hz，3HCH31γ)；1，45～1，85(mt，3H另一种H CH23γ和CH22β)；2，02(mt，1H另一种H CH23β)；2，15和2，25～2，40(2mts，1HCH25δ)；2，25～2，40(mt，1H另一种H CH25β)；2，60(q，J＝7，5Hz，2HArCH2在乙基上)；2，83(dt，J＝13和4Hz，1H1H CH25ε)；2，98(dd，J＝12和4Hz，1H1H CH24β)；3，25～3，35(mt，1H1H CH23δ)；3，27(s，3HNCH3)；3，39(t，J＝12Hz，1H另一种H CH24β)；3，59(mt，1H另一种H CH23δ)；4，58(dd，J＝7和6，5Hz，1H3α)；4，75(dd宽，J＝13和8Hz，1H另一种H CH25ε)；4，87(mt，1H2α)；4，89(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，24(宽，J＝5，5Hz，1H5α)；5，29(dd，J＝12和4Hz，1H4α)；5，88(d，J＝10Hz，1H6α)；5，92(mt，1H1β)；6，73(d，J＝10Hz，1HNH 2)；7，10～
7，35(mt，9HH芳族6-4ε和4δ)；7，44(dd，J＝8，5和1，5Hz，1H1′H4)；7，50(dd，J＝8，5和4，5Hz，1H1′H5)；7，80(dd，J＝4，5和1，5Hz，1H1′H6)；8，38(d，J＝10Hz，1HNH 1)；8，75(d，J＝10Hz，1HNH 6)；11，66(s，1H:OH).
以来自上述二氧化硅柱的同样含有普那霉素IH的新型衍生物的馏分为原料，借助上述半制备柱色谱分离0.3mgζ-乙基-脱(4ζ-二甲氨基)普那霉素IH。
核磁共振谱，1H(400MHz，CDCl3，δppm)0，04(mt，1H1HCH25β)；0，92(t，J＝7，5Hz，3HCH32γ)；1，10～1，40(mt，2H1HCH25δ和1H CH25γ)；1，18(t，J＝7，5Hz，3HCH3在乙基上)；1，30(d，J＝6，5Hz，3HCH31γ)；1，45～1，85(mt，7H另一种H CH25γ-另一种H CH25δ-1H CH23β-CH23γ和CH22β)；1，81(d宽，J＝13Hz，1H另一种H CH25β)；2，02(mt，1H另一种H CH23β)；2，40(dt，J＝13和4Hz，1H1H CH25ε)；2，65(q，J＝7，5Hz，2HArCH2在乙基上；2，97和3，09(dd和t，J＝12和5Hz和J＝12Hz，1HCH24β)；3，50和3，60(2mts，1HCH23δ)；4，13(dd，J＝8和5Hz，1H3α)；4，49(d宽 J＝13Hz，1H另一种H CH25ε)；4，70(mt，2H5α和4α)；4，77(mt，1H2α)；4，83(dd，J＝10和1Hz，1H1α)；5，50(d，J＝7Hz，1H6α)；5，74(mt，1H1β)；6，09(d，J＝4Hz，1HNH 4)；6，72(mf，1HNH 2)；7，07(d，J＝8Hz，2HH芳族4ε)；7，15(d，J＝8Hz，2HH芳族4δ)；7，15～7，35(mt，5HH芳族6)；7，40(dd，J＝8和1Hz，1H1′H4)；7，45(dd，J＝8和4Hz，1H1′H5)；7，92(dd，J＝4和1Hz，1H1′H6)；8，40(mf，1HNH 6)；8，50(d，J＝10Hz，1HNH 1)；11，72(s，1HOH).
实施例33制备上述苯基丙氨酸与苯丙酮酸的衍生物所使用的苯基丙氨酸及其衍生物4-甲氧苯基丙氨酸，4-溴苯基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、4-碘苯基丙氨酸、4-三氟甲基苯基丙氨酸、4-氨基苯基丙氨酸、3-甲氨基苯基丙氨酸均可由市场上得到。
下列苯基丙氨酸衍生物可以按照文献中所述方法制备。
4-二甲氨基苯基丙氨酸(RS)D.F.Elliott，A.T.Fuller，C.R.Harrington，J.Chem.Soc.，1948，85-89.
4-二乙氨基苯基丙氨酸(RS)
Moldaver B.L.，Pushkareva Z.V.，Zhur.Obshchei Khim，.31，1560-1569(1961)；C.A.1961，22226f；J.A Stock，J.Chem.Soc，1959，90-974-乙氨基苯基丙氨酸(RS)F.Bergel，J.A.Stock，J.Chem.Soc，1959，90-97.
4-苯基苯基丙氨酸(RS)J.V.Braun，J.Nelles，Berichte，66B，1933，1464-1470.
4-甲基苯基丙氨酸(RS)R.R.，Herr，T.Enjoki，J.P.Dailey，J.Am.Chem.Soc，1957，79，4229-4231.
4-甲硫基苯基丙氨酸(RS)和4-乙硫基苯基丙氨酸(R，S)R.L.Colescott.R.R.Herr，J.P.Dailey J.Am.Chem.Soc，1957，79，4232-4235.
4-甲氧基羰基苯基丙氨酸(RS)H.Cleland，J.Org.Chem.，1969，34，747.
2，4-二甲苯基丙氨酸(RS)R.R.，Herr，T.Enjoki，J.P.Dailey，J.Am.Chem.Soc，1957，79，4229-4231.
3，4-二甲苯基丙氨酸(RS)R.R.，Herr，T.Enjoki，J.P.Dailey，J.Am.Chem.Soc，1957，79，4229-4231.
3-三氟甲基苯基丙氨酸(RS)，盐酸化物R.Filler and H.Novar，J.Org.Chem，1960，25，733-736.
4-氨基甲基苯基丙氨酸(S)G.E.Stokker，W.F.Hoffman and C.F.Homnick，J.Org.Chem.，1993，58，5015-5017.
3-甲苯基丙氨酸(R，S)J.H Burckhalter，V.C Stephens，J.A.C.S.1951，73-56-58.
4-乙酰基苯基丙氨酸(R，S)J.I.Degaw et coll.，J.Med.Che.，1969，11，225-227
4-O-烯丙基酪氨酸(S)A.Loffet，H.Zang，Int.J.Pept.Protein Res.，1993，42，3464-O-乙基酪氨酸(S)Y.Sasaki et Coll，chem.Pharm.bull.1982，30，4435.
4-乙基苯基丙氨酸(RS)A.Zhue et coll.，Coll.，Czech.Chem.Commmm.，1965，62，26484-叔丁基苯基丙酮酸按照下列方法制备R.Breslow，J.W.Canary，M.Varney，S.T.Waddell and D.Yang，J.Am.Chem.Soc.，1990，112，5212-5219.
