一种高产糖化酶工业生产菌株的选育方法

专利名称：一种高产糖化酶工业生产菌株的选育方法
技术领域：
本发明涉及一种通过基因工程技术与诱变育种技术，提高糖化酶工业生产 菌株产酶活力的方法，属于基因工程和发酵工程领域。
背景技术：
糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶(1，4-a-葡聚糖水解酶，EC.3.2丄3)，是由一系 列微生物分泌的、具有外切酶活性的胞外酶。它能从淀粉、糊精或糖原等碳水 化合物的非还原性末端水解a-l，4葡萄糖苷键释放P-D-葡萄糖，也能缓慢水解 (x-l,6葡萄糖苷键和a-l,3糖苷键释放葡萄糖。糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精、 葡萄糖浆的主要酶类，因此被广泛地应用于食品、医药、发酵等工业，具有很 高的商业价值，是我国产量最大的酶制剂产品之一。
在糖化酶菌种选育方面，获得糖化酶高产菌株主要有以下两条途径1.通 过传统的物理化学诱变来筛选糖化酶高产菌株;2.利用DNA重组技术构建优良 的工程菌株，如增加糖化酶基因的拷贝数，通过定向突变筛选蛋白酶、葡萄糖 苷转移酶缺陷株等(姚婷婷等，生物工程学报，2006)。
从自然界直接分离到的野生型菌株积累产物的能力往往很低，无法满足工 业生产的需要，这就要求我们对它们进行菌种改造，即育种。育种的手段主要 有定向培育、诱变育种、杂交育种、细胞融合和基因工程等育种技术。其中诱 变育种和基因工程育种是最为常用的两种技术。诱变育种是利用物理或化学诱 变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、 快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践 或科学研究用。当前发酵工业的高产菌株，许多都是通过诱变育种而大大提高 了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外，还可达到改善产品质量、扩大 品种和简化生产工艺等目的。诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点。 常用的诱变方法包括物理诱变和化学诱变。而低能离子束注入技术是上世纪80 年代首次用于水稻品种的改良，这一技术目前己广泛用于生物制品的诱变育种。 它是一种集物理化学效应于一体的综合诱变技术，能引起染色体的畸变，导致 DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变 或缺失，大幅度提高变异的频率。低能离子束注入诱变技术表现出对生物体生 理损伤小、突变谱广、突变频率高，并有一定的重复性和方向性的新特点。
基因工程育种是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗 传学的重要技术而发展起来的一门新兴应用科学。自20世纪末问世以来便受到了全世界的广泛关注，并得到了飞速发展，特别是在微生物分子育种方面取得 了巨大的成功，重组人胰岛素的上市就是第一个例证。随后又陆续应用基因工 程技术对各种微生物的性状进行了改造，使目标代谢产物的产量得到大幅提高， 并实现了规模化生产，如酶、维生素、氨基酸、激素、促红细胞生长素等。随 着生物化学、遗传学、分子生物学以及微生物相关组学的发展，微生物遗传育 种技术和方法不断得到拓展和创新，越来越多的优良菌种用于工业发酵生产中， 以满足人类日益增长的需求。
本发明结合基因工程和传统诱变的优点同时巧妙的避开了各自缺点从而获 得一种新的高效筛选糖化酶工业生产菌株突变株的方法。

发明内容
本发明的目的是提供一种糖化酶生产菌种的高效选育方法。
根据本发明针对高产糖化酶的工业生产菌株利用分子育种技术和传统诱变
技术相结合手段可以快捷地将糖化酶生产菌株的产糖化酶水平提高8%~58.7%。 糖化酶生产菌株指的是，能够合成重要工业产品如工业酶制剂，生物多聚体或 抗生素等，并且其合成水平已具有商业开发价值的黑曲霉菌株。
本发明的技术方案 一种高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，首先构建 重组质粒pPg^-Z/;^S将重组质粒pP^r/fy/经历"d III线性化后转化黑曲霉 F0410原生质体；用潮霉素hygromycin B筛选出转化子，命名为CICIMGAH14， 对CICIM GAH14进行物理诱变，再用更高浓度的潮霉素hygromycin B进行突 变株的筛选，获得高产糖化酶工业生产菌株；步骤如下
