专利名称：：一种结核病诊断试剂及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属诊断试剂领域，涉及结核病诊断试剂及试剂盒，具体涉及含结核分支杆菌Rvl985c蛋白的诊断试剂及试剂盒。
背景技术：
：结核病是当今全球面临的主要公共健康问题之一，它的病原体是结核分枝杆菌，属分枝杆菌属。据报道，全世界每年约有800-1000万新发结核病例，每年有200-300万人因此而失去生命。结核病已成为引起成年人死亡的头号传染病。据WHO报道，全球三分之一的人口(约20亿)已感染了结核杆菌，如不采取措施，近10年内还将有约3亿人受结核杆菌感染。据第四次全国流行病学调查显示，我国受结核杆菌感染人数超过4亿，每年有13万人死于结核病，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二。特异性抗原诊断一直是确认病原体感染及评估感染状况较为可靠的方法，且有早期诊断价值，已经在HBV、HCV、HIV等疾病的诊断方面获得了广泛的应用。目前，临床结核病诊断广泛使用皮肤检测试剂结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)。然而，结核分枝杆菌纯蛋白衍生物存在与环境分枝杆菌以及结核病疫苗即卡介苗(M.bovisBCG)菌株的交叉反应，其诊断价值被削弱。而血清学检测具有快速、特异、简便和廉价等特点，因此，研制出安全简便的特异性血清学诊断试剂极为迫切。
发明内容本发明的目的是提供一种新型的结核病诊断试剂，具体涉及含结核分支杆菌Rvl985c蛋白的诊断试剂。本发明公开了一种基于血清学方法的结核杆菌检测抗原Rvl985c蛋白。该来自于卡介苗基因组相对结核分枝杆菌缺失的区域(RD2区)，由结核分枝杆菌基因Rvl985c所编码的蛋白。结核杆菌Rvl985c蛋白包含303个氨基酸，分子量32.8kDa，等电点pl为9.05。该蛋白具有序列1的氨基酸序列。所述的Rvl985c蛋白可由结核分枝杆菌或其它少数几种分枝杆菌表达，该抗原感染人体后或经结核杆菌感染后，能被Th细胞所识别，刺激合成B细胞生长和分化因子。在Rvl985c抗原和B细胞分化因子的共同作用下B细胞活化和增值，并最终在淋巴器官的T细胞区中分化成为浆细胞，并产生针对该抗原的抗体，该抗体能够特异地与Rvl985c蛋白发生免疫反应。通常抗体存在于体液或其它介质中，包括痰液、血清、尿液、脑髓液、肺泡灌洗液、胸腔积液等。抗体生物学实质是一类免疫球蛋白，主要分为IgG，IgM，IgA，IgD，IgE五类，其中具有诊断价值的主要是IgG和IgM。所述的Rvl985c蛋白能制成诊断试剂用于结核病的免疫反应检测。本发明所涉及的可用于检测的免疫反应包括凝集实验，沉淀实验，免疫荧光实验，小吞噬实验，E花环实验，ELISA实验，斑点免疫金渗滤实验，胶体金免疫层析法等。典型诊断用免疫试验是酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)，由于大多数蛋白都可与塑料或聚酯板非特异性结合，可通过将含抗体的待测样品与包被Rvl985c抗原的塑料板相互作用，形成的抗原抗体复合物与酶联的第二抗体进行反应，洗去未结合的酶标抗体，加入底物后产生带有颜色的产物，在检测仪上测得增加的光吸收值。本发明上下文中所述蛋白除了通常所指的一种氨基酸聚合物，还应该包括其类似物。所述类似物，是指其特性与所述蛋白相同，包括其同样可以与抗体特异性地结合。通常包含一部分蛋白序列，代表性的是所述类似物具有相同的形状、大小、柔韧性、电子排布等。上述抗原的典型类似物是肽。它可与上述蛋白序列同源。这种同源肽通常具有至少75%的同源性，优选至少90%、95%的同源性。其不同一般来自于氨基酸残基的替换、插入、缺失和修饰，可发生在序列的N端、C端或其他任何位置上。具有代表性的是类似物可以结合到相同的抗体分子上，且类似物中处于等价位置上的氨基酸与原始肽中的那些抗原序列相同或保守。所述的修饰，通常指的是天然的转录后修饰或人工修饰。