按照下述实施例34-42制备其它苯基丙氨酸衍生物。在这些实施例中，在氮气平均压力为50KPa下采用粒径为40-53μm的二氧化硅按照Still等人J.Org.Chem.，43，2923(1978)进行急骤层析。
实施例34通过方法A制备苯基丙氨酸衍生物和苯丙酮酸衍生物 34-14-甲氨基苯基丙氨酸(RS)，二盐酸化物向3.70g N-乙酰基-4-甲氨基苯基丙氨酸甲酯中加入37ml 12N盐酸并且将该混合物在搅拌下回流加热8小时。在环境温度下经过一夜之后，减压(50kpa)浓缩至干，用50ml甲苯和50ml乙醇混合物将其溶解，随后重新将其浓缩。用干燥器减压(2.6kpa)干燥，得到4.18g(100％)熔点为158℃的吸湿性浅米色固状4-甲氨基苯基丙氨酸(RS)的二盐酸化物。
34-2N-乙酰基-4-甲氨基苯基丙氨酸甲酯(RS)向处于高压釜中氮气氛下的4g 4-甲氨基-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯加入0.4g 10％钯/炭随后加入50ml无水乙醇。将该混合物置于5.5巴氢气压力下，边搅拌边于50℃下加热15小时。待温度稳定于26℃和常压下之后，用ClarcelR过滤、用乙醇清洗，减压(2.6kpa)浓缩至干。得到3.73g熔点为118℃的白色晶状N-乙酰基-4-甲氨基苯基丙氨酸甲酯。
34-34-甲氨基-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯在一个处在氮气氛下的三颈瓶中加入5.75g 2-乙酰胺基丙烯酸甲酯、0.185g乙酸钯、8.1g氯化四丁铵和6.03g NaHCO3，随后补充6.5g处于200ml DMF中的4-碘-N-甲基苯胺溶液。于82℃将混合物加热16小时30分钟，冷却后将其倾入1000ml蒸馏水中。用250ml CH2Cl2将其溶解，倾析有机相，用250ml CH2Cl2洗涤水相两次。合并有机相，用Na2SO4干燥，过滤并于70℃减压(50kpa)浓缩，得到的棕色油状物经过急骤层析提纯(洗提剂AcOEt/环己烷，随后用纯AcOEt)。
这样得到4g黄色固状4-甲氨基-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯(二氧化硅Merck 5719，Rf＝0.48)。
按照S.Krishnamurthy Tetrahedron Letters，33，3315-3318，1982制备N-甲基-对碘苯胺。
34-44-甲氨基苯丙酮酸在一圆底烧瓶中放入2.4g 4-甲氨基-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯和32ml 12N盐酸。将该混合物回流加热3小时，随后将其冷却，用20ml乙酸乙酯洗涤2次。将水相冷却至-10℃，过滤所得到的沉淀，随后用最小数量的冷盐酸清洗。用干燥器减压干燥所形成的固体，得到1.1g熔点为210℃的浅米色固状4-甲氨基苯丙酮酸。
34-53-氟-4-甲苯基丙氨酸(RS)盐酸化物按照实施例34-1进行操作，不同的是以1.6g N-乙酰基-(3-氟-4-甲基)苯基丙氨酸甲酯为原料，得到0.6g熔点高于260℃的白色晶状3-氟-4-甲基苯基丙氨酸(R，S)盐酸化物。
34-6N-乙酰基(3-氟-4-甲基)苯基丙氨酸甲酯(R，S)按照实施例34-2操作，不同的是以1.9g(4-甲基-3-氟)-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯、0.2g 10％钯/炭(于230ml乙醇中)为原料，得到1.6g无色油状N-乙酰基-(3-氟-4-甲基)苯基丙氨酸甲酯(二氧化硅Merck 5719，Rf＝0.46；洗提剂CH2Cl2/AcOEt 50/50)。
34-7(3-氟-4-甲基)-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯按照实施例34-3进行，不同的是以3.6g 2-乙酰胺基丙烯酸甲酯、0.12g乙酸钯、5.2g氯化四丁铵、3.8g NaHCO3和4g 2-氟-4-溴甲苯处于120ml无水DMF中的溶液为原料，得到2.6g熔点为163℃的白色固状(3-氟-4-甲基)-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯。
34-84-三氟甲氧苯基丙氨酸(R，S)，盐酸化物或邻三氟甲基酪氨酸盐酸化物(R，S)按照实施例34-1操作，不同的是以3g N-乙酰基-(4-三氟甲氧基)苯基丙氨酸甲酯和30ml 12N盐酸为原料，得到1.5g熔点为260℃的白色晶状4-三氟甲氧基苯基丙氨酸(RS)的盐酸化物。
34-9N-乙酰基-(4-三氟甲氧基)苯基丙氨酸甲酯(R，S)按照实施例34-2操作，不同的是以3.1g(4-三氟甲氧基)-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯、0.3g 10％钯/炭(于50ml乙醇中)为原料，得到3g白色固状熔点为80℃的N-乙酰基-(4-三氟甲氧基)苯基丙氨酸甲酯(二氧化硅Merck 5719，Rf＝0.46；洗提剂CH2Cl2/AcDEt50/50)。
34-104-三氟甲氧基-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯(3-氟-4-甲基)-2-乙酰胺肉桂酸甲酯按照实施例34-3进行，不同的是以4.3g 2-乙酰基丙烯酸甲酯、0.14g乙酸钯、6.1g氯化四丁铵、4.6g NaHCO3和5g 4-三氟甲氧基溴苯处于150ml无水DMF中的溶液为原料，得到3.1g熔点为135℃的白色固状(4-三氟甲氧基)-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯。
34-113-甲硫基苯基丙氨酸(R，S)，盐酸化物按照实施例34-1操作，不同的是以3.3g N-乙酰基-3-甲硫基苯基丙氨酸甲酯和40ml 12N盐酸为原料，得到1.38g熔点为190℃的白色晶状3-甲硫基苯基丙氨酸(RS)的盐酸化物。
34-12N-乙酰基-3-甲硫基苯基丙氨酸甲酯(RS)在圆底烧瓶中放入3.72g处于100ml甲醇和30ml四氢呋喃中的3-甲硫基-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯溶液，随后加入1.4g镁。反应20分钟后，用冰浴冷却反应介质，随后再次加入1.4g镁。于环境温度下搅拌18小时，将该混合物倾入1.4l蒸馏水和300ml CH2Cl2，随后用ClarcelR过滤。通过添加12N盐酸将水相的pH调至6，随后倾析，用100ml CH2Cl2洗涤。合并有机相，用MgSO4干燥，过滤，减压浓缩至干，得到3.42g无色油状N-乙酰基-3-甲硫基苯基丙氨酸甲酯(二氧化硅，Merck5719，Rf＝0.5；AcOEt)。
34-133-甲硫基-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯按照实施例34-3进行，不同的是以5.6g 2-乙酰胺基丙烯酸甲酯、0.18g乙酸钯、8.2g氯化四丁铵、5.86g NaHCO3和6.5g 3-碘-1-甲硫基苯处于160ml无水DMF中的溶液为原料，得到4.8g熔点为139℃的白色固状(3-甲硫基)-2-乙酰胺基肉桂酸甲酯。
34-143-碘代甲硫基苯在搅拌下将20ml蒸馏水和20ml 12N盐酸加入一个三颈瓶中，随后用滴液漏斗加入10ml 3-甲硫基苯胺。温热该混合物以便确保其溶解，随后将其冷却至5℃。用滴液漏斗缓慢加入5.86g亚硝酸钠于15ml水中形成的溶液，将温度保持在5-8℃。添加完毕，经过20分钟之后，在10分钟内加入13.57g KI处于15ml水中的溶液中，在环境温度下搅拌15小时。通过倾析将所形成的油与水相分离，随后加入硫代硫酸钠水溶液，倾析水相，用100ml CH2Cl2萃取产物。用100ml水洗有机相，用浓苏打将水相pH值调至9，随后倾析。用100ml水洗涤有机相2次，倾析，用MgSO4干燥，过滤并在40℃减压(50kpa)浓缩至干。所得产物借助急骤层析(洗提剂环己烷)提纯，得到13g黄色液态3-碘代-1-甲硫基苯(二氧化硅Merck 5719，Rf＝0.8/环己烷)。
实施例35按照方法B制备苯基丙氨酸衍生物 35-14-叔丁基苯基丙氨酸(RS)在具有冷却剂的三颈瓶中加入25g 4-(叔丁基)苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯和250ml 37％盐酸。搅拌该混合物并且回流加热直至不再产生气体为止。待冷却该反应混合物后，过滤沉淀并且在乙腈中重结晶，得到25.6g熔点为234℃的白色固态4-叔丁基苯基丙氨酸(R，S)盐酸化物。(同样参见Journal of Takeda Reasearch Laboratories Vol.43No 3/4，1984年12月p53-76)。
35-24-(叔丁基)苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯在具有冷却剂的三颈瓶中于氮气氛下加入25g 4-叔丁基苄基溴、50ml无水甲苯和3.1g于80％油中形成的NaH悬浮液，随后加入21.8g乙酰氨基丙二酸二乙酯。于110℃将混合物加热17小时。冷却后，借助滴液漏斗缓慢加入15ml无水乙醇，随后加入15ml 50％乙醇，再加入50ml水。倾析有机相并用50ml乙醚洗涤水相3次。合并有机相，水洗后用Na2SO4干燥。过滤后进行减压浓缩，产物在石油醚中结晶后形成25g熔点为80℃的白色固状4-(叔丁基)苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯。
35-33-甲氨基苯基丙氨酸(R，S)二盐酸化物按照实施例35-1进行，不同的是以1.17g 3-甲氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯和20ml 12N盐酸为原料，得到1.03g米黄色固体。将其溶于20ml无水乙醇并且加入0.4g骨炭。用ClarcelR过滤该溶液，过滤后进行减压(50kpa)浓缩。用1g骨炭重新开始这一操作并且将所得到的固体放在20ml醚中进行研磨。过滤后，于50℃进行减压(2.7kpa)干燥，得到0.65g熔点约为135℃(分解)的白粉状3-甲氨基苯基丙氨酸(R，S)二盐酸化物。
35-43-甲氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯向被保持在氮气氛下的三颈瓶中加入3.11ml乙酐，随后在0℃于3分钟内加入1.51ml甲酸，于50℃加热2小时。经过3小时20分钟的搅拌使该混合物回到环境温度，在氮气氛下加入4ml无水THF并且将其冷却至-20℃。在10分钟内加入4g 3-氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯于由15ml无水THF和15ml无水CH2Cl2形成的混合物中构成的溶液。于-20℃搅拌1小时10分钟后，于20℃搅拌16小时。于30℃减压(50kpa)浓缩至干，随后与30ml无水甲苯共蒸发，得到的白色固体被溶于10ml无水THF与20ml无水1，2-二氯乙烷的混合物中，随后被置于氮气氛下的三颈瓶中。
