一种耐温型产谷氨酸菌株的选育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种耐温型产谷氨酸菌株的选育方法。
【背景技术】
[0002]谷氨酸是世界上第一大氨基酸产品。影响谷氨酸发酵水平的因素众多，其中温度是主要影响因素之一。传统谷氨酸生产菌的生长最适合温度为30?34°C，当夏季气温较高时则容易影响正常的谷氨酸发酵生产，特别是近几年我国夏季长期保持较高的温度，这甚至会导致生产企业被迫停产。因此，谷氨酸生产菌株的耐高温性能直接与生产效益相关。
[0003]耐温型谷氨酸生产菌株可以在相对较高的温度条件下进行持续的生产发酵，从而摆脱高温气候对于发酵生产的干扰，有利于满足现代大规模连续化生产的需求和生产成本的降低。然而，由于微生物基因及代谢流程的未知性以及诱变过程的随机性，传统的谷氨酸生产菌株的选育工作较为繁琐、低效，且偶然性较大。因此，采用科学的方法筛选提高谷氨酸生产菌株的耐温性能和生产能力是选育谷氨酸菌种亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于克服现有的谷氨酸菌株选育方法在菌种发酵时受高温影响大、生产效率低、菌株遗传性状不稳定的缺陷，提供了一种耐温型产谷氨酸菌株的选育方法。本发明的耐温型谷氨酸生产菌的选育方法综合了传统诱变育种、原生质体融合和DNA改组技术，筛选效率高。本发明的耐温型谷氨酸生产菌产酸生产能力高，菌株遗传性状较为稳定，且在较高温度下可进行持续的生产发酵，克服了高温气候对发酵生产的干扰，有利于控制生产成本，实现大规模连续化生产。
[0005]本发明提供了一种耐温型产谷氨酸菌株的选育方法，其包括如下步骤:
[0006](I)采用传统菌种选育技术对原始出发菌株的原生质体进行诱变处理，筛选得到耐温性增强且谷氨酸产酸能力提升的正突变株；
[0007](2)采用浓度为I?2g/L的溶菌酶对菌株酶解3?5h，得到谷氨酸生产菌原生质体；
[0008](3)采用UV照射25?30min，55?60°C加热灭活谷氨酸生产菌原生质体；
[0009](4)采用聚乙二醇(PEG6000)诱导谷氨酸生产菌原生质体融合；
[0010](5)通过对原始出发菌株多母本原生质体递进融合，结合多批次发酵稳定性测试选育得到耐温型谷氨酸生产菌。
[0011]步骤(I)中，所述的原始出发菌株较佳地为谷氨酸棒杆菌和/或黄色短杆菌。
[0012]步骤(I)中，所述的诱变处理为本领域常规操作，较佳地采用下述步骤:对处于对数生长中前期、菌龄为4?6h的菌体进行UV照射5?lOmin，浓度为1.0?2.0%的硫酸二乙酯处理20?40min, X射线照射25?45min为诱变方法进行原生质体诱变,所述的百分比为体积百分比。
[0013]步骤(I)中，所述的筛选较佳地为耐42°C高温筛选、显色平板筛选和/或38°C高温摇瓶筛选。
[0014]步骤(I)中，所述的正突变株较佳地为耐温性增强且在38°C温度下谷氨酸产量有相对提闻的菌株。
[0015]步骤(4)中，所述的聚乙二醇诱导谷氨酸生产菌原生质体融合的时间较佳地为25 ?35min。
[0016]本发明还提供了一种由上述方法制得的耐温型谷氨酸生产菌。
[0017]本发明的耐温型谷氨酸生产菌的最适发酵温度为36?41°C，初始谷氨酸的平均产量>50g/L，高于原始出发菌产量的2倍，同时具备较为稳定的遗传性状。
[0018]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0019]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0020]本发明的积极进步效果在于:
[0021 ] 1、本发明的耐温型谷氨酸生产菌的选育方法综合了传统诱变育种、原生质体融合和DNA改组技术，可快速获得具有显著正突变的菌株。
[0022]2、本发明的耐温型谷氨酸生产菌筛选效率较常规菌株筛选方法效率高，谷氨酸生产能力强，且菌株遗传性状较为稳定。
[0023]3、本发明的耐温型谷氨酸生产菌可以在较高的温度下进行持续的生产发酵，克服了高温气候对发酵生产的干扰，有利于控制生产成本，实现大规模连续化生产。
【具体实施方式】
[0024]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0025]实施例1