修饰可提供化学部分的改变，包括氨基、乙酰基、羟基、卤素基团和碳水化合物基团。具有代表性的是一种是氨基酸侧链的修饰，即形成一个或多个非天然氨基酸。所述的蛋白和多肽可以通过天然分离获得，也可以通过人工合成。一种具有代表性的方法是用较长的融合蛋白制备上述肽段，此融合蛋白包含上述代表性的肽段序列。所述肽也可由多肽经过物理或化学裂解所产生。此外，本说明书中涉及所有氨基酸序列都是从N端到C端的。本发明的另一重要目的是提供一种快速检测结核感染的方法，主要包括以下步骤a)使用Rvl985c抗原包被96孔板或其他吸附蛋白介质；b)采集待测样品，通常是受试者的血清，稀释一定倍数；c)将稀释后样品加入介质中与Rvl985c反应；d)加入酶联或胶体金等染料偶联试剂，该试剂能与Rvl985c抗原抗体复合物特异反应。典型的试剂如酶联Rvl985c多肽，ProteinA，抗IgG、IgM二抗等；e)直接显色或加入显色剂显色；f)肉眼或仪器读取颜色的改变，以超过一定域值的颜色改变判定为阳性检测。具体可参照实施方案1和2。值得注意的是，该方法至少使用Rvl985c—种抗原用于检测相应抗体，但不局限于该种抗原。与其他有较高诊断价值的结核抗原，如LAM，38kDa，30kDa,16KDa，A60等抗原一起使用，可以提高检测的阳性检出率。实施例1中，联合使用LAM和38KDa抗原，可使阳性检测率从59%提高到75%，同时检测保持很高的特异性。本发明的再一个目的是提供一种快速检测结核病的诊断试剂盒。它包含上述重组蛋白Rvl985c和Rvl985c抗体的阳性对照试剂，这类试剂可以是含Rvl985c阳性抗体的动物血清或通过杂交瘤细胞培育出的Rvl985c单克隆抗体。如待测者体液中抗体的滴度超过了阳性对照试剂，则判定为阳性。本发明的试剂盒中，除了有重组抗原Rvl985c和其特异性抗体外，还应有用于检测的各种试剂和器具，包括各种缓冲液、稀释液、反应液和终止液。在本发明的一个实施例中，结核检测试剂盒还包括如下试剂和物品1)包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液)，pH9.6:1.59gNa2C03，2.93gNaHC(k2)洗涤液(PBST),pH7.4:8gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH2P04，2.9gNa2HP0412H20，0.5mlTween-20，1LH20。3)封闭液(0.1%BSA/PBS)，pH7.4:8gNaCl，0.2gKC1，0.2gKH2P04，2.9gNa2HP0,12H20，0.lgBSA(牛血清白蛋白)，1LH20。4)底物缓冲液，0.2MNaH2P04(28.4克/L)25.7ml，0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml，加蒸馏水50ml。55)显色液20ml底物缓冲液，8mg0PD，25ul30%H202。6)终止液(2MH2S04),200ml:21.32mlH2S04，178.68mlH20。7)过氧化物酶标记山羊抗人IgG和IgM。8)96孔酶标板(NalgeNuncInternational)本发明提供了特异性和敏感性俱佳的结核快速检测试剂，可对受试者血液或体液作出是否感染结核分支杆菌的快速诊断，从免疫胶体金的15分钟到ELISA的5个小时不等。作为诊断试剂用于被临床证实的活动性结核时，单独使用Rvl985c抗原检测敏感性达到59%，特异性96%;与其他诊断抗原(如与对照抗原LAM/38kDa)合并使用使，可进一步提高诊断敏感性，达75%，具有较高临床应用价值。本发明的检测只需要单份血清样品，化验简单、快速、不需要专业实验室设备，成本低廉，当天可得到结果，非常适合广大乡镇农村医院和战地条件下的结核感染检测。图1是1985c抗原ELISA检测结果。