(1) 根据黑曲霉F0410的糖化酶基因启动子的DNA序列SEQIDNO: 1设 计引物，以含有糖化酶基因启动子的染色体DNA为模板，进行PCR扩增，得 到糖化酶基因启动子；
本发明所用的黑曲霉F0410为原始菌株，姚婷婷等，生物工程学报，2006 (4)公开。
(2) 将克隆载体pBlueScriptSK(-)刘大伟等，微生物学通报，2007 (5)
经SwflI限制酶作用后，与步骤(1)的糖化酶基因启动子在T4连接酶的作用下 反应过夜，得到连接产物；
(3) 将步骤(2)的连接产物转化宿主菌五.co//JM109感受态细胞徐敏 等，无锡轻工大学学报，2004 (4)，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆， 并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pSK-Pg^;
(4) 将步骤(3)所得的重组质粒pSK-P^4和质粒pRS303HTaxis & Knop, BioTechniques, 2006, 40: 73-77分别经5awHI、 Wcol双酶切后，胶回收813bp 的Pg^片段和5108bp的载体片段，用T4连接酶连接过夜，转化大肠杆菌JM109 感受态细胞，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pRS-Pg^;
(5) 将pRS303H采用TVcoI单酶切，胶回收357bp无启动子的/^/ziV77基 因，并将其插入pRS-Pgw的A^ I位点中，转化大肠杆菌JM109感受态细胞， 涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行 酶切验证，获得重组质粒pPgw-/^/;
(6) 将步骤(5)所得的重组质粒pPg^/fy/经州VKim线性化后，以原生 质体转化方法转化宿主细胞黑曲霉F0410，用100-200 ng/mL潮霉素筛选出转化 子，阳性转化子即为CICIMGAH14;
(7) 对CICIMGAH14进行传统物理诱变；
(8) 再用潮霉素进行突变株的筛选，在含200 2000ng/mL潮霉素的抗性平 板中进行突变株的筛选，获取高产糖化酶工业生产菌株，正突变率达到37.5%， 而正突变的菌株产糖化酶水平比黑曲霉F0410提高8Q/。 58.7。/。。
所述的高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，对CICIM GAH14进行传统物 理诱变，采用离子束诱变过程，步骤如下
(1) 将-7(TC冰箱的黑曲霉重组菌CICIM GAH14甘油管保藏物适当稀释涂 布TZ培养基，TZ培养基的组成为每升含有3g牛肉膏、15g蛋白胨、2g酵 母抽提物、2gNaCl、 15g淀粉、20g琼脂，pH 5.8， 34 。C培养72-120 h;从 TZ培养基平板上挑出单菌落划线于CD培养基，CD培养基组成为每升含有 NaN032g, K2HP04lg， KC10.5g， MgS04 0.5g， FeSO40.01g，蔗糖30g，琼脂 15g， 34。C培养72 120h;从CD平板上挖4 cm2的琼脂块放入种子培养基，其 培养基组成为每升含NaN03 2g， K2HP04lg， KC10.5g， MgS04 0.5g， FeS04 O.Olg，蔗糖30g， 34 。C静置培养96-144 h，三角瓶装液量60 mL/250 mL;
(2) 将步骤(1)所得的种子培养液采用玻璃珠对菌丝体悬液进行打散悬 浮处理，打散条件为向培养96-144h的菌悬液中无菌加入粒径为6~7mm的玻 璃珠15粒，130r/min， 34。C培养6 8h;离心收集菌体，用单层擦净纸过滤，得
到用于进行离子注入的原始菌体；
(3) 将步骤(2)所得的原始菌体细胞用1 mL质量浓度10%的甘油将菌 体洗至无菌空平皿，涂匀，以无菌风吹干，准备进行离子注入；以N"为注入离 子，注入能量为10 60Kev，注入剂量为(10-60) x2.6xl0131^/0!12进行脉冲式 注入，耙室真空度为l(T3Pa;离子注入完成后，用2mL无菌水洗脱，稀释后在 含200-2000 jLig/mL潮霉素的TZ抗性平板中进行突变株的筛选，培养条件与步 骤(1)中TZ平板相同；
(4) 将步骤(3)所获得的200 300个高潮霉素抗性突变株转接于TZ培养基 平板，34。C培养72 120h;从CD平板上挖4cn^的琼脂块放入种子培养基，34 °C 静置培养96 144h，三角瓶装液量60 mL/250 mL，在发酵培养基中接入8%种子液，发酵培养基组成为每升含15g棉籽粉、5g酵母膏、100g葡萄糖，pH5.5， 34°C、 220r/min摇床培养120 144h，三角瓶装液量50 mL/250 mL，发酵结束测 定发酵液糖化酶活力。