将该介质冷却至-5℃，随后在10分钟内加入1.55ml配合物甲硼烷-二甲基硫化物(于THF中的2M溶液)。使其升至环境温度后，回流加热该溶液3小时，随后在环境温度下搅拌15小时。将其冷却至0℃，随后在25分钟内加入10ml MeOH。在0℃搅拌45分钟，随后在环境温度搅拌30分钟。冷却至0℃，鼓泡通入HCl气直至pH＝2为止。回流加热1小时后，于30℃减压浓缩至干，得到的5g产物被溶于30mlNaHCO3水溶液和30ml CH2Cl2。倾析有机相，用20ml水洗涤水相。合并有机相，用MgSO4干燥，过滤后减压(2.6kpa)浓缩至干，得到的3.43g黄色油状物经过急骤层析提纯(洗提液AcOEt-环己烷50/50)。于20℃减压(2.7kpa)干燥后得到1.18g熔点为122℃的浅米色固态3-甲氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯。
35-53-氨基苄基乙酰氨基丙二酸二乙酯按照下列文献所述方法制备T.S.Osdene，D.N.Ward，W.H.Chapman and H.Rakoff.J.Am.Chem.Soc.，81，1959，3100-3102。
35-63-乙氨基苯基丙氨酸(R，S)二盐酸化物按照实施例34-1操作，不同的是以2g N-乙酰基-3-乙胺基苯基丙氨酸乙酯(R，S)和30ml 12N盐酸为原料，得到1.7g吸湿性浅米色固状3-乙胺基苯基丙氨酸(RS)的二盐酸化物(10％摩尔3-二乙胺基苯基丙氨酸(R，S))。
35-7N-乙酰基-3-乙氨基苯基丙氨酸乙酯(R，S)在处于氮气氛中的圆底烧瓶中放入3g N-乙酰基-3-氨基苯基丙氨酸乙酯(R，S)、40ml乙醇和14g预先经过蒸馏水和乙醇洗涤的阮内镍。回流加热19小时后，冷却，用ClarcelR过滤，随后减压(50kpa)浓缩至干，得到的3.07g无色油状物经急骤层析提纯(洗提液AcOEt)，得到2.1g含有10％N-乙酰基-3-二乙胺基苯基丙氨酸乙酯的无色油状标题化合物(二氧化硅Merck 5719，Rf＝0.6；AcOEt)。
35-8N-乙酰基-3-氨基苯基丙氨酸乙酯(R，S)在氮气氛下将25g由N-乙酰基-3-硝基苯基丙氨酸乙酯(R，S)(75％摩尔)与3-硝基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯(25％摩尔)形成的混合物放入高压釜内。加入2.5g 10％钯/炭，随后加入200mlCH2Cl2。将混合物置于9巴氢气压力下，随后在18℃搅拌4小时。恢复大气压力后，用ClarcelR过滤，用CH2Cl2清洗，随后减压(50kpa)浓缩至干，得到的固体于4g骨炭3S存在下在回流下于450ml蒸馏水中重结晶。用ClarcelR热过滤后，于4℃终止结晶，过滤晶体并且干燥，得到9.9g含5％3-氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯的熔点为106℃的浅米色固态目的化合物。
35-9N-乙酰基-3-硝基苯基丙氨酸乙酯(R，S)和3-硝基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯在放有冷却剂置于氮气氛下的三颈瓶中，加入600ml无水乙醇，随后加入7.9g钠。待完全溶解之后，加入74.5g乙酰胺基丙二酸二乙酯，随后加入处在200ml无水乙醇中的60g 4-硝基苄基氯。将该混合物回流加热16小时30分钟。冷却后将其减压(50kpa)浓缩，随后用500mlCH2Cl2和500ml水将混合物溶解。将pH通过加入0.5N硫酸调至7，随后倾析有机相，用200ml CH2Cl2洗涤水相2次。合并有机相，用200mlNaHCO3饱和水溶液洗涤，倾析后用MgSO4干燥。过滤后，减压(50kpa)浓缩，将产物放入600ml乙醇中在回流条件下重结晶，室温下重结晶后，经过滤与干燥，得到70.4g熔点为156℃的白色晶状3-硝基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯。浓缩后，通过急骤层析提纯(洗提液AcOEt)得到25.6g N-乙酰基-3-硝基苯基丙氨酸乙酯(75％摩尔)与3-硝基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯(25％摩尔)的浅米色固状混合物。
35-103-二甲氨基苯基丙氨酸(R，S)，二盐酸化物按照实施例35-1操作，不同的是以0.72g N-乙酰基-3-二甲氨基苯基丙氨酸乙酯(RS)和8.6ml 10N盐酸为原料，蒸发后得到的固体被放在50ml丙酮中研磨，过滤后于40℃减压(2.7kpa)干燥，得到0.68g(93％)熔点为约120℃(分解)的白色固状3-二甲氨基苯基丙氨酸(R，S)二盐酸化物。
35-11N-乙酰基-3-二甲氨基苯基丙氨酸乙酯(RS)在处于氮气氛的三颈瓶中放入4g如实施例35-8制备的处于15mlDMF中的N-乙酰基-3-氨基苯基丙氨酸乙酯(RS)，加入5.5ml三乙胺，随后加入2.5ml甲基碘和4ml CH2Cl2，借助冰浴将温度保持在约30℃。将该混合物在35℃下加热18小时。缓慢加入1ml甲基碘的1mlDMF溶液，将温度保持在约30℃，随后加入2.2ml三乙胺，在35℃再将该混合物加热5小时。使混合物恢复环境温度，随后用100ml乙酸乙酯和150ml蒸馏水进行萃取。倾析水相，用70ml乙酸乙酯洗涤2次。合并有机相，用80ml蒸馏水、随后用50ml NaCl蒸馏水饱和溶液洗涤2次。倾析有机相，用MgSO4干燥，过滤，减压浓缩至干，得到的2.4g产物用急骤层析提纯(CH2Cl2/MeOH 90/10)。得到0.72g(16％)黄色晶状3-N-乙酰基-3-二甲氨基苯基丙氨酸乙酯(RS)。
实施例36按照方法C制备苯基丙氨酸衍生物 36-14-异丙基苯基丙氨酸(R，S)在三颈瓶中放入7g红磷和8g处在45ml乙酐中的4-(异丙基亚苄基)-2-甲基-5-噁唑酮，随后在搅拌下借助滴液漏斗缓慢加入35ml 57％氢碘酸。添加完毕，回流加热3.5小时，随后在室温下放置3天。过滤反应混合物，用10ml乙酸清洗所得到的固体2次，随后将滤液减压浓缩至干。将所得到的残余物溶于100ml蒸馏水，减压浓缩至干，得到的固体被溶于50ml蒸馏水，于添加0.5g亚硫酸钠之后用50ml乙醚萃取3次。倾析乙醚，将水相置于减压条件下以便脱除痕量乙醚。向水相中加入2g骨炭，于40-50℃下加热，用ClarcelR过滤，用最少量的水清洗。通过于4℃添加32％氨水将pH调至5。冷过滤所形成的沉淀，用10ml水清洗2次、10ml乙醇清洗1次和10ml乙醚清洗2次，20℃下减压干燥后得到3.97g熔点高于260℃的白色固态4-异丙基苯基丙氨酸(R，S)(参见Journal of Takeda Research Laboratories Vol.43；No 3/4，1984年12月p53-76)。
36-24-(异丙基亚苄基)-2-甲基-5-噁唑酮在具有冷却剂的圆底烧瓶中放入18.52g N-乙酰基甘氨酸、10.6g乙酸钠、20ml 4-异丙基苯甲醛和57ml乙酐。搅拌30分钟后在110℃搅拌1小时，随后在环境温度下搅拌15小时。将反应混合物倾入600ml水和400ml预热至50℃的石油醚中。倾析有机相并且用150ml石油醚洗涤水相2次。
合并有机相，用MgSO4干燥，过滤并且减压浓缩直至100ml和形成沉淀物为止。过滤后，用50ml戊烷洗涤2次，得到8.2g熔点为77℃的黄色固态4-(异丙基亚苄基)-2-甲基-5-噁唑酮。
36-34-丁基苯基丙氨酸(R，S)按照实施例36-1操作，不同的是以1.49g红磷、1.8g 4-(丁基亚苄基)-2-甲基-5-噁唑酮、9.23ml乙酐和7.39ml 57％氢碘酸为原料，得到0.35g熔点高于260℃的浅米色固态4-丁基苯基丙氨酸(R，S)。
36-44-(丁基亚苄基)-2-甲基-5-噁唑酮。
按照实施例36-2操作，不同的是以8.43g N-乙酰基甘氨酸，4.92g乙酸钠、9.8g 4-丁基苯甲醛和26ml乙酐为原料，得到1.89g熔点为74℃的黄色固状4-(丁基亚苄基)-2-甲基-5-噁唑酮。
实施例37按照方法D制备苯基丙氨酸衍生物37-13-乙氧基苯基丙氨酸(R，S)盐酸化物(或3-邻乙基酪氨酸(R，S)，盐酸化物)在一圆底烧瓶中放入1g处在3.6ml盐酸二噁烷(dioxannechlorhydrique)中的N-叔丁氧羰基-3-乙氧基苯基丙氨酸(R，S)溶液。室温下搅拌5小时。过滤形成的沉淀，用二噁烷清洗后用乙醚清洗，于40℃下减压(2.7kpa)干燥，得到0.65g熔点为200℃的白色固状3-乙氧基苯基丙氨酸盐酸化物。
37-2N-叔丁氧羰基-3-乙氧基苯基丙氨酸(R，S)在一圆底烧瓶中加入1.33g处于8ml甲醇中的N-叔丁氧羰基-3-乙氧基苯基丙氨酸乙酯(R，S)溶液，随后加入8ml 1N苏打。室温下搅拌18小时后，减压蒸发混合物，随后用8.65ml 1N盐酸酸化。用10ml乙酸乙酯萃取产物2次。合并有机相，用10ml水洗2次，干燥、过滤、减压浓缩至干，得到1g黄油状N-叔丁氧羰基-3-乙氧基苯基丙氨酸(R，S)(二氧化硅Merck 5719，Rf＝0.7，洗提剂甲苯80/MeOH 10/二乙胺10)。
37-3N-叔丁氧羰基-3-乙氧基苯基丙氨酸乙酯(R，S)在处于氮气氛下的三颈瓶中加入1.5g处于7.5ml无水DMF中的N-叔丁氧羰基-3-酪氨酸(R，S)溶液，随后加入0.508g 50％处于油中的NaH。室温下搅拌2小时后，加入0.86ml碘代乙烷，室温下搅拌4小时。过滤，用10ml水洗所得到的固体3次，随后用10ml石油醚洗涤2次，于30℃减压(2.7kpa)干燥后，得到1.33g白色固状N-叔丁氧羰基-3-乙氧基苯基丙氨酸乙酯(R，S)。
37-4N-叔丁氧羰基-3-酪氨酸(R，S)在一个三颈瓶中于搅拌下加入18g处于180ml二噁烷中的3-酪氨酸(R，S)溶液，随后依次加入99ml 1N苏打和26g处于160ml二噁烷中的二碳酸二叔丁酯溶液。搅拌36小时后，于30℃减压浓缩，将其溶于100ml蒸馏水，用1N盐酸酸化直至pH＝5为止，用200ml乙酸乙酯萃取2次。用MgSO4干燥有机相，过滤，于30℃减压浓缩至干，得到30g白色固状N-叔丁氧羰基-3-酪氨酸(R，S)(二氧化硅Merck 5719，Rf＝0.25，洗提剂甲苯80，MeOH 10，二乙胺10)。
实施例38按照方法E制备苯基丙氨酸衍生物38-14-二烯丙基胺基苯基丙氨酸(R，S)二盐酸化物按照实施例35-1操作，不同的是以5.8g 4-二烯丙基胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯和48ml 10N盐酸为原料，蒸发后得到的固体在50ml丙酮中被研磨，过滤后在10ml CH2Cl2被研磨，过滤后，用10ml乙醚清洗3次。于40℃减压(2.7kpa)干燥后，得到4.41g熔点约为135℃(分解)的粉碎白色固状4-二烯丙基氨基苯基丙氨酸(RS)二盐酸化物。
38-24-烯丙基胺基苯基丙氨酸(RS)二盐酸化物按照实施例35-1操作，不同的是以3.27g 4-烯丙基胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯和30ml 10N盐酸为原料，蒸发后得到的固体在50ml丙酮中被研磨，过滤后于40℃减压(2.7kpa)干燥后，得到2.3g熔点约为134℃(分解)的白色固状4-烯丙基氨基苯基丙氨酸(RS)二盐酸化物。