具体实施例方式实施例1制备结核检测试剂及试剂盒本发明的试剂盒中，含有重组抗原Rvl985c和其特异性抗体，还含有用于检测的各种试剂和器具，包括各种缓冲液、稀释液、反应液和终止液，具体包括如下试剂和物a1)包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液)，pH9.6:1.59gNa2C03，2.93gNa线.2)洗涤液(PBST)，pH7.4:8gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH2P04，2.9gNa異12H20，0.5mlTween-20，1LH20。3)封闭液(0.1%BSA/PBS)，pH7.4:8gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH2P04，2.9gNa2HP0412H20,0.lgBSA(牛血清白蛋白)，1LH20。4)底物缓冲液，0.2MNaH2P04(28.4克/L)25.7ml，0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml，加蒸馏水50ml。5)显色液20ml底物缓冲液，8mg0PD，25ul30%HA。6)终止液(2MH2S04),200ml:21.32mlH2S04，178.68mlH20。7)过氧化物酶标记山羊抗人IgG和IgM。8)96孑L酶标板(NsilgeNuncInternational)实施例2ELISA实验检测肺结核检测的样本为血清，采集全血加入2.0mg/ml的EDTA抗凝剂后，离心3000rpm，10min后，收集上清部分。保存时可以分装入冻存管存放入-70度冰箱。此实施例样本分为两组肺结核患者和健康者对照。肺结核患者是从2007年5月起在济南的山东省肺科医院、重庆的肺科医院组织招募的。健康对照者一部分来源于上述医院(非结核病患者或医务人员)，另一部分是2008年4月在复旦大学、上海华山医院组织招募的非结核病患者或医务人员。两组人群的收录标准如下肺结核患者临床痰涂片或结核分枝杆菌培养阳性，临床检査与X射线检查结果相符，HIV检测阴性。健康者接种过BCG疫苗，无发热，近期无结核病人接触史的健康人群。HIV检测阴性。表1是样本统计资料。表l肺结核病人(p)健康对照(H)人数14668所在城市重庆(126)济南(20)上海(31)济南(37)年龄分布15752062检测步骤(1)包被Rvl985c抗原溶解于包被缓冲液中(5ug/ml);100ul/孔;4。C过夜(2)洗板洗漆液300ul/孔，3min，洗3次；(3)封闭封闭液，300ul/孔，37°C孵育lh;(4)洗板洗涤液300ul/孔，3min，洗3次；(5)加血清按IgG1:500，IgMl:100稀释后的待测血清,100ul/孔，3TC孵育lh;7(6)洗板洗漆液300ul/孔，3min，洗5次；(7)加酶标二抗新鲜稀释的酶标抗体(1:10000)100ul/孔，37°C孵育lh;(8)洗板洗涤液300ul/孔，3min，洗5次；(9)显色新鲜配置的显色液，100ul/孔，37°C5-10min(10)终止2MH2S04，50ul/孔;(11)测定酶标仪调至492nm，以第一个空白PBS对照孔调零后测各孔OD值。统计和判定以健康对照者血清标本的平均OD值加上2倍标准方差(standarddeviationSD)作为判断标准，若病人血清标本OD值大于此标准，即判断为阳性，反之则为阴性。利用SPSS(StatisticsPackageforSocialScience)对结核病人和健康对照者两组之间进行统计分析，采用非配对分组t-检验(ind印endentgroupt-test)进行组别间差别的显著性测定，若P〈0.05，为样品间存在显著性差异；若P〈0.01，为样品间存在极显著性差异。PathozymeMycoG对照实验-所述的PathozymeMycoG是英国OmegaDiagnostics公司生产的检测人血清中由于分枝杆菌感染而产生IgG抗体的试剂。MycoG应用有较高诊断价值的LAM和38KDa抗原，其检测特异性极高，敏感性较好，已被国际上部分机构和医院所采用。