测定结果显示糖化酶水平提高的正突变率达到了37.5%以上，而正突变的菌 株中产糖化酶水平提高范围在8% 58.7%之间。
所述的高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，黑曲霉F0410改用黑曲霉、 米曲霉、米根霉的其他霉菌。
所述的高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，抗性基因/2/7/^77改用
fewMW、 /7eo或mrfAT72;对应的抗生素潮霉素hygromycin B改用G418 (Geneticin )、腐草霉素phleomycin或诺尔丝菌素nourseothricin。
所述的高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，黑曲霉F0410染色体中引入 了潮霉素抗性基因，潮霉素抗性基因由糖化酶启动子调控表达，含有潮霉素抗 性基因的重组质粒pP^r/^/随机整合入黑曲霉F0410染色体的糖化酶基因之 外任意位点。
所述的高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，对糖化酶生产菌株进行诱变， 采用等离子束诱变方法。
上述构建方法步骤(1)中所述的目的启动子序列不仅限于黑曲霉糖化酶基 因的启动子，也可替换为黑曲霉基因组中其他有应用价值或潜在应用价值酶的 编码基因的启动子，并通过该发明方法能提高该酶的产量。
上述构建方法步骤(4)中所述的质粒pRS303H携带含有潮霉素抗性基因
(/2p/ziV77，潮霉素磷酸转移酶基因)和丝状真菌基因终止子，并在抗性基因上
游可以插入外源启动子基因。
上述构建方法步骤(5)中所述的重组质粒pP^-7/;;/的特征为在潮霉素抗
性基因上游插入糖化酶基因的启动子。
上述构建方法步骤所用的酶切产物纯化可以采用PCR产物回收试剂盒或其 他分子克隆中常用的纯化方法。
上述所述的黑曲霉转化子为潮霉素抗性基因随机整合到宿主染色体上除糖 化酶基因位点外的其他任意位点，并且该基因的表达由糖化酶启动子控制调节。
上述所述的原生质体转化方法为通用的遗传转化方法，参见《工业微生物 实验手册》(诸葛健、王正祥编著，中国轻工业出版社，北京，1994)。
上述离子束诱变过程的步骤(2)中所述的甘油是作为保护剂而使用的，也 可以用其他性质相似的溶剂代替。
上述离子束诱变过程的步骤(2)中所述的打散悬浮处理，可以用玻璃珠， 也可以用其他机械力进行打散，目的是增加高能粒子注入的效率。
上述离子束诱变技术是作为诱变育种的一种方法。本发明所述的传统诱变包括物理诱变和化学诱变，较佳的是物理诱变，更佳的是离子束诱变。
上述离子束诱变过程中所述高潮霉素抗性突变株是指能在200~2000 pg/mL 潮霉素的TZ抗性平板中进行生长的黑曲霉菌落。
上述离子束诱变过程中所述正突变是指摇瓶发酵产糖化酶活力与黑曲霉 CICIMGAH14相比提高》8%的突变株。
上述离子束诱变过程中所述突变株的筛选包括一次筛选，也包括多次筛选。
本发明的创新之处在于建立了一个快速有效的对糖化酶工业生产菌株进 行诱变选育的方法。通过使用本发明方法，在进行高产糖化酶的工业生产菌株 中选育正突变率达到37.5%，并且诱变子酶活增幅能达到8% 58.7%。本方法不 仅适用于糖化酶生产菌株的选育，还适用于其它以丝状真菌为基础的工业生产 菌株的选育。


-
图l重组质粒pRS-Pg^/^/的物理图谱。
图2黑曲霉转化子Pg,^/fy/片段PCR扩增(l、？X)NA/i^I分子量标准，2、 PCR阳性对照(质粒)，3、 PCR阴性对照，4、 5PCR扩增重组转化子结果)。
图3诱变菌株摇瓶发酵实验(以GAH14糖化酶活力计为100%，菌株编号 1~13为诱变复筛菌株)。
具体实施例方式
以下结合附图，将糖化酶高产菌株-黑曲霉CICIM GAH14基因工程菌的构 建及其离子束诱变和筛选的具体过程描述如下 实施例1: pPg^-i^/重组质粒的构建
以黑曲霉F0410染色体为模板进行PCR扩增，上游引物为GP1: GACCTTCCATGGAAGTGACCTGC',下游引物为GP2: GGCATGCCATGG CTGAGGTGTAATGATGCTGG (下划线部分为TVcoI酶切位点)，得到含有糖化 酶基因启动子的DNA序列。
用SmaI酶切pBlueScriptSK(-)载体，37'C过夜反应；将酶切产物和PCR产 物回收纯化后，然后在T4连接酶作用下进行连接反应14h，得到连接产物。