38-34-二烯丙基氨基苄基乙酰胺基丙二烯二乙酯和4-烯丙基氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯在处于氮气氛下和配有滴液漏斗的三颈瓶中放入10g处于150mlDMF中的4-氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯溶液。室温下边搅拌边缓慢加入6.57ml烯丙基溴，随后加入10.76ml三乙胺。搅拌19小时后，再次加入1.31ml烯丙基溴和2.15ml三乙胺，搅拌26小时。将反应混合物倾入1.5l蒸馏水中并用1l乙酸乙酯萃取。倾析水相，用500ml乙酸乙酯洗涤2次。合并有机相，用500ml蒸馏水洗涤，随后用500ml NaCl饱和水溶液洗涤，倾析、MgSO4干燥、过滤，浓缩至干，得到的棕色油状物用急骤层析提纯(洗提剂CH2Cl2/AcOEt＝90/10)得到6.66g熔点为94-96℃的米色固状4-二烯丙基氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯(Rf＝0.6，AcOEt 50/环己烷50)和3.49g熔点为104-106℃的米色固态4-烯丙基胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯(Rf＝0.45，AcOEt 50/环己烷50)。
可以按照J.B.Burckhalter，VC Stephens，J.Am.Chem.Soc.，56，1951，73所述方法制备4-氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯。
实施例39按照方法F制备苯基丙氨酸衍生物 39-14-乙基异丙基苯基丙氨酸(RS)二盐酸化物按照实施例35-1操作，不同的是以2.9g 4-乙基异丙基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯和24.6ml 10N盐酸为原料，蒸发后得到的固体在20ml丙酮中被研磨，过滤后于40℃减压(2.7kpa)干燥后，得到2g熔点约为147℃(分解)的白色固状4-乙基异丙基氨基苯基丙氨酸(RS)二盐酸化物。
39-24-乙基异丙基氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯在处于氮气氛下的三颈瓶中加入15g处于70ml THF中的4-乙基氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯，加入6.4ml 2-碘代丙烷，随后加入8.4ml 1，5-二氮杂二环〔4-3-0〕壬-5-烯，在60℃下将该混合物加热24小时。加入2.13ml 2-碘代丙烷，随后加入8.4ml 1，5-二氮杂二环〔4-3-0〕壬-5-烯，于60℃下将该混合物再加热24小时。
使混合物恢复室温状态，随后用50ml CH2Cl2和50ml蒸馏水萃取。倾析水相，用30ml CH2Cl2洗涤2次。合并有机相，用60ml蒸馏水洗，随后用50ml NaCl蒸馏水饱和溶液洗涤，倾析有机相，用MgSO4干燥，过滤，减压浓缩至干，得到的16.2g产物通过急骤层析提纯(CH2Cl2/MeOH90/10)。因此得到的4.59g产物于45ml环己烷中被重结晶，产生3.44g熔点为80℃的白色晶状4-乙基异丙基氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯。
39-34-乙胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯按照实施例35-7操作，不同的是以22g 4-氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯、500ml乙醇和70g阮内镍为原料。这样得到23.8g熔点为136℃的破碎白色固体状4-乙胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯。
39-44-烯丙基乙胺基苯基丙氨酸(R，S)二盐酸化物按照实施例35-1操作，不同的是以4.54g 4-烯丙基乙基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯和37.9ml 10N盐酸为原料，蒸发后得到的固体在40℃减压(2.7kpa)干燥，得到3.67g熔点约为130℃(分解)的棕色固态4-烯丙基乙胺基苯基丙氨酸(RS)二盐酸化物。
39-54-烯丙基乙氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯按照实施例39-2操作，不同的是以8g 4-乙胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯、4ml烯丙基溴、5.82ml 1，5-二氮杂二环〔4-3-0〕壬-5-烯、50ml THF为原料，经过急骤层析提纯(洗提剂CH2Cl2/AcOEt 90/10体积)，得到的5.6g固体于35ml环己烷中重结晶，产生5.43g熔点为86℃的白色固态4-烯丙基乙胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯。
39-64-乙基丙胺基苯基丙氨酸(RS)二盐酸化物按照实施例35-1操作，不同的是以2.5g 4-乙基丙胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯和21ml 10N盐酸为原料，蒸发后得到的固体于40℃减压(2.7kpa)干燥后，形成2g(97％)熔点约为147℃(分解)的白色固状4-乙基丙胺基苯基丙氨酸(RS)二盐酸化物。
39-74-乙基丙氨基苄基乙酰氨基丙二酸二乙酯按照实施例39-2操作，不同的是以10g 4-乙胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯、5.6ml 1-碘丙烷、7.2ml 1，5-二氮杂二环〔4-3-0〕壬-5-烯和70ml THF为原料，反应36小时后，经过急骤层析提纯(洗提剂CH2Cl2/AcOEt 97/3体积)，得到的2.8g产物于26ml环己烷中重结晶，产生2.9g熔点为84-86℃的白色固态4-乙基丙胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯。
39-84-乙基甲基环丙基胺基苯基丙氨酸(RS)二盐酸化物按照实施例35-1操作，不同的是以3g 4-乙基甲基环丙基氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯和25ml 10N盐酸为原料，反应3天后，蒸发后得到的固体在40ml丙酮中被研磨，过滤后在40℃减压(2.7kpa)干燥，得到2.24g熔点为140℃(分解)的白色固态4-乙基甲基环丙基氨基苯基丙氨酸(RS)二盐酸化物。
39-94-乙基甲基环丙基氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯按照实施例39-2操作，不同的是以8g 4-乙胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯、2.6ml溴甲基环丙烷、2.97ml 1，5-二氮杂二环〔4-3-0〕壬-5-烯、50ml THF为原料，反应3天后，经过急骤层析提纯(洗提剂CH2Cl2/AcOEt 90/10体积)，产生3.3g熔点为112-114℃的白色固态4-乙基甲基环丙基胺基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯。
实施例40按照方法G制备苯基丙氨酸衍生物 40-14-(1-吡咯烷基)苯基丙氨酸(R，S)二盐酸化物按照实施例35-1操作，不同的是以1.5g 4-(1-吡咯烷基)苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯和40ml 5N盐酸为原料，蒸发后得到的固体于15ml丙酮中研磨，过滤后于40℃减压(2.7kpa)干燥，得到0.6g破碎白色固状4-(1-吡咯烷基)苯基丙氨酸(R，S)二盐酸化物。
40-24-(1-吡咯烷基)苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯在一间压釜中放入4g处于100ml MeOH中的4-(1-吡咯基)苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯溶液和1g 10％钯/炭。用氮气吹扫3次后，于19℃在14巴氢气压力下氢化该产物。搅拌25小时后，停止氢化，用ClarcelR过滤，用CH2Cl2清洗，减压浓缩后，得到的3.85g固体于50ml庚烷和10ml乙醚的混合物中被研磨。过滤形成的固体、干燥并且用急骤层析提纯(洗提剂CH2Cl2/丙酮90/10体积)，得到1.6g熔点为132℃的白色固态4-(1-吡咯烷基)苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯。
40-34-(1-吡咯基)苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯在一个被保持在氮气氛下的三颈瓶中放入4.6g处于104ml乙酸中的4-氨基苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯，加入7.02g乙酸钠后，加入1.87ml2，5-二甲氧基四氢呋喃。在1小时15分钟内将混合物加热至65℃，冷却后，用100ml CH2Cl2和100ml蒸馏水萃取。倾析水相，用100mlCH2Cl2洗涤3次。合并有机相，用100ml水后用100ml NaCl饱和溶液洗涤，倾析、用MgSO4干燥，过滤后减压(50kpa)蒸发至干，得到的6.2g固体用急骤层析提纯(洗提剂CH2Cl2/丙酮＝75/25体积)。得到3.57g熔点为110℃的米色固状4-(1-吡咯基)苄基乙酰胺基丙二酸二乙酯。
实施例41按照方法H制备苯基丙氨酸衍生物41-14-乙硫基甲基苯基丙氨酸(RS)
在处于氮气氛下的三颈瓶中加入300ml无水甲醇，随后在搅拌下加入1.72g甲醇钠，接着加入5.55ml乙硫醇。于40℃减压浓缩溶剂，得到8.5g处于100ml无水THF中的乙硫醇钠盐溶液。于室温下加入3.6g 4-氯甲基苯基丙氨酸(RS)，随后在18小时内回流加热该混合物。于40℃减压蒸除溶剂，将残余物溶于100ml蒸馏水中。所形成的混浊液被5ml乙酸酸化。过滤所得到的沉淀物，用蒸馏水清洗，随后在60℃减压干燥，得到的3.6g固体用急骤层析提纯(洗提液AcOEt/AcOH/水＝60/12/10)。得到256mg熔点为251℃的白色固状4-乙硫基甲基苯基丙氨酸(R，S)。
类似地，采用4-氯甲基苯基丙氨酸(S)通过下述方法制备4-氯甲基苯基丙氨酸(RS)R.Gonzalez-Muniz，F.Cornille，F.