[0026](I)、通过对保存菌株的温度和产酸特性比较，挑选出I株谷氨酸棒杆菌和I株黄色短杆菌为原始出发菌；采用传统菌种选育技术对原始出发菌株的原生质体进行诱变处理，所述的诱变处理采用下述步骤:对对数生长中前期菌龄为4?6h的菌体进行UV照射5?1min, 1.0?2.0 %的硫酸二乙酯处理20?40min,X射线照射25?45min ;并通过高温筛选、显色平板筛选和38°C高温摇瓶筛选得到6株耐温性增强并在38°C温度下谷氨酸产量有相对提高的正突变株；
[0027](2)、采用浓度为lg/L的溶菌酶对菌株酶解5h，得到谷氨酸生产菌原生质体；
[0028](3)、采用UV照射30min，60°C加热灭活谷氨酸生产菌原生质体；
[0029](4)、采用PEG6000诱导谷氨酸生产菌原生质体融合30min ；
[0030](5)、通过对原始出发菌株多母本原生质体递进融合，结合发酵稳定性测试选育得到耐温型谷氨酸生产菌。
[0031]主要技术指标:发酵温度、谷氨酸产量
[0032]实施例1的耐温型谷氨酸生产菌在38°C下发酵产酸能力良好，在41°C高温条件下发酵产酸量较原始出发菌提高2倍，其谷氨酸平均产量为55.4g/L。由此可见，相对于原始出发菌，耐温型谷氨酸生产菌具有较高的发酵温度和较高的谷氨酸产量。
【主权项】
1.一种耐温型产谷氨酸菌株的选育方法，其特征在于:其包括如下步骤: (1)采用传统菌种选育技术对原始出发菌株的原生质体进行诱变处理，筛选得到耐温性增强且谷氨酸产酸能力提升的正突变株； (2)采用浓度为I?2g/L的溶菌酶对菌株酶解3?5h，得到谷氨酸生产菌原生质体； (3)采用UV照射25?30min，55?60°C加热灭活谷氨酸生产菌原生质体； (4)采用浓度为35被％聚乙二醇6000诱导谷氨酸生产菌原生质体融合25?35min； (5)通过对原始出发菌株多母本原生质体递进融合，结合发酵稳定性测试选育得到耐温型谷氨酸生产菌。2.如权利要求1所述的耐温型产谷氨酸菌株的选育方法，其特征在于:所述的原始出发菌株为谷氨酸棒杆菌和/或黄色短杆菌。3.如权利要求1所述的耐温型产谷氨酸菌株的选育方法，其特征在于:所述的诱变处理采用下述步骤:对处于对数生长中前期、菌龄为4?6h的菌体进行UV照射5?lOmin，浓度为1.0?2.0 %的硫酸二乙酯处理20?40min，X射线照射25?45min为诱变方法进行原生质体诱变，所述的百分比为体积百分比。4.如权利要求1所述的耐温型产谷氨酸菌株的选育方法，其特征在于:所述的筛选为耐42 °C高温筛选、显色平板筛选和38 °C高温摇瓶筛选。5.如权利要求1所述的耐温型产谷氨酸菌株的选育方法，其特征在于:所述的正突变株为耐温性增强且在38°C温度下谷氨酸产量有相对提高的菌株。6.如权利要求1所述的耐温型产谷氨酸菌株的选育方法，其特征在于:所述的聚乙二醇6000诱导谷氨酸生产菌原生质体融合的时间为25?35min。7.一种由权利要求1?6中任意一项所述的选育方法得到的耐温型产谷氨酸菌株。8.如权利要求7所述的耐温型产谷氨酸菌株，其特征在于:所述的耐温型谷氨酸生产菌的最适发酵温度为36?41°C，初始谷氨酸的平均产量>50g/L。
【专利摘要】本发明公开了一种耐温型产谷氨酸菌株的选育方法。该方法包括：(1)采用传统菌种选育技术对原始出发菌株进行诱变处理，筛选得到耐温性增强且谷氨酸产酸能力提升的正突变株；(2)采用浓度为1～2g/L的溶菌酶对菌株酶解3～5h，得到谷氨酸生产菌原生质体；(3)采用UV照射25～30min和55～60℃加热灭活；(4)采用聚乙二醇诱导融合；(5)对原始出发菌株多母本原生质体递进融合，结合多批次发酵稳定性测试选育得到耐温型谷氨酸生产菌。本发明的耐温型谷氨酸生产菌筛选效率高，产酸能力强，菌株遗传性状较为稳定，且在较高温度下可进行持续的生产发酵，克服了高温气候的干扰，有利于控制生产成本，实现大规模连续化生产。
【IPC分类】C12N15/03, C12N1/21, C12N13/00, C12R1/15, C12R1/13, C12N15/01
【公开号】CN105219761
【申请号】CN201410290119
【发明人】吴坚
【申请人】上海冠生园天厨调味品有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年6月24日