将连接产物转化宿主菌Eco"JM109感受态细胞，挑选阳性克隆，通过酶切 和电泳确证成功构建重组质粒pSK-P^4。
采用Bamffl、 iVcoI双酶切胶回收质粒pSK-P一和质粒pRS303H，分别胶回 收813bp的Pg^片段和5108bp的载体片段，用T4连接酶连接过夜，转化宿主 菌￡. co/ZJM109感受态细胞，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行 培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pRS-Pg^。
将pRS303H采用iVc:oI单酶切，胶回收357bp片段，并将其插入pRS-Pg/^ 的A^I位点中，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选得到pRS-P^-场/，重组质粒pRS-Pg^/^/用五coRI酶切，得到大小为4786bp、 1040bp和452bp 片段，酶切的片段大小与预计的片段大小相符，表明成功构建了重组质粒
实施例2:黑曲霉F0410的原生质体转化
原生质体制备首先黑曲霉菌株在TZ培养基上34 'C培养96h;挑选标准 菌落划线CD固体培养基，34'C培养96h;从CD平板上取4cn^左右琼脂块放 入内含60mLCD液的250mL三角瓶中，34 。C培养72 144 h;收集菌丝体，1 mol/L山梨醇溶液洗一次；称取湿重，按1:10 (w/v)加入裂解酶液，30°C、 80 r/min酶解；血球计数板监测原生质体的形成数量，确定酶解时间；原生质体液 过滤；滤液4。C、 3200r/min离心10min，弃上清；分别用预冷的0.6 mol/LKCl 溶液、STC溶液洗漆沉淀，离心；原生质体沉淀重悬于适量STC溶液，置冰浴 备用。
原生质体转化和转化子鉴定将制备好的原生质体离心，弃上清，洗涤，
沉淀重悬于预冷的STC溶液，使浓度达到lxl07个/mL;取200 原生质体悬 液，加入约1~10吗的线性化质粒pRS-Pg/ari^/ (10 ^L体系)，用枪头轻轻 吹吸混匀，加入50pLPEG溶液，轻轻颠倒混匀，冰浴20 30min;取出后缓缓 加入lmLPEG溶液，室温放置20min;加入2mLSTC溶液，轻轻颠倒混匀； 将其与含有潮霉素(100 pg/mL)的再生培养基混匀后倒平板，34 'C培养5~6 天；挑取其中一株转化子进行PCR鉴定，以转化子染色体DNA为模板，分别 以3对寡核苷酸引物HI: ATGCGACGAAGATGTTACTGC和H2: AGGT CCTGTCCAGCCGAAAT(用于扩增 基因)，PHI :
ATGCGACGAAGATGTTACTGC和PH2: GGGAGTACATTGAGTGGC (用于扩 增Pgwi^g"片段基因)以及GL1: TACCTGGCGACCTATGACTATGGCAC和 GL2: GGTCGATTACAATCACAT GACTTGGC (用于扩增糖化酶基因g/"j)进 行PCR扩增鉴定。表明重组质粒成功整合到黑曲霉F0410的基因组中，命名该 转化子为CICIM GAH14。
实施例3:转化子CICIMGAH14的离子束诱变与高产菌株的选育 取经玻璃珠打散后的CICIM GAH14菌丝悬液，于室温、8000r/minxl0min 离心收集菌体,经单层擦净纸过滤用0.5 mL 10%甘油制成10S个/mL的菌丝悬液， 将0.3 0.5mL菌丝悬液于无菌平皿内涂均匀，在无菌状态下吹干，使其形成一 层菌膜，采用能量为10KeV的氮离子束，剂量为60x2.6xl013 W/cm2的条件进 行脉冲式注入，然后用lmL无菌水洗下处理过的菌膜，稀释四倍后，涂布于含 1200 pg/mL潮霉素及不含潮霉素的TZ培养平板中，34。C培养48 60h。在潮霉 素抗性平板上选取与不含潮霉素的TZ平板同时长出的菌落(菌落直径大，生长 旺盛)共80株进行摇瓶初筛(一株一瓶)。对获得酶活提高较显著(酶活提高幅度在8%以上)的菌株13株进行摇瓶复筛(一株三瓶)，最终获得的诱变株比 出发菌株酶活提高幅度在8%~58.7%， 80株高抗性突变株的酶活正突变率为 37.5%,负突变率为6.3% (产糖化酶能力增幅《-8°/。为负突变；》8%为正突变)。 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他在任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序 歹'J 表
<210> SEQIDNO:l <211> 927 <212> DNA <213> 黑曲霉F0410
<400> 1