Bergeron，D.Ficheux，J.Pothier，C.Durieux and B.Roques，Int.J.Pept.Protein.
Res.，1991，37(41)，331-340.
实施例42按照方法I制备苯基丙氨酸衍生物42-14-邻-(2-氯乙基)酪氨酸(S)，盐酸化物在一圆底烧瓶中放入5g处于50ml盐酸二噁烷的N-叔丁氧羰基-4-邻-(2-氯乙基)酪氨酸(S)溶液。搅拌28小时后，减压浓缩至干。将所得到的残余物溶于50ml乙醚，搅拌后过滤，所形成的固体用25ml乙醚洗涤2次，减压干燥，得到1.58g熔点为260℃的白色固状4-邻-(2-氯乙基)酪氨酸(S)盐酸化物。
42-2N-叔丁氧羰基-4-邻-(2-氯乙基)酪氨酸(S)在处于氮气氛下的三颈瓶中放入14g处于140ml DMF中的N-叔丁氧羰基酪氨酸(S)溶液，用刮勺缓慢地加入4.8g处于油中的50％NaH。室温下搅拌2小时后，加入16.87g 1-甲苯磺酰基-2-氯乙醇。搅拌2天后，加入2.4g处于油中的50％NaH，再次加入8.4ml 1-甲苯磺酰基-2-氯乙醇。24小时后进行同种操作，再次搅拌24小时。通过添加100ml蒸馏水终止反应，减压浓缩至干。将形成的残余物溶于100ml蒸馏水并且用100ml乙酸乙酯萃取3次。倾析水相，用50ml 1N HCl酸化直至pH＝3为止。用100ml乙酸乙酯萃取产物3次。合并有机相，用50ml水洗二次，倾析，用MgSO4干燥，过滤后减压浓缩至干，得到13.51g棕色油状N-叔丁氧羰基-4-O-(2-氯乙基)酪氨酸(S)(Rf＝0.5，甲苯70％/甲醇20％/二乙胺10％)。
表V


缩写AcOEt酸乙酯AND脱氧核糖核酸AMP腺苷5’-一磷酸CH2Cl2 二氯甲烷CLHP 高性能液相色谱dCTP 脱氧胞嘧啶5’-三磷酸DMF 二甲基甲酰胺DMPAPA 4-二甲氨基-L-苯基丙氨酸Hcl 盐酸HT7 Hickey Tresner固体培养基3-HPA3-羟基吡啶甲酸IPTG 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷kb 千碱基LB LB培养基(大肠杆菌的丰富培养基)MeOH 甲醇MMPAPA 4-甲氨基-L-苯基丙氨酸NaOH 氢氧化钠PAPA 4-氨基-L-苯基丙氨酸PEG 聚乙二醇PI 普那霉素IPII 普那霉素IIpb 碱基对SAMS-腺苷甲硫氨酸TE 缩冲液10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7，5THF 四氢呋喃Tris 2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇U.V. 紫外线X-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷YEME 酵母提取物-麦芽提取物介质(链 霉菌的丰富培养基)书目-Bibb M.J.，Findlay P.R.et Johnson M.W.(1984)基因，30157-166.-Bibb M.J.，Janssen G.R.，et Ward J.M.(1985)基因，38215-226.-Cocito C.G.(1979)微生物综述，43145-198.-Cocito C.G.(1983)抗生素6(Ed.F.E.Hahn)，296-332.-Dessen P.C.，Fondrat C.，Valencien C.et Mugnier C.(1990)生物学中化合物的应用，6355-356.-Di Giambattista M.，Chinali G.et Cocito C.G.(1989)J.Antim.Chemother.，24485-507.-Gibson T.J.(1984)博士论文，英国剑桥大学。-Hillemann D.，Pulher A.et Wohlleben W.(1991)核酸研究，19727-731.-Hopwood D.A.，Bibb M.J.，Chater K.F.，Kieser T.，Bruton C.J.，Kieser H.M.，Lydiate D.J.，Smith C.P.，Ward J.M.et Scrempf H.(1985)实验室手册The John Innes Fondation，Norwich，England.-Hudson G.S.et DaVidson B.E.(1984)分子生物学，1801023-1051.-Kuhstoss S.，Richardson M.A.，et Rao R.N.(1991)基因97143-146.-Maniatis T.，Fritsh E.F.et Sambrook J.(1989)分子克隆实验室手册Cold Spring Harbor，N.Y.，-Messing J.，Crea R.et Seeburg P.H.(1981)核酸研究，9309.-Molinero A.A.，Kingston D.G.I.，et Reed J.W.(1989)天然产物，5299-108.-Omer C.A.，LenstraR.，Litle P.J.，Dean J.，Tepperman J.M.，LetoK.J.，Romesser J.A.，et O’Keefe D.P.(1990)细菌，1723335-3345.-Reed J.W.，PurVis M.B.，Kingston D.G.I.，Biot A.，et GosseleF.(1989)有机化学541161-1165.-Standen R.et McLachlan A.D.(1982)核酸研究，10141-156.-Schindler U.，Sans N.，et Schroder J.(1989)细菌171847-854.-Thorson J.S.；Lo S.F.，et Liu H-W.(1993)美国化学会志1156993-6994.-VideauD.(1982)生物病理学30529-534.