按照标准说明书操作流程，对上述结核病人和健康对照者214例样本进行检测。结果显示，Rvl985c在肺结核病人中的血清IgG敏感性为49%(71/146人)，特异性为97%(2/68人)，对病人和健康对照的阳性检出率进行t检验，t〈0.001，有极显著差异；Rvl985c在肺结核病人中的血清IgM敏感性为20%(29/145人)，特异性为97%(2/68人)，对病人和健康对照的阳性检出率进行t检验，t=0.001，表明肺结核病人与健康人群Rvl985c抗体IgG和IgM水平均有显著性差异，即结核病人显著高于健康人。联合IgG和IgM考虑，本方法检测结核病人的敏感性为59%(85/145人)，特异性为96%(3/68人)。对照方法PathozymeMycoG检测的敏感性为35%(51/146人)，特异性为98.5%(1/68人)。与对照方法相比，本方法具有更高的检测敏感性，能多检出14%的阳性患者，同时特异性与对照方法相当，都大于95%。如与对照抗原LAM/38kDa一同使用，可进一步提高检测敏感性，达到75%(109/146)，同时特异性仍然保持较高94%(4/68)。表2是抗原Rvl985c抗原在结核患者中的检测结果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例3胶体金标记检测1.取0.01%HAuC14水溶液lOOml，加入1%枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min30min，直至颜色变红且不变。2.将Rvl985c抗原与制备好的胶金以1:2比例混合，加入终浓度为1%的BSA作为稳定剂，加入终浓度为0.1%的叠氮钠作为防腐剂。3.于硝酸纤维膜上加入Rvl985c抗原10ul，放置过夜。4.第二天加入封闭液(iy。BSA溶液)5min5.加入稀释后待测血清，可采用1:10稀释6.PBS洗一遍后加入上述标记好胶体金抗原7.反应5-15分钟后判读结果，经肉眼观察，如有红色条带即判定为阳性，否则为阴性。结果显示，15分钟可判定结果，作为诊断试剂用于被临床证实的活动性结核时，单独使用Rvl985c抗原检测敏感性达到59%，特异性96%;与其他诊断抗原(如与对照抗原LAM/38kDa)合并使用使，可进一步提高诊断敏感性，达75%。由结核分枝杆菌基因Rv1985c所编码的蛋白序列表SEQUENCELISTING<110〉复旦大学附属华山医院，复旦大学<120〉一种结核病诊断试剂及试剂盒<130〉11<160〉1<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉303<212〉PRT<213>结核杆菌<400〉1MetValAspProGinLeuAspGlyProGinLeuAlaAlaLeuAlaAla151015ValValGluLeuGlySerPheAspAlaAlaAlaGluArgLeuHisVal202530ThrProSerAlaValSerGinArglieLysSerLeuGluGinGinVal354045GlyGinValLeuValValArgGluLysProCysArgAlaThrThrAla505560GlylieProLeuLeuArgLeuAlaAlaGinThrAlaLeuLeuGluSer65707580GluAlaLeuAlaGluMetGlyGlyAsnAlaSerLeuLysArgThrArg859095lieThrlieAlaValAsnAlaAspSerMetAlaThrTrpPheSerAla100105110ValPheAspGlyLeuGlyAspValLeuLeuAspValArglieGluAsp115120125GinAspHisSerAlaArgLeuLeuArgGluGlyValAlaMetGlyAla130135140ValThrThrGluArgAsnProValProGlyCysArgValHisProLeu145150155160GlyGluMetArgTyrLeuProValAlaSerArgProPheValGinArg16517017510由结核分枝杆菌基因Rv1985c所编码的蛋白序列表HisLeuSerAspGlyPheThrAlaAlaAlaAlaAlaLysAlaProSer180185190LeuAlaTrpAsnArgAspAspGlyLeuGinAspMetLeuValArgLys195200205AlaPheArgArgAlalieThrArgProThrHisPheValProThrThr210215220GluGlyPheThrAlaAlaAlaArgAlaGlyLeuGlyTrpGlyMetPhe225230235240ProGluLysLeuAlaAlaSerProLeuAlaAspGlySerPheValArg245250255ValCysAsplieHisLeuAspValProLeuTyrTrpGinCysTrpLys260265270LeuAspSerProlielieAlaArglieThrAspThrValArgAlaAla275280285AlaSerGlyLeuTyrArgGlyGinGinArgArgArgArgProGly290295300li权利要求1、一种结核病诊断试剂，其特征在于含有序列1的结核杆菌Rv1985c蛋白抗原，及所述的Rv1985c所代表的蛋白或其类似物。2、按权利要求1所述的结核病诊断试剂，其特征在于所述的结核杆菌Rvl985c蛋白包含303个氨基酸，分子量32.8kDa，等电点pl为9.05。3、按权利要求1所述的结核病诊断试剂，其特征在于所述的结核杆菌Rvl985c蛋白作为抗原由结核分枝杆菌或其它分枝杆菌表达，经抗原或结核杆菌感染人体后，使B淋巴细胞产生相应抗体，该抗体与所述的Rvl985c蛋白抗原特异结合。4、按权利要求1所述的结核病诊断试剂，其特征在于所述的抗体通过抗原抗体免疫反应被检测。5、按权利要求4所述的结核病诊断试剂，其特征在于所述的抗原抗体免疫反应包括定量或定性的沉淀实验，免疫荧光实验，小吞噬实验，E花环实验，ELISA实验，斑点免疫金渗滤实验和胶体金免疫层析法实验。6、一种快速检测结核感染的方法，其特征在于，通过抗原抗体免疫反应检测至少包含如权利要求3所述抗体水平的高低来诊断结核病感染情况，包括以下步骤1)使用Rvl985c抗原包被96孔板或其他吸附蛋白介质；2)采集待测样品，通常是受试者的血清，稀释一定倍数；3)将稀释后样品加入介质中与Rvl985c反应；4)加入酶联或胶体金染料偶联试剂，该试剂能与Rvl985c抗原抗体复合物特异反应；5)直接显色或加入显色剂显色；6)肉眼或仪器读取颜色的改变，以超过一定域值的颜色改变判定为阳性检测。7、按权利要求6所述的快速检测结核感染的方法，其特征在于所属步骤4的试剂选自酶联Rvl985c多肽，ProteinA，抗IgG或IgM二抗。8、一种快速检测结核病的试剂盒，其特征在于包含如权利要求1所述的抗原所述试剂盒通过酶联免疫吸附实验进行检测。全文摘要本发明属诊断试剂领域，涉及含结核分支杆菌Rv1985c蛋白的诊断试剂及试剂盒。本发明可对受试者血液或体液作出是否感染结核分支杆菌的快速诊断，从免疫胶体金的15分钟到ELISA的5个小时不等。作为诊断试剂用于被临床证实的活动性结核时，单独使用Rv1985c抗原检测敏感性达到59％，特异性96％；与其他诊断抗原(如与对照抗原LAM/38kDa)合并使用使，可进一步提高诊断敏感性，达75％，具有较高临床应用价值。本发明的检测只需要单份血清样品，化验简单、快速、不需要专业实验室设备，成本低廉，当天可得到结果，非常适合广大乡镇农村医院和战地条件下的结核感染检测。文档编号G01N33/68GK101661044SQ200810042130公开日2010年3月3日申请日期2008年8月27日优先权日2008年8月27日发明者舒张,颖张,张文宏,森王,王洪海,苏晓迪,邵凌云,陈嘉臻申请人:复旦大学附属华山医院;复旦大学