gaccttccatggaagtgacctgctgcaggtgttctatgggatc^gcc^actatgcagc60
tagttctagccacacgtsctatctgagctttgtgtatacgctggatccgaactccaaccg120
g鹏gagtacattgagtggccgcagtggaagg肌tcgcggcagttgatgaatttcggagc180
gaacgacgccagtctccttacggatgatttccgcaacgggtcatcctgca240
gaataccgcggcgttccacatctgatgccattggcggaggggtccggacggtcaggaact300
tagccttatg￡Lgatg￡L￡ltg3tggacgtgtctggcctcggatggggatcat360
gatagt已ctagccatattaatg鄉ggcatataccacgcgttggacctgcgttatagctt420
cccgttagttatagtELCCatcgttataccagcc犯tcaagtcaccacgcacgaccgggga480
cggcgaatccccgggaattgcatcccaggccagtg鄉ccagcgsttggc540
cacctctcca3ggC3C郷gccattctgcagcgctggtgg3ttC3tCgC3atttcccccg600
gcccggcccgacaccgctataggctggttctCCC3C￡LCC3tcggagattcgtcgcctaat660
gtctcgtccgttcacaagctga卿gcttgaatggcg卿tgtctctgcaggeLattcei已g720
ctagatgctaagcgatattgtgtgttgatgcatgtgcttcttccttcagc780
ttcccctcgtgcgaatgaggtttggctataaMtgaagtggttggtcggggttccgtgag840
gtgctgaagtgcttcctcccttttagacgcaactgagEigcctgagcttcatccccagcat900
cattacacctcagcaccatggcatgcc927
<210> SEQIDNO:2
GP1: GACCTTCC ATGGAAGTGACCTGC'，
GP2: GGCATGCCATGG CTGAGGTGTAATGATGCTGG
<210> SEQIDN。3
HI: ATGCGACGAAGATGTTACTGC
H2: AGGT CCTGTCCAGCCGAAAT<210> SEQIDNO:4
PH1: ATGCGACGAAGATGTTACTGC
PH2: GGGAGTACATTGAGTGGC
<210> SEQIDNO:5
GL1: TACCTGGCGACCTATGACTATGGCAC GL2: GGTCGATTACAATCACAT GACTTGGC
权利要求
1、一种高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，其特征是首先构建重组质粒pPglaA-HygR；将重组质粒pPglaA-HygR经Hind III线性化后转化黑曲霉F0410原生质体；用潮霉素hygromycin B筛选出转化子，命名为CICIM GAH14；对CICIMGAH14进行物理诱变，再用更高浓度的潮霉素hygromycin B进行突变株的筛选，获得高产糖化酶工业生产菌株；步骤如下(1)根据黑曲霉F0410的糖化酶基因启动子的DNA序列SEQ ID NO1设计引物，以含有糖化酶基因启动子的染色体DNA为模板，进行PCR扩增，得到糖化酶基因启动子；(2)将克隆载体pBlueScript SK(-)经SmaI限制酶作用后，与步骤(1)的糖化酶基因启动子在T4连接酶的作用下反应过夜，得到连接产物；(3)将步骤(2)的连接产物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pSK-PglaA；(4)将步骤(3)所得的重组质粒pSK-PglaA和质粒pRS303H分别经BamHI、NcoI双酶切后，胶回收813bp的PglaA片段和5108bp的载体片段，用T4连接酶连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pRS-PglaA；(5)将pRS303H采用NcoI单酶切，胶回收357bp无启动子的hphNT1基因，并将其插入pRS-PglaA的NcoI位点中，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pPglaA-HygR；(6)将步骤(5)所得的重组质粒pPglaA-HygR经HindIII线性化后，以原生质体转化方法转化宿主细胞黑曲霉F0410，用100～200μg/mL潮霉素筛选出转化子，阳性转化子即为CICIM GAH14；(7)对CICIM GAH14进行传统物理诱变；(8)再用潮霉素进行突变株的筛选，在含200～2000μg/mL潮霉素的抗性平板中进行突变株的筛选，获取高产糖化酶工业生产菌株，正突变率达到37.5％，而正突变的菌株产糖化酶水平比黑曲霉F0410提高8％～58.7％。