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称罗纳普朗克罗莱尔有限公司(B)街名Reymond ARON街20号(C)城市安托尼(E)国家法兰西(F)邮编92165(ii)发明名称新型链阳性菌素和通过突变合成制备链阳性菌素的方法。
(iii)序列数8(iv)计算机可读形式(A)介质类型磁带(B)计算机IBM兼容机(C)开发系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patent In Release#1.0，Version#1.25(OEB)(2)SEQ ID No1的信息(i)序列特征(A)长度2888个碱基对(B)类型核酸(C)链的数目双链(D)构型线性(ii)分子类型ADNc(iii)假设无(iii)反义无(vi)来源(A)有机体始旋链霉菌(xi)序列描述SEQ ID No110 20 30 40 50 60CTGCAGTTCC CCGGGGCCAC CGTGCTCAGC TCCTCACCCG AACGGTTCCT GCGCATCGGC70 80 90100110120GCGGACGGCT GGGCGGAGTC CAAACCCATC AAGGGCACCC GCCCCCGCGG CGCCGGCCCC130140150160170180GCCCAGGACG CCGCCGTCAA GGCCTCCCTC GCCGCGGCCG AGAAGGACCG CAGCGAGAAC190200210220230240CTGATGATCG TCGACCTGGT CCGCAACGAC CTCGGCCAGG TCTGCGACAT CGGCTCCGTC250260270280290300CACGTACCGG GCCTGTTCGA GGTGGAGACC TACGCCACCG TCCACCAGCT CGTCAGCACG310320330340350360GTCCGCGGCC GCCTGGCGGC CGACGTCTCC CGCCCCCGCG CGGTACGGGC CGCCTTCCCC
370380390400410420GGCGGGTCGA TGACCGGCGC GCCCAAGGTC CGCACCATGC AGTTCATCGA CCGGCTCGAG430440450460470480AAGGGCCCGC GCGGCGTGTA CTCGGGCGCG CTGGGCTACT TCGCCCTCAG CGGCGCGGCC490500510520530540GACCTCAGCA TCGTCATCCG CACCATCGTC GCCACCGAGG AGGCCGCCAC CATCGGCGTG550560570580590600GGCGGCGCCG TCGTCGCCCT GTCCGACCCC GACGACGAGG TCCGCGAAAT GCTCCTCAAG610620630640650660GCGCAGACCA CCCTCGCCGC CCTGCGCCAG GCACACGCGG GCGCCACCGC CTCGGACCGT670680690700710720GAACTCCTGG CCGGCAGCCT GCGGTGACCC ACCCACCGCC CCACCCCGGC CACCGCAACC730740750760770780CCGGCTCACC CCCGGGGCGG CCGCGCGCGG TGCCGCCCGG CGGCCGACCC GGCGACGGGT790800810820830840CCGCTCGCGG ACCGGGTGAC GGACCCGGCG GCGGGGCCGG CGGCGGGCCG GGACGTGGGC850860870880890900CGGGACGTGG GCCCGGCGTC CCCGGCGACC GGCACGGCGG CGGGCCCGGA CGTGGGCCCG910920930940950960GCGTGCCCGG CGACCGGCAC GGTGGCGGGG CGGGGCGGGG GACGGTCAGT GCAGGGCGGT970980990 1000 1010 1020GAACATCCGC GCGCACAGCC GTTCCAGCTC CGCGCCGTGC TCGCCCAGCA CACCGCGCAG1030 1040 1050 1060 1070 1080TTCGGCGAAC AGGGCGGCGA ACGTCTCCTC GTCGCCCCTC TCGACGGCCT GCCCCAGCCG1090 1100 1110 1120 1130 1140CACCAGGCCG CGGCCCAGCG CCTGCCGCGC GGCCGGCGCG CCGGGGTTGG CGGCCTGGAT1150 1160 1170 1180 1190 1200GTCGAAATAC ACCTCCGGCG TCCCGCCGGC GATCCGGGCC AGCAGCGCCA GCATCGCCAG1210 1220 1230 1240 1250 1260ATGCGGCGGC GGGGCACTGT CCCGCAGCGC CCCCACGTCC ACCGACAGCT CACCCAGGCC1270 1280 1290 1300 1310 1320CAGCCCGAAG GCCAGCACCG CGGCATGCGT GGCGGCCTGC TGCGCGGCGG TCAGCTCGTC1330 1340 1350 1360 1370 1380GTGCCGCCGC GCCGGCATCT CCACCACCCG GGCCCCCCAC CCGGCCACCA GCTCCACCAG1390 1400 1410 1420 1430 1440GGCCCGCACA CCGGGCCCGT CGGTGACCAC CACCGCCGCC ACCGGCCGCC CCTGAAGACC1450 1460 1470 1480 1490 1500CAGCGAGGGG GCGAACATCG GGTTCAGCCC CACCGCCTGC AGCCCCGGCG CCGCCTCACG1510 1520 1530 1540 1550 1560CAGCCGCCCG GCGATCCGGC TCTTGACCGA CAAGGTGTCC GCGAGCACCG CACCGGGCCG1570 1580 1590 1600 1610 1620CATCACCCCC GCCAGCACCT CCACCGCCTC CCACGCCACC GGCTCCGGCA CCGCCAGCAC1630 1640 1650 1660 1670 1680CACCACGTCC GCCGCCGCCA GCGCCGCGAC CGCCTCCGGC CCCGGCCGCC GCACATCACC1690 1700 1710 17201730 1740GGCCACCACC CGCACCCCGT CCGCCGCACC GGCCCCGGCC ACGTCCAGCC AGGTCACCGC1750 1760 1770 1780 1790 1800CACCCCCGAA CGCACCAGCC AGTGGCTGAA CATGCGGCCC ACCGCACCGG CCCCGCCCAC1810 1820 1830 1840 1850 1860CACCACACAA CGCCCGAACA CCGAACCACC CCTCATCCGC GTTCCCGATC CCCCCGGTAC1870 1880 1890 1900 1910 1920GGAGGAAGAA CCATGACCCC GCCCGCCATC CCCGCCGCCC CGCCCGCCAC CGGGCCCGCC1930 19401950 1960 1970 1980CCCGCCACCG ACCCCCTCGA CGCGCTGCGC GCCCGCCTGG ACGCCGCGGA CGCCGCCCTG1990 2000 2010 2020 2030 2040CTGGACGCCG TCCGCACACG CCTGGACATC TGCCTGCGCA TCGGCGAGTA CAAGCGCCTC2050 2060 2070 2080 2090 2100CACCAGGTGC CGATGATGCA GCCCCACCGG ATCGCCCAGG TCCACGCCAA CGCCGCCCGC2110 2120 2130 2140 2150 2160TACGCCGCCG ACCACGGCAT CGACCCCGCC TTCCTGCGCA CCCTGTACGA CACGATCATC2170 2180 2190 2200 2210 2220ACCGAGACCT GCCGCCTCGA GGACGAGTGG ATCGCCTCCG GCGGCGCCCC CGTCCCCACG2230 2240 2250 2260 2270 2280CCCGTGCACG CGTCCGCGTC CGCGCGGGGG GCCGTGTCGT GACCGCCGCC GCACCCACCC2290 2300 2310 2320 2330 2340TCGCCCAGGC GCTGGACGAG GCCACCGGGC AGCTGACCGG CGCCGGGATC ACCGCCGACG2350 2360 2370 2380 2390 2400CCGCCCGGGC CGACACCCGG CTGCTGGCCG CCCACGCCTG CCAGGTCGCC CCGGGGGACC2410 2420 2430 2440 2450 2460TCGACACCTG CCTGGCCGGC CCGGTGCCGC CCCGGTTCTG GCACTACGTC CGGCGCCGTC2470 2480 2490 2500 2510 2520TGACCCGCGA ACCCGCCGAA CGCATCGTCG GCCACGCCTA CTTCATGGGC CACCGCTTCG2530 2540 2550 2560 2570 2580ACCTGGCCCC CGGCGTCTTC GTCCCCAAAC CCGAGACCGA GGAGATCACC CGGGACGCCA2590 2600 2610 2620 2630 2640TCGCCCGCCT GGAGGCCCTC GTCCGCCGCG GCACCACCGC ACCCCTGGTC GTCGACCTGT2650 2660 2670 2680 2690 2700GCGCCGGACC GGGCACCATG GCCGTCACCC TGGCCCGCCA CGTACCGGCC GCCCGCGTCC2710 2720 2730 2740 2750 2760TGGGCATCGA ACTCTCCCAG GCCGCCGCCC GCGCCGCCCG GCGCAACGCC CGCGGCACCG2770 2780 2790 2800 2810 2820GCGCCCGCAT CGTGCAGGGC GACGCCCGCG ACGCCTTCCC CGAACTGAGC GGCACCGTCG2830 2840 2850 2860 2870 2880ACCTCGTCGT CACCAACCCG CCCTACATCC CCATCGGACT GCGCACCTCC GCACCCGAAGTGCTCGAG(3)SEQ ID No2的信息(i)序列特征(A)长度888个碱基对(B)类型核酸(C)链的数目双链(D)构型线性(ii)分子类型ADNc(iii)假设无(iii)反义无(vi)来源(A)有机体始旋链霉菌(xi)序列描述SEQ ID No2ATG AGG GGT GGT TCG GTG TTC GGG CGT TGT GTG GTG GTG GGC GGG GCC GGT GCG 54Met Arg Gly Gly Ser Val Phe Gly Arg Cys Val Val Val Gly Gly Ala Gly Ala 18GTG GGC CGC ATG TTC AGC CAC TGG CTG GTG CGT TCG GGG GTG GCG GTG ACC TGG108Val Gly Arg Met Phe Ser His Trp Leu Val Arg Ser Gly Val Ala Val Thr Trp 36CTG GAC GTG GCC GGG GCC GGT GCG GCG GAC GGG GTG CGG GTG GTG GCC GGT GAT162Leu Asp Val Ala Gly Ala Gly Ala Ala Asp Gly Val Arg Val Val Ala Gly Asp 54GTG CGG CGG CCG GGG CCG GAG GCG GTC GCG GCG CTG GCG GCG GCG GAC GTG GTG216Val Arg Arg Pro Gly Pro Glu Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asp Val Val 72GTG