049] 弃上清，向沉淀中加入GA(组织溶解液）200y1和蛋白酶K溶液20y1
[0050]I 56°C水浴12h，得到细胞悬液
[0051] 加TES(细胞裂解液PH为8,含溶菌酶浓度为20mg/ml) 200y1和
[0052] 5 % (W/V)SDS(沉淀剂）120y1
[0053]I 37°C水浴40min，沸水浴60min，冰上放置7min，得到混悬液
[0054]加 500y1PH4. 8 的NaAc(醋酸钢）和 100y1 0. 05mol/L(葡萄糖）
[00巧]I颠倒混匀，冰上放置20min分装成两管
[0056] 每管加入600y1苯酪/氯仿/异戊醇（25 :24 :1)
[0057]I 颠倒混匀，12000巧m，IOmin
[005引取上层水相至新的离屯、管
[0059] i
[0060] 加入等体积的氯仿/异戊醇（24 :1)
[0061]I 12000巧m，IOmim
[0062] 取上层水相至另一离屯、管
[0063] i
[0064] 加入Iml无水乙醇充分震荡，一15°C沉淀40min
[0065]I 12000巧m，IOmin
[0066] 倒去上清惊干3~5min，得到总DNA，加入50y ITE溶解DNA，将总DNA进行QPCR 扩增，然后进行凝胶电泳。
[0067]QPCR(实时巧光定量PCR)
[0068] 根据结核杆菌特有基因设计引物序列：
[0069]弓I物序列：前引物：5'
[0070] 后引物：5'
[0071] QPCR反应体系：
[0072]
[007引 目的基因扩增条件：94°c预变性3s
[0074]
[0075] 解剖感染时间分别为6周和8周的小鼠，得到其肺组织，分别按照实施例1的实验 方案操作，得到总DNA后进行QPCR，然后在3%琼脂慷凝胶上进行电泳，电泳图如图1所示。 QPCR扩增得到结核杆菌DNA的载量：小鼠感染6周的平均拷贝数为1〇5'23;小鼠感染8周的 平均拷贝数为1〇5'°8。
[0076] 图1中1、10泳道为Maker;2~5泳道为结核杆菌感染6周的小鼠提取肺组织的 总DNA用结核杆菌特有序列设计引物扩增目的基因所得产物的泳带；6~9泳道为结核杆 菌感染8周的小鼠提取肺组织的总DNA用结核杆菌特有序列设计引物扩增目的基因所得产 物的泳带；11~12泳道为液体培养的纯的结核杆菌提取的DNA用结核杆菌特有序列设计 引物扩增目的基因所得产物的泳带；13泳道为正常小鼠提取肺组织的DNA，用结核杆菌特 有序列设计引物扩增目的基因的泳带，未发现目的基因产物。从图1可看出，采用本发明提 供的提取方法，能够将小鼠肺组织中的结核杆菌提取出来，且提取率较高。
[0077] 本发明的技术方案在W下基金项目的支持下完成，基金项目：国家自然科学 基金资助项目（No:81060134 ;81371835 ;31560051 ;81560596);云南省自然基金项目 (No. 2010CD221，2011FB244，2012FB011，2013FZ057，2014FA011，2014FB001)。
【主权项】
1. 一种小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤（1)将小鼠肺组织匀浆离心后弃上清，加入GA缓冲液和蛋白酶K溶液后，50~ 56°C水浴3~12h，进行组织溶解得到细胞悬液； 步骤（2)细胞悬液中加入pH为8的TES缓冲液和5%的SDS溶液后，先置于温水浴中 40min，再置于沸水浴60min，最后在冰上放置5min，得到混悬液； 步骤（3)在混悬液中加入pH4. 8的醋酸钠溶液和0. 05mol/L的葡萄糖溶液，冰上放置 10~20min;然后加入苯酚/氯仿/异戊醇溶液提取，离心后取上层水相，上层水相中加入 氯仿/异戊醇提取，离心后，取上层水相，加入乙醇，充分震荡后，一 20°C沉淀30min，离心得 到沉淀物，沉淀物即为总DNA，总DNA进行PCR扩增得到小鼠肺组织中结核杆菌DNA的载量。2. 如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，步骤（1) 所述GA缓冲液、蛋白酶K溶液来源于细菌基因组DNA提取试剂盒，蛋白酶K溶液的浓度为 2mg/ml〇3. 如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，pH为8 的TES缓冲液中含有溶菌酶，溶菌酶的浓度为20mg/mL。4. 如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，步骤（2) 所述温水浴的温度为36~37°C。5. 如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，步骤（3) 所述苯酚/氯仿/异戊醇溶液中苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25 :24 :1，所述氯仿/异戊醇 溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24 :1。6. 如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述离心 的转速为12000r/min,离心时间为lOmin。7. 如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述 QPCR扩增采用的引物序列为： 前引物：5' 一AGAAGGCGTACTCGACCTGA- 3' 后引物：5' 一CTGAACCGGATCGATGTGTA- 3'。8. 如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，QPCR扩 增条件为：94°C预变性3s，94°C变性lmin，52°C退火30s，72°C末次延伸30s，变性与退火循 环35次。
【专利摘要】本发明公开了一种小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，包括以下步骤：步骤(1)将小鼠肺组织匀浆离心后弃上清，加GA缓冲液和蛋白酶K溶液后，水浴后进行组织溶解得到细胞悬液；步骤(2)细胞悬液中加TES缓冲液(含溶菌酶)和SDS溶液后，置于沸水浴60min，在冰上放置得到混悬液；步骤(3)在混悬液中加入醋酸钠溶液和葡萄糖溶液，冰上放置；然后加入苯酚/氯仿/异戊醇溶液提取，离心后取上层水相，上层水相中加入氯仿/异戊醇提取，离心后，取上层水相，加入乙醇，震荡后离心，弃上清，晾干后得到总DNA。本发明提供的提取方法提取率高、操作简便，得到的DNA的纯度和浓度均较高。
【IPC分类】C12R1/32, C12N15/10
【公开号】CN105219764
【申请号】CN201510749531
【发明人】柳爱华, 宝福凯, 杨佳儒, 徐翠平, 韩欣霖, 麻明彪, 彭芸, 陶律延
【申请人】昆明医科大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月6日