2、根据权利要求1所述的高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，其特征是 对CICIMGAH14进行传统物理诱变步骤如下(1)将-7(TC冰箱的黑曲霉重组菌CICIMGAH14甘油管保藏物适当稀释涂 布TZ培养基，TZ培养基的组成为每升含有3g牛肉膏、15g蛋白胨、2g酵母抽提物、2gNaCl、 15g淀粉、20g琼脂，pH 5.8， 34 。C培养72~120 h;从 TZ培养基平板上挑出单菌落划线于CD培养基，CD培养基组成为每升含有 NaN032g， K2HP04lg， KC10.5g， MgS04 0.5g， FeSO40.01g，蔗糖30g，琼脂 15g， 34'C培养72-120 h;从CD平板上挖4 cm2的琼脂块放入种子培养基，其 培养基组成为每升含NaN03 2g， K2HP04lg， KC10.5g， MgS04 0.5g， FeS04 O.Olg，蔗糖30g， 34 "C静置培养96-144 h，三角瓶装液量60 mL/250 mL;(2) 将步骤(1)所得的种子培养液采用玻璃珠对菌丝体悬液进行打散悬 浮处理，打散条件为向培养96-144h的菌悬液中无菌加入粒径为6 7mm的玻 璃珠15粒，130r/min， 34'C培养6 8h;离心收集菌体，用单层擦净纸过滤，得 到用于进行离子注入的原始菌体；(3) 将步骤(2)所得的原始菌体细胞用1 mL质量浓度10%的甘油将菌 体洗至无菌空平皿，涂匀，以无菌风吹干，准备进行离子注入；以W为注入离 子，注入能量为10 60Kev，注入剂量为(10~60) x2.6xl013 NVcm2进行脉冲式 注入，靶室真空度为10-3Pa;离子注入完成后，用2mL无菌水洗脱。
3、 根据权利要求1所述的高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，其特征是 黑曲霉F0410改用黑曲霉、米曲霉、米根霉的其他霉菌。
4、 根据权利要求1所述的高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，其特征是 抗性基因/^MT7改用姑"MY"4、y7eo或"^7V:T2;对应的抗生素潮霉素hygromycin B改用G418 (Geneticin⑧)、腐草霉素phleomycin或诺尔丝菌素nourseothricin。
5. 根据权利要求1所述的高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，其特征是， 黑曲霉F0410染色体中引入了潮霉素抗性基因，潮霉素抗性基因由糖化酶启动 子调控表达，含有潮霉素抗性基因的重组质粒pPg^-Z^/随机整合入黑曲霉 F0410染色体的糖化酶基因之外任意位点。
6. 根据权利要求1所述的高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，其特征是 对糖化酶生产菌株进行诱变，采用等离子束诱变方法。
全文摘要
一种高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，属于遗传工程和发酵工程领域。本发明首先构建了以糖化酶基因启动子调控潮霉素抗性基因表达的重组质粒pP_glaA-Hyg^R；将重组质粒pP_glaA-Hyg^R经Hind III线性化后转化黑曲霉F0410原生质体，使糖化酶基因启动子调控的潮霉素抗性基因随机整合入黑曲霉基因组中；用潮霉素hygromycin B筛选出转化子，获得抗潮霉素的重组黑曲霉工程菌，命名为CICIM GAH14；对CICIM GAH14采用传统诱变技术进行物理诱变，再用更高浓度的潮霉素hygromycin B进行突变株的筛选，获得高产糖化酶工业生产菌株。在所获得的高抗性菌株中，正突变率达到37.5％，而正突变的菌株产糖化酶水平比原始黑曲霉菌株提高8％～58.7％。
文档编号C12N15/01GK101532028SQ20091003068
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月21日 优先权日2009年4月21日
发明者王正祥, 石贵阳 申请人:江南大学