CTG GCG GTG CCG GAG CCG GTG GCG TGG GAG GCG GTG GAG GTG CTG GCG GGG270val Leu Ala Val Pro Glu Pro Val Ala Trp Glu Ala Val Glu Val Leu Ala Gly 90GTG ATG CGG CCC GGT GCG GTG CTC GCG GAC ACC TTG TCG GTC AAG AGC CGG ATC324Val Met Arg Pro Gly Ala Val Leu Ala Asp Thr Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile108GCC GGG CGG CTG CGT GAG GCG GCG CCG GGG CTG CAG GCG GTG GGG CTG AAC CCG378Ala Gly Arg Leu Arg Glu Ala Ala Pro Gly Leu Gln Ala Val Gly Leu Asn Pro126ATG TTC GCC CCC TCG CTG GGT CTT CAG GGG CGG CCG GTG GCG GCG GTG GTG GTC432Met Phe Ala Pro Ser Leu Gly Leu Gln Gly Arg Pro Val Ala Ala Val Val Val144ACC GAC GGG CCC GGT GTG CGG GCC CTG GTG GAG CTG GTG GCC GGG TGG GGG GCC486Thr Asp Gly Pro Gly Val Arg Ala Leu Val Glu Leu Val Ala Gly Trp Gly Ala162CGG GTG GTG GAG ATG CCG GCG CGG CGG CAC GAC GAG CTG ACC GCC GCG CAG CAG540Arg Val Val Glu Met Pro Ala Arg Arg His Asp Glu Leu Thr Ala Ala Gln Gln180GCC GCC ACG CAT GCC GCG GTG CTG GCC TTC GGG CTG GGC CTG GGT GAG CTG TCG594Ala Ala Thr His Ala Ala Val Leu Ala Phe Gly Leu Gly Leu Gly Glu Leu Ser198GTG GAC GTG GGG GCG CTG CGG GAC AGT GCC CCG CCG CCG CAT CTG GCG ATG CTG 648Val Asp Val Gly Ala Leu Arg Asp Ser Ala Pro Pro Pro His Leu Ala Met Leu 216GCG CTG CTG GCC CGG ATC GCC GGC GGG ACG CCG GAG GTG TAT TTC GAC ATC CAG 702Ala Leu Leu Ala Arg Ile Ala Gly Gly Thr Pro Glu Val Tyr Phe Asp Ile Gln 234GCC GCC AAC CCC GGC GCG CCG GCC GCG CGG CAG GCG CTG GGC CGC GGC CTG GTG 756Ala Ala Asn Pro Gly Ala Pro Ala Ala Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Val 252CGG CTG GGG CAG GCC GTC GAG AGG GGC GAC GAG GAG ACG TTC GCC GCC CTG TTC 810Arg Leu Gly Gln Ala Val Glu Arg Gly Asp Glu Glu Thr Phe Ala Ala Leu Phe 270GCC GAA CTG CGC GGT GTG CTG GGC GAG CAC GGC GCG GAG CTG GAA CGG CTG TGC 864Ala Glu Leu Arg Gly Val Leu Gly Glu His Gly Ala Glu Leu Glu Arg Leu Cys 288GCG CGG ATG TTC ACC GCC CTG CAC 888Ala Arg Met Phe Thr Ala Leu His 296(4)SEQ No3的信息(i)序列特征(A)长度387个碱基对(B)类型核酸(C)链的数目双链(D)构型线性(ii)分子类型ADNc(iii)假设无(iii)反义无(vi)来源(A)有机体始旋链霉菌(xi)序列描述SEQ ID No3ATG ACC CCG CCC GCC ATC CCC GCC GCC CCG CCC GCC ACC GGG CCC GCC CCC GCC 54Met Thr Pro Pro Ala Ile Pro Ala Ala Pro Pro Ala Thr Gly Pro Ala Ala Ala 18ACC GAC CCC CTC GAC GCG CTG CGC GCC CGC CTG GAC GCC GCG GAC GCC GCC CTG108Thr Asp Pro Leu Asp Ala Leu Arg Ala Arg Leu Asp Ala Ala Asp Ala Ala Leu 36CTG GAC GCC GTC CGC ACA CGC CTG GAC ATC TGC CTG CGC ATC GGC GAG TAC AAG162Leu Asp Ala Val Arg Thr Arg Leu Asp Ile Cys Leu Arg Ile Gly Glu Tyr Lys 54CGC CTC CAC CAG 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GCCGGTCGCA190200210220230240CCAGCGGTCC AGGGCACGGT AGGTGACACG GGAGCACCCG TCCGCGCCGA CCAGCGCCTC250260270280290300CCGCTCGCCG TACTGCTCCG CCCAGCGGCC CAGCAGCATG CCCAGCGGCT CGCCCCGCCA310320330340350360GTAGCCGGCC GCCCGGTACT TCGCGGCCAC ATCCTCGGGC CAGGGAACGC ATCCGTCCAG370380390400410420CATCGTTGGT CCTTTCCGGC TTCGTCCTCG CGTCGCGCCC AGTGTCGGCA GCGCCGTTGA430440450460470480CACGCCGCTG ATGCGCCGCG CCCGCGCGCC GCCGCTCCGT CAGGAGCCGA TCAGGGCGGC490500510520530540GTCAGCCGGG CCGGACAGGA TGCCGCCCAC GGGGCCCGGC ACACCGGGCC GCGGCGACAG550560570580590600CGGGCCGGCG ACCGGCAGGC CGACACCACG CACGGACGAG AAGAAACAAC ACAAGGGGAG610620630640650660CACCCGATGG AGACCTGGGT CCTGGGCCGG CGCGACGTCG CCGAGGTGGT GGCCGCCGTC670680690700710720GGCCGCGACG AACTCATGCG CCGCATCATC GACCGCCTCA CCGGCGGACT GGCCGAGATC730740750760770780GGCCGCGGCG AGCGGCACCT GTCCCCGCTG CGCGGCGGAC TGGAACGCAG CGAACCCGTG790800810820830840CCCGGCATCT GGGAATGGAT GCCGCACCGC GAACCCGGCG ACCACATCAC CCTCAAGACC850860870880890900GTCGGCTACA GCCCCGCCAA CCCCGGCCGC TTCGGCCTGC CGACCATCCT 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Ala Ile Leu Leu126GTC CAC TAC GGC GGC AAC CCG GCC GAC ATG GAC CGC ATC ATG GCC CTG GCC CGC432Val His Tyr Gly Gly Asn Pro Ala Asp Met Asp Arg Ile Met Ala Leu Ala Arg144AAG CGC GGC ATC ATC GTC GTC GAG GAC AGC GCG CAC GCG CTG GGC GCC GTG TAC486Lys Arg Gly Ile Ile Val Val Glu Asp Ser Ala His Ala Leu Gly Ala Val Tyr162CGG GGG CGG CGG CCG GGG GCA CTG GCG GAC ATC GGC TGC TTC ACT TTC CAC TCC540Arg Gly Arg Arg Pro Gly Ala Leu Ala Asp Ile Gly Cys Phe Thr Phe His Ser180ACG AAG AAC ATC ACC ACC CTC GGC GAG GGC GGC ATG ATC ACC CTG TCG CGT GAC 594Thr Lys Asn Ile Thr Thr Leu Gly Glu Gly Gly Met Ile Thr Leu Ser Arg Asp 198GAG TGG GCC CAG CGG GTG GGA CGT ATC CGC GAC AAC GAG GCC GAC GGC GTG TAC 648Glu Trp Ala Gln Arg Val Gly Arg Ile Arg Asp Asn Glu Ala Asp Gly Val Tyr 216GCG GCG CTG CCG GAC TCC GCG CGG GCG GGT GCT CCG GCG CTG CTG CCG TGG ATG 702Ala Ala Leu Pro Asp Ser Ala Arg Ala Gly Ala Pro Ala Leu Leu Pro Trp Met 234AAG TTC GCG GAG GGT GTG TAC GGT CAC CGG GCG GTC GGG GTC CGC GGG GCG GGC 756Lys Phe Ala Glu Gly Val Tyr Gly His Arg Ala Val Gly Val Arg Gly Ala Gly 252ACG AAC GCG ACG ATG TCG GAG GCG GCG GCG GCG GTG GGC GTG GTG CAA CTG GCG 810Thr Asn Ala Thr Met Ser Glu Ala Ala Ala Ala Val Gly Val Val Gln Leu Ala 270TCG CTG GAG CGG TTC GTG GCC CGG CGC CGG AGC ATC GCG CAG CGG CTG GAC GAG 864Ser Leu Glu Arg Phe Val Ala Arg Arg Arg Ser Ile Ala Gln Arg Leu Asp Glu 288GCC GTG GCC TCG GTG GCC GGC ACC CGG CTG CAC CGG GCG GCG GCG GAC AGT CTG 918Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Thr Arg Leu His Arg Ala Ala Ala Asp Ser Leu 306CAC GCC TAC CAC CTG TAC ACG TTC TTC CTC ACC GGC GGC CGG CAG GTG CGG GAG 972His Ala Tyr His Leu Tyr Thr Phe Phe Leu Thr Gly Gly Arg Gln Val Arg Glu 324CGG TTC GTG CGC GCC CTG GAC CGG CTG GGT GTG GAG GTC CAG TTG CGG TAC TTC 1026Arg Phe Val Arg Ala Leu Asp Arg Leu Gly Val Glu Val Gln Leu Arg Tyr Phe 342CCG CTC CAT CTG TCG CCC GAG TGG CGG CTG CGC GGC CAC GGG CCG GGC GAG TGT 1080Pro Leu His Leu Ser Pro Glu Trp Arg Leu Arg Gly His Gly Pro Gly Glu Cys 360CCG ACG GCC GAA CGG GTC TGG TTC GAG GAG CAC ATG AAC CTG CCG TGC CAT CCC 1134Pro Thr Ala Glu Arg Val Trp Phe Glu Glu His Met Asn Leu Pro Cys His Pro 378GGT CTG AGT GAC GGC CAG GTC GAC TAC ATG GTC GAG GCG GTC ACC CGC GCC CTG 1188Gly Leu Ser Asp Gly Gln Val Asp Tyr Met Val Glu Ala Val Thr Arg Ala Leu 396CAC GAG GCC CAC GGC ACG GGG ACG CGG GTG GCG GCC GGG CAC CTG 1233His Glu Ala His Gly Thr Gly Thr Arg Val Ala Ala Gly His Leu 41权利要求
1.一种化合物，其特征在于如通式(I)所示 式中-R2和R4各自代表氢原子或甲基，-R3代表氢原子或羟基，-X代表CO、CHOH或CH2，-R1代表 -对于间位衍生物来说A、C、D和E代表氢原子B可以代表-卤原子，优选为氟原子-一烷基氨基或二烷基氨基，其中烷基优选为甲基或乙基，-醚基，-硫醚基，-C1-3烷基-三卤代甲基，优选三氟甲基，对于对位衍生物A，B，D和E代表氢原子C代表-卤原子-基团NR1R2，其中R1和R2分别代表选自下列种类的基团氢原子，C1-4直链或支链烷基，当R1与R2其中之一为甲基时，另一个则必须为乙基，其中环烷基含3-4个碳原子的烷基-环烷基甲基，可被取代的C3-4环烷基，C1-4直链或支链烯基，当R1或R2其中之一为链烯基时，另一个则不得为甲基或C3-6环烷基，-被取代或未被取代的N-吡咯烷基，-醚基，-硫醚基，-酰基或烷氧羰基，-直链或支链C1-6烷基，优选自甲基、异丙基和叔丁基，-烷硫基甲基，-芳基，以苯基为佳-三卤代甲基，以三氟甲基为佳，对于间位二取代衍生物A、D和E代表氢原子B可以代表-卤原子，优选为氟原子-一烷基氨基或二烷基氨基，其中烷基优选为甲基或乙基，-醚基，-硫醚基，-C1-3烷基C可以代表-卤原子，以氟原子为佳，-氨基、其中烷基优选为甲基的一烷基氨基或二烷基氨基，条件是B不得为溴原子或氯原子，或者被取代或未被取代的烯丙基，-醚基，-硫醚基，-C1-6烷基，-三卤代甲基，以三氟甲基为佳对于邻-对位二取代衍生物B、E和D代表氢原子，A和C为甲基。
2.按照权利要求1的化合物，其特征在于它优选为4ζ-甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，5γ-羟基-4ζ-甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ζ-甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-甲氧羰基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-氯-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-溴-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-溴-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ζ-碘-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-碘-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ζ-三氟甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-三氟甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ζ-叔丁基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-异丙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-异丙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IE，4ε-甲胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ε-甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ε-甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ε-氟-4ζ-甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-二乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-烯丙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-二烯丙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-烯丙基乙胺基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙基丙氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙基异丙氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙基甲基环丙氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-(1-吡咯烷基)-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-三氟甲氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-烯丙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-甲硫基甲基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-(2-氯乙氧基)-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙酰基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ζ-乙基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IH，4ε-二甲氨基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ε-甲硫基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA，4ε-乙氧基-脱(4ζ-二甲胺基)普那霉素IA。
3.制备链阳性菌素的方法，其特征在于利用具有至少一种能够影响B组链阳性菌素前体的生物合成法的基因修饰的链阳性菌素的生产性微生物的菌株，所述突变菌株于完全和补体培养基中与至少一种其生物合成方式未被改变的原始前体一起培养，回收所述链阳性菌素。
4.按照权利要求3的方法，其特征在于突变菌株具有至少一个定位于B组链阳性菌素前体的生物合成过程中涉及的基因之一的基因修饰。
5.按照权利要求4的方法，其特征在于其表达得到改变的基因选自下列物质的生物合成过程涉及的基因L-2-氨基丁酸、4-二甲氨基-L-苯基丙氨酸(DMPAPA)、L-2-哌啶酸、L-苯基甘氨酸和/或3-羟基吡啶甲酸。
6.按照权利要求4或5的方法，其特征在于涉及至少一种选自下列的基因papA、papM、papC(SEQ ID n°2)、papB(SEQ ID n°3)、papA(SEQ ID n°5)、snbF(SEQ ID n°6)和hpaA(SEQ ID n°8)。
7.按照权利要求3-6中任一项的方法，其特征在于所述基因修饰使至少一种B组链阳性菌素前体的生物合成过程涉及的基因部分或完全地无法为天然酶编码。
8.按照权利要求3-7中任一项的方法，其特征在于基团修饰在于破裂在B组链阳性菌素前体的生物合成过程中涉及的基因之一。
9.按照上述权利要求中任一项的方法，其特征在于所用的突变菌株来自始旋链霉菌株，优选为始旋链霉菌SP92菌株。
10.按照权利要求9的方法，其特征在于优选涉及菌株SP92∷pVRC 508。
11.按照权利要求9的方法，其特征在于优选涉及菌株SP212。
12.按照权利要求9的方法，其特征在于优选涉及菌株SP92pipA∷ΩamR。
13.按照权利要求9的方法，其特征在于优选涉及菌株SP 92 hpa_A∷ΩamR。
14.按照上述权利要求中任一项的方法，其特征在于优选涉及被加入培养基的原始前体选自氨基酸和α-酮基羧基的衍生物或类似物。
15.按照上述权利要求中任一项的方法，其特征在于优选的原始前体属于其生物合成方法得到改变的前体。
16.按照权利要求14或15的方法，其特征在于原始前体在其表达得到改变的基因涉及DMPAPA的生物合成过程时优选为苯基丙氨酸衍生物。
17.按照上述权利要求中任一项的方法，其特征在于适用于制备普那霉素IB。
18.核苷酸序列，其特征在于选自(a)部分或全部基因papC(SEQ ID n°2)、papB(SEQ ID n°3)、pipA(SEQ ID n°5)、snbF(SEQ ID n°6)和hpaA(SEQ ID n°8)，(b)与部分或全部基因(a)杂交的序列，(c)由于遗传密码的简并而由序列(a)和(b)衍生的序列。
19.按照权利要求18的核苷酸序列，其特征在于选自基因papC(SEQ ID n°2)、papB(SEQ ID n°3)、pipA(SEQ ID n°5)、snbF(SEQID n°6)和hpaA(SEQ ID n°8)。
20.含有选自下列基因的重组DNApapC(SEQ ID n°2)、papB(SEQ ID n°3)、pipA(SEQ ID n°5)、snbF(SEQ ID n°6)和hpaA(SEQ ID n°8)。
21.载体，其特征在于含有权利要求18或19的核苷酸序列或权利要求20的重组DNA。
22.权利要求18或19的序列和/或权利要求21的载体在制备代谢物方面的用途。
23.由权利要求18或19的序列表达得到的多肽。
24.始旋链霉菌突变菌株，其特征在于具有至少一个基因修饰处于下列基因之一之上papC(SEQ ID n°2)、papB(SEQ ID n°3)、pipA(SEQ ID n°5)、snbF(SEQ ID n°6)、和/或hpaA(SEQ ID n°8)。
25.按照权利要求24的突变菌株，其特征在于涉及菌株SP92pipA∷ΩamR。
26.按照权利要求24的突变菌株，其特征在于涉及菌株SP92hpaA∷ΩamR。
27.始旋链霉菌突变菌株，其特征在于具有一种基因修饰，包括由双同源重组如SP212进行的基因papA的破裂。
28.化合物，其特征在于涉及4-三氟甲氧基苯基丙氨酸、3-甲氨基苯基丙氨酸，3-甲硫基苯基丙氨酸，3-氟-4-甲基苯基丙氨酸，4-甲胺基苯基丙酮酸，3-乙氧苯基丙氨酸，4-烯丙基氨基苯基丙氨酸，4-二烯丙基氨基苯基丙氨酸，4-烯丙基乙基氨基苯基丙氨酸，4-乙基丙基氨基苯基丙氨酸、4-乙基异丙基氨基苯基丙氨酸，4-乙基甲基环丙基氨基苯基丙氨酸，4-(1-吡咯烷基)苯基丙氨酸，4-乙硫基甲基苯基丙氨酸，4-O-(2-氯乙基)酪氨酸，3-二甲胺基苯基丙氨酸和3-乙胺基苯基丙氨酸。
29.药物组合物，其特征在于含有至少一种与或不与A组链阳性菌素结合的权利要求1或2的化合物。
全文摘要
本发明涉及属于B组链阳性菌素的新型化合物I以及利用突变微生物通过突变合成以便改变至少一种B组链阳性菌素前体的生物合成过程来制备链阳性菌素的方法。这些前体的生物合成过程涉及的新型核苷酸序列及其用途。
文档编号C07C233/25GK1152338SQ9519402
公开日1997年6月18日 申请日期1995年7月4日 优先权日1994年7月8日
发明者V·伯兰兹, D·蒂伯特, N·巴马斯-杰库斯, F·伯兰切, J·克罗泽特, J-C·巴里尔, L·德布斯切, A·法米崇, J-M·帕里斯, G·杜特鲁-罗斯特 申请人:罗纳-布朗克罗莱尔股份有限公司